Определение действительных эталонных генов для генной экспрессии исследований рака желудка человека путем обратной транскрипции-кПЦР

Определение действительных эталонных генов для генной экспрессии исследований рака желудка человека путем обратной транскрипции-кПЦР
Аннотация
Справочная информация
обратной транскрипции количественной ПЦР в реальном времени (RT-КПЦР) представляет собой мощный метод анализа экспрессии генов. Уровни экспрессии гена-мишени, как правило, нормализованное к последовательно выраженной эталонным гена также известный в качестве внутреннего стандарта, в том же образце. Тем не менее, много усилий не было затрачено до сих пор в поисках эталонных генов, пригодных для исследования рака желудка с использованием RT-КПЦР, хотя выбор оптимальных эталонных генов имеет решающее значение для интерпретации результатов.
Методы
Мы начислению пригодность шести возможных опорных генов, бета-актина (ACTB), glyceraldehydes-3-фосфат-дегидрогеназы (GAPDH), гипоксантин-фосфорибозилтрансферазы 1 (HPRT1), бета-2-микроглобулина (B2M), рибосомальной субъединицей L29 (RPL29) и 18S рибосомной РНК (18S рРНК) в 20 нормальных и опухолевых желудка пар ткани больных раком желудка и 6 линий клеток рака желудка, с помощью RT-КПЦР. . Используя стабильность экспрессии анализа с использованием NormFinder и geNorm алгоритмов мы определили порядок выполнения этих эталонных генов и их значения вариации

Результаты Данное исследование RT-КПЦР показал, что статистически значимыми (р
&л; 0,05 ) различия в уровнях экспрессии HPRT1 и 18S рРНК в 'обычный-' против 'тканей желудка опухоль. Стабильность анализа с помощью geNorm предложить B2M-GAPDH, как лучшая комбинация опорного гена для "клеточных линий рака желудка"; RPL29-HPRT1, для "всех тканей желудка '; и ACTB-18S рРНК, для "всех клеточных линий желудка и тканей. NormFinder также определили В2т как лучший эталонного гена "линии клеток рака желудка», RPL29-В2т для "всех тканей желудка» и 18S рРНК-ACTB для 'всех клеток желудка линий и тканей ». Сравнения нормализованной экспрессии гена-мишени, GPNMB, показали различную интерпретацию экспрессии гена-мишени зависит от лучшего единого контрольного гена или комбинации.
Заключение
Данное исследование подтверждено RPL29 и RPL29-В2т как лучших одиночных опорных генов и комбинация для RT-КПЦР анализа "всех тканей желудка», и В2т и В2т-GAPDH как лучший одного контрольного гена и комбинации, для «клеточных линий рака желудка". Использование этих проверенных эталонных генов должно обеспечить более точную интерпретацию дифференциальных экспрессии генов на уровне транскрипции при раке желудка.
Справочная информация
обратной транскрипции количественной ПЦР в реальном времени (RT-КПЦР) является мощным инструментом для проверки достоверности наблюдаемые различия экспрессии генов, из-за его большей чувствительности и специфичности. В традиционных исследованиях по экспрессии генов, а 'опорный ген ", также называемый" внутренний стандарт "или" ген домашнего хозяйства "используется для нормализации. Выражение бета-актина (ACTB) и glyceraldehydes-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH), используемый в большинстве исследований [1], было сообщено меняться в зависимости от условий эксперимента [2] и клинического состояния исследуемой ткани (например,
астма), что делает эти гены непригодными в качестве внутренних стандартов для использования в нормализации экспрессии гена [3]. . Таким образом, срок действия эталонного гена выбран для статистического анализа имеет решающее значение для избежания опасности неверной интерпретации данных и недействительных выводы [4]
Было высказано мнение о том, что по крайней мере три соображения следует принимать во внимание при выборе эталонного гена: 1) неизменность его экспрессии на протяжении вмешательства, 2) его эффективность амплификации и 3) его изобилие, которое должно быть таким же, из интересующих генов [5]. Кроме того, в целях обеспечения актуальности, точности и правильности интерпретации RT-КПЦР, рекомендуется точные указания по RT-КПЦР MIQE (минимальный объем информации для публикации количественного ПЦР в реальном времени эксперимента) следует придерживаться [6] , Существует несколько инструментов для статистического анализа, такие как NormFinder [7], geNorm [8], BestKeeper [9] были разработаны, чтобы помочь в выборе соответствующих эталонных генов. Эти инструменты оценки изменений в экспрессии ряда генов потенциальных опорных и предложить какой эталонный ген (ы) подходит для нормализации данных экспрессии генов в данном исследовании.
Рак желудка является четвертым наиболее распространенным видом рака во всем мире, Отчетного 934,000 случаев в 2002 году [10]. Выживаемость от рака желудка беден, так как пациенты часто диагностируется только после того, как болезнь уже значительно [11] расширенный, что делает раннее выявление очень важно. Скрининг с целью раннего выявления включает в себя эндоскопическое исследование. Для того, чтобы подтвердить наличие рака, биопсий взяты из подозреваемых тканей и подвергали к RT-кПЦР, чтобы подтвердить аномальную экспрессию генов, связанных с раком. Но соответствующие ссылки на гены должны быть определены для достоверного сравнения между выражениями нормальных генов по сравнению с раком. Эталонные гены были описаны для исследований РТ-КПЦР в различных раковых заболеваний других тканей [1, 12-21]. Однако, как представляется, нет консенсуса в отношении эталонных генов для экспрессии генов в исследованиях рака желудка. Поэтому мы искали PubMed с сетчатым терминами "рак желудка", "в реальном времени", и "ПЦР". При оценке 115 статей, опубликованных в период с мая 2007 года по ноябрь 2009 года, мы обнаружили, что GAPDH (53 случая; 46,1%) и ACTB (41 случаев; 35,7%) были наиболее часто используемые ссылки на гены в желудочном исследованиях рака; с последующим 18S рРНК (8 случаев; 7,0%), бета-2-микроглобулина (В2т; 3 случая; 2,6%), гипоксантин фосфорибозил трансферазы 1 (HPRT1; 2cases; 1,7%), TATA связывающий белок (ТВР; 1 случай; 0,9 %), и бета-тубулина (Тубб; 1 случай; 0,9%). В пяти случаях (4,3%), внешний стандартная кривая была использована для абсолютной количественной оценки (AQ) вместо нормированного значения в качестве ссылки гена.
Настоящее исследование было разработано таким образом, чтобы найти лучшие эталонные гены для экспрессии генов в исследованиях рака желудка , В данном исследовании мы исследовали эталонные гены пять, которые были наиболее часто используемые гены в исследованиях рака желудка (ACTB, GAPDH, В2т, 18S рРНК и HPRT1) и для сравнения, RPL29, эталонного гена, используемого в других исследованиях рака в "линии, не желудочные раковые клетки ',' желудочные клеточные линии рака предстательной ',' нормальные ткани желудка" и "ткани желудка опухоль" (таблица 1). Для того, чтобы выбрать наиболее подходящий эталонный ген из приведенного выше списка, мы сравнили выражения гликопротеина НМБ (GPNMB), наш ген-мишень, с теми, в вышеназванного списка возможных "ссылки" genes.Table 1 Потенциальные ссылки на гены оцениваемых это исследование.
символ Gene

GenBank, No.

Gene имя

Genomic локализации

Описание

ACTB
NM_001101
бета-актина
7p15-12
цитоскелета структурный белок
GAPDH
NM_002046
глицеральдегид-3- фосфатдегидрогеназы
12p13
оксидоредуктаза в гликолиза и глюконеогенеза
HPRT1
NM_000194
Гипоксантин фосфорибозилтрансферазу 1
XQ26
Метаболический спасательное пуринов
B2M
NM_004048 <бр> Бета-2-микроглобулина
15q21.1
Бета-цепь молекул главного комплекса гистосовместимости класса I
18S рРНК
NR_003286
18S рибосомальной РНК
22p12
Рибосома субъединица
RPL29
NM_00992
рибосомного белка L29
3p21.3-p21.2
структурной составляющей рибосомы
GPNMB
NM_001005340
гликопротеин (трансмембранный) НМБ
7p15

• В Silico анализе карциномы желудка последовательного анализа библиотек экспрессии генов показывает различные …
• Адъювантной химио-излучения для аденокарциномы желудка: институциональный experience