Tunnistaminen voimassa viite geenien geeniekspression tutkimuksia ihmisen mahasyöpä käänteistranskriptiolla-qPCR

tunnistaminen voimassa viite geenien geeniekspression tutkimuksia ihmisen mahasyöpä käänteistranskriptiolla-qPCR
Abstract
tausta
Käänteinen transkriptio määrällinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (RT-qPCR) on tehokas menetelmä analyysin geenin ilmentymisen. Kohdegeenin ilmentyminen tasot ovat yleensä normalisoidaan jatkuvasti ilmaissut viitegeenin tunnetaan myös sisäisenä standardina, samasta näytteestä. Kuitenkin paljon vaivaa ei nähty toistaiseksi etsittäessä viite geenien tutkimukseen soveltuvia mahasyöpä käyttäen RT-qPCR, vaikka valinta optimaalinen viite geenien on kriittinen tulkinnan kannalta. Tool Menetelmät
Arvioimme soveltuvuus kuusi mahdollista viite geenejä, beeta-aktiini (ACTB), glyceraldehydes-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH), hypoksantiinifosforibosyylitransferaasi 1 (HPRT1), beeta-2-mikroglobuliini (B2M), ribosomialayksikköä L29 (RPL29) ja 18S ribosomi-RNA (18S rRNA) 20 normaalin ja kasvaimen vatsan kudosta paria mahasyöpä potilaita ja 6 mahasyöpä solulinjoissa, RT-qPCR. Käyttävät ilmaisun vakautta analyyseistä NormFinder ja geNorm algoritmit päätimme järjestystä suorituskykyä näiden viite geenejä ja niiden vaihtelua arvoja.
Tulokset
RT-qPCR tutkimus osoitti, että on olemassa tilastollisesti merkitsevä (p
< 0,05 ) erot ekspressiotasot HPRT1 ja 18S rRNA in "normaalilla" vastaan ​​"kasvain mahassa kudoksiin. Vakaus analyyseja geNorm ehdottaa B2M-GAPDH, kuten parhaiten viitteenä geeni yhdistelmä "mahasyöpä solulinjoissa '; RPL29-HPRT1, sillä "kaikki mahan kudoksissa"; ja ACTB-18S rRNA, sillä "kaikki vatsaan solulinjoissa ja kudoksissa. NormFinder myös tunnistettu B2M parhaana viittaus geeni "mahasyöpä solulinjat", RPL29-B2M "Kaikkia mahan kudoksissa", ja 18S rRNA-ACTB "Kaikkia vatsaan solulinjoissa ja kudoksissa. Vertailut normalisoitujen ilmentymisen kohdegeenin, GPNMB, osoitti erilaisen tulkinnan kohdegeenin ilmentymisen riippuu paras yksittäinen viite geeni tai yhdistelmä.
Päätelmät
tutkimus validoitu RPL29 ja RPL29-B2M kuin paras yksittäinen viittaus geenejä ja yhdistelmä, RT-qPCR analyysi "kaikkien mahan kudoksissa", ja B2M ja B2M-GAPDH kuin paras yksittäinen viittaus geenin ja yhdistelmä, sillä "mahasyöpä solulinjat". Käyttää näitä validoitu viite geenit pitäisi tarjota enemmän tarkka tulkinta ero geeniekspressioiden klo transkriptio tasolla mahasyöpä.
Tausta
Käänteinen transkriptio kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (RT-qPCR) on tehokas työkalu validoida Havaittu geeniekspressio eroja, koska sen suurempi herkkyys ja spesifisyys. Perinteisessä geeniekspression tutkimuksissa "viittaus geeni", jota kutsutaan myös "sisäiseksi standardiksi" tai "taloudenpito geeni" käytetään normalisointia. Ilmaisu beeta-aktiini (ACTB) ja glyceraldehydes-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH), joita käytetään suurimmassa osassa tutkimuksia [1], on raportoitu vaihdella koeolosuhteiden [2] ja kliinisen tilan kudoksen tutkittu (esim
astma), jolloin nämä geenit sovi sisäisinä standardeina käytettäväksi normalisointia geenin ilmentymisen [3]. Siten pätevyyttä viitteen geenin valittu tilastollinen analyysi on ratkaisevan tärkeää välttää vaara tulkitaan väärin tietojen ja virheellisiä johtopäätöksiä [4].
Ehdotettiin, että ainakin kolme näkökohdat olisi otettava huomioon valitessaan viite geeni: 1) pysyvyyden sen ekspression koko intervention, 2) sen vahvistus tehokkuus ja 3) sen runsaus, joka olisi samanlainen kuin kiinnostuksen kohteena olevien geenien [5]. Lisäksi asianmukaisuutta, tarkkuutta ja oikeellisuutta tulkintoja RT-qPCR, on suositeltavaa, että tarkat ohjeet RT-qPCR MIQE (Vähintään Tietoa julkaiseminen Quantitative Real-Time PCR Experiment) tulee noudattaa [6] . Useita työkaluja tilastollista analyysiä kuten NormFinder [7], geNorm [8], BestKeeper [9] on kehitetty auttamaan valinnassa sopiva viittaus geenejä. Nämä työkalut arvioida vaihtelut ilmaus useita mahdollisia viite geenien ja ehdottaa joka viite geeni (t) sopii normalisointia geeniekspression data tietyllä tutkimuksessa.
Mahasyöpä on neljänneksi yleisin syöpä maailmassa, jossa raportoitu 934000 tapauksissa vuonna 2002 [10]. Survival mahasyöpä on huono, koska potilaat ovat usein diagnosoidaan vasta tauti on jo edennyt merkittävästi [11], mikä tekee varhaisen havaitsemisen erittäin tärkeä. Seulonta jonka tavoitteena on varhainen toteaminen edellyttää tähystystutki-. Vahvista syövän läsnäolon, koepaloja otetaan epäillään kudoksista ja altistettiin RT-qPCR vahvistaa epänormaali ilmentyminen syöpään liittyvät geenit. Mutta mukaan viittaus geenit on tunnistettu voimassa vertailua ilmauksia normaalin verrattuna syövän geenejä. Viite geenejä on kuvattu RT-qPCR tutkimukset erilaisten syöpien muiden kudosten [1, 12-21]. Kuitenkin ei näytä olevan ole yksimielisyyttä viite geenejä geeniekspression tutkimuksia mahasyöpä. Siksi etsitään PubMed kanssa MeSH termejä "mahasyövässä", "reaaliaikainen" ja "PCR". Sen arviointi 115 julkaistut artikkelit toukokuu 2007 marraskuussa 2009 huomasimme, että GAPDH (53 tapausta; 46,1%) ja ACTB (41 tapausta; 35,7%) oli yleisimmin käytetty viite geenien mahasyövän tutkimuksissa; jonka jälkeen 18S rRNA (8 tapausta; 7,0%), beeta-2-mikroglobuliinin (B2M, 3 tapausta, 2,6%), hypoksantiinifosforibosyylitransferaasi 1 (HPRT1, 2cases; 1,7%), TATA sitova proteiini (TBP, 1 tapaus; 0,9 %), ja beeta-tubuliinia (TUBB, 1 tapauksessa, 0,9%). Viidessä tapauksessa (4,3%), ulkoisten standardikäyrä käytettiin absoluuttisia (AQ) sijasta normalisoitu arvo suhteessa geeni.
Tämä tutkimus on siksi suunniteltu löytämään parhaat viittaus geenien geeniekspression tutkimuksia mahasyöpä . Tässä tutkimuksessa tutkimme viiden viittaus geenejä, joita on useimmin käytetty geenien mahasyöpä tutkimuksissa (ACTB, GAPDH, B2M, 18S rRNA ja HPRT1) ja vertailun, RPL29 viittaus geeniä käytetään muissa syöpään tutkimukset, jotka "ei-mahasyöpä solulinjat", "mahasyöpä solulinjat", "normaali mahan kudoksissa" ja "kasvain mahan kudoksissa (taulukko 1). Jotta voitaisiin valita sopivin viittaus geenin edellä olevasta luettelosta, vertasimme ilmentymiä glykoproteiinin NMB (GPNMB), meidän kohdegeenin kanssa edellä nimetty luettelo mahdollisista "viite" genes.Table 1 Mahdollinen viittaus geenejä arvioitu tässä tutkimuksessa.
Gene symboli

GenBank
Gene nimi
Perimän lokalisointi

Kuvaus
ACTB
NM_001101
Beta-aktiini
7p15-12
tukirangan rakenteellinen proteiini
GAPDH
NM_002046
Glyseraldehydi-3- fosfaattidehydrogenaasin
12p13
oksidoreduktaasi glykolyysissä ja glukoneogeneesin
HPRT1
NM_000194
hypoksantiinifosforibosyylitransferaasi 1
Xq26
metabolinen pelastaa puriinien
B2M
NM_004048
Beta-2-mikroglobuliinin
15q21.1
Beta-ketjun major histocompatibility complex class I molekyylien
18S rRNA
NR_003286
18S ribosomaalisen RNA
22p12
Ribosomi alayksikön
RPL29
NM_00992
ribosomaalinen proteiini L29
3p21.3-p21.2
Rakenteelliset ainesosana ribosomien
GPNMB
NM_001005340
glykoproteiini (transmembraaninen) NMB
7p15 || C
Osallisena kasvun viivästyminen ja vähentää metastaattisen mahdollisten Tool menetelmät
solulinjat ja ihmisen kudoksista
Saimme solulinjoista American Type Culture collection (Manassas, VA, USA) tai korea Cell Line Bank (Seoul, Korea): Kuusi vatsa kasvainsolulinjoja (SNU-216, SNU-638, SNU-719, AGS, MKN-28 ja KATOIII), viisi ei-mahasyöpä solulinjoissa (JIMT1, SK-BR-3, SNU-C5, A549, ja U87), ja kaksi normaalia ihmisen solulinjoja (HDF, HMEC). Kaikki solulinjat pidettiin nimetty media (Mediatech, Manassas, VA, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (Invitrogen, Calsbard, CA, USA). Kaksikymmentä pareina normaalin ja kasvaimen vatsa kudokset saatiin endoskooppinen resektio aikana tutkimisen potilaille, jotka antoivat tietoisen suostumuksen (taulukko 2). Kaikki menetelmät suoritettiin protokollien mukaisesti hyväksymien Institutional Review Board of National Cancer Center ja seuraa ilmoitus Helsinki.Table 2 Ominaisuudet potilaiden edellyttäen mahasyöpä kudoksiin.


potilaiden lukumäärä
potilaiden lukumäärä
Yhteensä
20
Mies
14
Female
6
Ikä diagnoosin (vuotta) B alueella
34-77
keskiarvo ± SD
60,8 ± 12,1
Disease Stage †
kasvain vaiheessa
T1
8
T2
8
T3
4
Node vaiheessa
N0
8
N1
6
N2
2
N3
4
† Stage luokitus noudattaa TNM luokittelujärjestelmän mukaan International Union Against Cancer (UICC) [27].
RNA ja cDNA-synteesi
Mahasyöpä kudosnäytteet säilötty RNAlater liuokseen (Qiagen, Hilden, Saksa), kunnes käyttää RNA. Kokonais-RNA uutettiin TRIzol valtionhoitaja mukaisesti valmistajan protokollan (Invitrogen), ja käsiteltiin DNaseI on RNeasy Mini-pylvästä (Qiagen) jäljelle jääneen genomista DNA: ta. Pitoisuus ja A 260/280 suhde puhdistettua RNA mitattiin Nanodrop ND-1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA), ja laatu arvioitiin Agilent 2100 Bioanalyzer käyttäen RNA 6000 Nano Kit (Agilent Technologies, Santa Clara , CA, USA). Kaksi ug poly-dT-alukkeella kokonais-RNA (random heksameeri pohjustettu yhteensä RNA 18S rRNA vahvistus) on käänteistranskriptoituneet kanssa Transcriptor käänteiskopioijaentsyymi- mukaan valmistajan protokollan (Roche Applied Science, Mannheim, Saksa).
Käänteinen transkriptio määrällinen real -Aika PCR (RT-qPCR)
aiempien raporttien, otimme alukkeita amplikonin pituus alle 200 emäsparia, paitsi ACTB, toimia johdonmukaisesti monistustehokkuudessa (taulukko 3). Alukkeet monistamiseen GPNMB suunnitellut Primer 3 ohjelmisto http: //frodo. Wi. Mit. Edu /Primer3 /. Kvantitoimme mRNA ilmentymistä 6 viite geenien ja yksi kohdegeenin RT-qPCR vaalealla-Cycler 480 II (Roche Applied Science). RT-qPCR-reaktio suoritettiin käyttäen 5 ng laimennettua cDNA: ta, 5 pmol kutakin aluketta (taulukko 3), 5 ui 2 x Light-Cycler Fast DNA MasterPlus SYBR Green I: n lopullisessa tilavuudessa 10 ui. PCR-syklin olosuhteet oli asetettu seuraavasti: pre-inkuboimalla 5 minuutin ajan 95 ° C: ssa, jota seuraa 45 sykliä, kunkin syklin mukaan lukien 15 sekuntia 95 ° C: ssa, 30 sekuntia 58 ° C: ssa, ja 30 sekuntia 72 ° C: ssa. Suhteellinen kvantitointi suoritettiin Light Cycler Software 1.5.0 (Roche Applied Science), joka perustuu "rajanylityspaikkaa" (Cp) arvo, joka määrittelee jakson numero, jolla fluoresenssi signaali näytteen ylittää taustafluoresenssitasoja value.Table 3 pohjustajat kuusi viite geenit ja kohdegeenin.
Gene
Forward pohjamaali [5 '→ 3']
päinvastaisessa järjestyksessä [5 '→ 3']
ankkurointi
eksonit
Amplicon
koko
Spanning on
genome

Amplification
efficiency

Reference

ACTB
CATCGAGCACGGCATCGTCA
TAGCACAGCCTGGATAGCAAC
Exon 3
eksoni 4
211 emäsparin
652 emäsparin
1,971
[28]
GAPDH
TGCACCACCAACTGCTTA
GGATGCAGGGATGATGTTC
eksoni 7
eksoni 8
177 emäsparin
370 emäsparin
1,999
[29]
HPRT1
AGACTTTGCTTTCCTTGGTCAG
TCAAGGGCATATCCTACAACAA
eksoni 6
eksoni 8
151 emäsparin
5120 emäsparin
1,949
[30]
B2M
ACTGAATTCACCCCCACTGA
CCTCCATGATGCTGCTTACA
eksonissa 2
eksoni 4
114 emäsparin
741 emäsparin
1,924
[ ,,,0],28]
18S rRNA
GTAACCCGTTGAACCCCATT
CCATCCAATCGGTAGTAGCG
NA1
151 emäsparin
151 emäsparin
2.000
[31]
RPL29
GGCGTTGTTGACCCTATTTC
GTGTGTGGTGTGGTTCTTGG
eksoni 1
eksonissa 2
120 emäsparin
507 emäsparin
1,937
[16]
GPNMB
TGCGTCCGTGAGAATTCA
TGTGCTCCCTCATGTAAGCA
eksonissa 1
eksoni 2
144 emäsparin
6522 emäsparin
1.945
talo design2
1. Ei saatavilla
2. Alukkeet suunnitellut Primer 3 ihmisen virhepariutumisesta kirjaston seulonta vaihtoehtoja.
Data analyysit
Tilastolliset analyysit suoritettiin GraphPad Prism V4.03 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Normaalius arvioitiin mukaan Kolmogorov-Smirnov (KS), D'Agostino-Pearson (DAP), ja Shapiro-Wilk (SW) testit. Jakeluun ei-normaali jaettu ryhmiin, epäparametrinen Mann-Whitneyn U-testi ja Wilcoxonin testi tehtiin. P-arvot p
< 0,05 katsottiin tilastollisesti merkittäviksi. Käytimme NormFinder V12 [7] ja geNorm ™ V3.44 [8] ohjelmisto määrittää ilmaisun arvot kuuden ehdokkaan viite geenejä.
Tulokset
RNA laadun arviointi
arvioimme laatua RNA käytetään lähtö- materiaali useilla tavoilla. 260/280 suhde mitattuna Nanodrop oli 2,08 ± 0,09 (keskiarvo ± SD) vahvistaa, että RNA oli puhdasta ja proteiini-vapaa. RNA laatu raportoidaan RNA eheyden numero (RIN) RNA 6000 Nano LabChip viljellyille solulinjan oli 9,7 ± 0,2 (keskiarvo ± SD), ja 7,4 ± 1,0 potilaan kudosnäytteistä. Sillä pareittain mahan kudosnäytteiden, emme löytäneet mitään tilastollisesti merkitsevää eroa joko A 260/280 suhde normaalin (2,05 ± 0,03) ja kasvaimen (2,04 ± 0,05) kudoksiin (pariksi Studentin t
- testi p
-arvo = 0,214) tai RIN arvot välillä normaalin (7,2 ± 0,5) ja kasvaimen (7,5 ± 1,4) kudosnäyte ryhmät (pariksi Studentin t
-testi p
-arvo = 0.340).
Expression valikoimia ehdokas viite geenien ja kohdegeenin
Suoritimme RT-qPCR ja määritetty vahvistusta tehokkuutta kunkin alukesettiä (taulukko 3). Ilmaisu Kuuden ehdokkaan viittauksen geenien suhteen Cp arvojen syntyvät RT-qPCR, näytetään kuviossa 1 sirontakuvaajaan. Solulinjat osoittivat spektrin Cp-arvot, jotka edustavat laajaa eroa ilmaisun, joka vaihtelee välillä 14,56 ja 34,89, riippuen viite käytetty geeni. ACTB ja GAPDH osoittivat runsaimmin ilmaisua sekä "mahasyöpä solulinjat" ja "ei-mahasyöpä solulinjoissa", mutta toisin HPRT1 osoitti alimman ekspressiotason. Ilmaisu kohdegeenin GPNMB in Cp arvot vaihtelivat 27,7-32,1 solulinjoissa. Normaalisuus arviointi osoitti HPRT1 in 'mahasyöpä solulinjat "ja 18S rRNA in" ei-vatsa solulinjat "ei normaalisti jaettu KS-testi. Niinpä sovellettu epäparametrinen Mann-Whitneyn U-testi vertaillaan muuta kuin normaali jakautunut verraton ryhmiä, ja se osoitti merkittäviä eroja ilmauksia GAPDH (p
= 0,014) ja B2M (p
= 0,035) välillä "mahasyöpä solulinjat" ja "ei-mahasyöpä solulinjat". Kuva 1 Ilmentymistasot kuusi ehdokasta viite geenien havaittiin RT-qPCR. Rajanylityspaikka (Cp) arvot "mahasyöpä solulinjat" ja "ei-mahasyöpä solulinjat", "normaali mahan kudoksissa" ja "kasvain vatsassa kudosten" ovat edustettuina ekspressiotason. Rekki keskellä hajallaan paikkoja osoittaa keskimääräisen ekspressiotason. Mitä pienempi Cp arvo, sitä suurempi on geenien ilmentymistä.
Ihmisen mahan kudoksissa osoitti myös suuria eroja Cp arvot vaihtelevat 13,3-29,4 (kuvio 1), jossa on korkein ilmentymä B2M ja 18S rRNA ja alin ilmaus HPRT1 . Ilmaisu kohdegeenin GPNMB sisään Cp vaihtelivat 28,5-34,7 vatsassa kudoksissa. Vuonna normaaliuden testissä ACTB, HPRT1, ja 18S rRNA in "normaali mahan kudoksissa" ryhmä ja kaikki geenit paitsi GAPDH "kasvain vatsassa kudosten" seuraa normaalijakaumaa KS-testi. HPRT1, B2M ja RPL29 kasvaimen vatsassa kudoksissa läpäisi tavanomaisiin DAP- ja SW-testeissä. Täten verrattaessa ei-normaali jaettu pariksi ryhmiä, suoritimme epäparametrinen Wilcoxonin testi. Merkittävä ilme lisäys normaalista kasvain mahassa kudoksiin (p
< 0,05) havaittiin HPRT1 (p
= 0,011) ja 18S rRNA (p
= 0,021), mutta ei ACTB (p
= 0,058), GAPDH (p
= 0,918), B2M (p
= 0,740), tai RPL29 (p
= 0,208).
Expression vakautta ehdokas viite geenien
jotta tunnistaa vakain viittaus geenit, olemme analysoineet ekspressiotietojen kanssa geNorm ja NormFinder. Olemme luokiteltu solulinjat ja kudoksissa seuraaviin ryhmiin - "ei-mahasyöpä solulinjat", "mahasyöpä solulinjat", "normaali mahan kudoksissa", "kasvain mahassa kudoksiin", "kaikki mahan kudoksissa (normaali + kasvain mahassa kudoksia ) "ja" kaikki mahasyöpä solulinjoissa ja kudoksissa. Soveltaminen geNorm kanssa oletusrajoitusta (M < 1,5) sulkea pois epävakaa viite geenit ja jäljellä minimaalinen määrä sopivia viite geenien kunkin ryhmän lopussa (kuva 2). Määrittämään optimaalinen määrä geenejä tarvittava geometrinen keskiarvo normalisoinnin vertasimme pareittain vaihtelu (V n /V n + 1) lasketaan geNorm kunkin yhdistelmän peräkkäinen normalisointikertoimia (NF n ja NF n + 1) ja kaikki näytteet ryhmään. Käytimme oletus kynnys (0,15) jaksotuksen [8], jonka alapuolella sisällyttämistä lisäviitearvoja geenien ei ole välttämätöntä. Kaikissa ryhmissä arvioitiin tässä tutkimuksessa, parittainen vaihtelut ovat jo kynnyksen alapuolella (kuvio 3), joten se on tulkittava, että käytetään enemmän kuin kaksi optimaalista geenit eivät ole hyödyllisiä tarkkuuden parantamiseksi. Toisaalta löysimme korrelaatio varianssi ja kulmakerroin M-arvo käyrä. Kun kyseessä on "ei-mahasyöpä solulinjat", lisäys GAPDH kolmantena geenin kahta optimaalisesti odotettavissa geenejä B2M-RPL29 lisääntyy 0,0218 vakaus arvosta M, jossa on pareittain varianssi V 2 /3 0,032. Tällä tavalla kerroin korrelaatio pareittain vaihtelun ja väliksi M-arvoon kunkin väli tässä ryhmässä oli päättänyt olla r
2 = 0,956. For "mahasyöpä solulinjoissa," korkeamman V 4/5 (0,018) ja V 5/6 (0,028) arvoja kuin V 2/3 tai V 3/4 miksi korkean pisteytyksen HPRT1 ja ACTB geenien olisi jätettävä. Korrelaatiokerroin oli r
2 = 0,895. Korrelaatiokertoimet in "normaali mahan kudoksissa", "kasvain mahassa kudosten" ja "kaikki mahan kudoksissa" olivat r
2 = 0,971, 0,996 ja 0,960, tässä järjestyksessä. In "kaikki mahasyöpä solulinjoissa ja kudoksissa", se osoitti vähemmän korrelaatio (r
2 = 0,718). Kuvio 2 Keskimääräiset ilmaisun vakautta (M) kuudesta ehdokas viite geenejä geNorm analyysejä. Expression vakautta piirrettiin in "ei-mahasyöpä solulinjoissa '(A)," mahasyöpä solulinjojen "(B)," normaali mahan kudoksissa "(C), kasvain vatsan kudoksista" (D), "kaikki vatsaan kudoksissa" (E) ja "kaikki mahasyöpä solulinjaa ja kudosten" (F). Vähiten vakaa viite geeni (korkeampi M-arvo) on vasemmalla ja vakain yhdistelmä (alempi M-arvo) on oikealla tontin. Vakain viite geenit päätelty vaiheittain syrjäytymisen vähiten vakaa geenejä.
Kuva 3 Pair-viisasta variaatioanalyysi kuuden ehdokkaan viite geenejä. Pareittain vaihtelun arvon (Vn /n + 1) oli peräisin geNorm analyysi. Optimaalinen määrä geenejä arvioitiin vertaamalla Vn /n + 1. Kaikki vaihtelu oli alle oletusraja 0,15.
Myös soveltaa NormFinder ohjelmaan samassa tietomääriä ja laskea vakautta arvoja. Kuten on esitetty taulukossa 4, alin vakautta arvo osoittaa kaikkein stabiilin ekspression ja olemme sijoittui geenien vastaavasti. Paras yksittäinen viittaus geenin kullekin ryhmälle on seuraava; "Non-mahasyöpä solulinjat" - GAPDH (0,036), "mahasyöpä solulinjat" - B2M (0,014), "normaali mahan kudoksissa" - RPL29 (0,028), "kasvain mahassa kudosten" - RPL29 (0,028), "kaikki vatsa kudokset "- RPL29 (0,032) ja" kaikki vatsa solulinjoissa ja kudoksissa "- ACTB (0,029). Sijoitus viittaus geenien "mahasyöpä solulinjat" oli sama kuin siitä geNorm analyysi, mutta oli hieman erilainen muihin luokkiin. NormFinder myös arvioi paras yhdistelmä viittaus geenien sub-ryhmää siinä "kaikissa vatsassa kudosten '- RPL29-B2M (0,005) ja" kaikki vatsassa solulinjoissa ja kudoksissa "- 18S rRNA-B2M (0,013) .table 4 Ranking on ehdokas yksittäinen viittaus geenit perustuvat niiden vakauden arvot lasketaan NormFinder.
Non-mahasyöpä solulinjoissa
mahasyöpä solulinjoissa
Normaali mahan kudoksissa
Kasvain mahassa kudosten
Kaikki mahan kudoksissa

Kaikki vatsa solulinjat + kudoksissa
Gene tärkeysjärjestyksessä
Stability arvo
Gene tärkeysjärjestyksessä
Stability arvo
Gene tärkeysjärjestyksessä
Stability arvo
Gene tärkeysjärjestyksessä
Stability arvo
Gene tärkeysjärjestyksessä
Stability arvo

Gene tärkeysjärjestyksessä
Stability value

GAPDH
0.036
B2M
0.014
RPL29
0.028
RPL29
0.028
RPL29
0.032
ACTB
0.029
RPL29
0.052
GAPDH
0.021
B2M
0.035
B2M
0.039
B2M
0.041
HPRT1
0.038
B2M
0.053
RPL29
0.029
HPRT1
0.038
HPRT1
0.042
HPRT1
0.044
RPL29
0.068
HPRT1
0.110
18S rRNA
0,036
ACTB
0,043
ACTB
0,065
ACTB
0,052
18S rRNA
0,071
18S rRNA
0.112
ACTB
0,060
18S rRNA
0,062
18S rRNA
0,067
18S rRNA
0.055
GAPDH
0.082
ACTB
0.143
HPRT1
0.115
GAPDH
0.140
GAPDH
0.147
GAPDH
0.140
B2M
0.084
Target geeniekspressioprofiilien vaikuttavat viittaamalla geenejä käytetään normalisointia
arvioimiseksi viitteen geenien todellinen tilanne, päätimme "mahasyöpä solulinjat", "kaikki mahan kudoksissa" ja "kaikki vatsa solulinjoissa ja kudoksissa", koska syöpätutkijoita "keskittyvät verrataan geenien ilmentymisen normaaleissa ja tuumorikudoksissa sekä mahalaukun alkunsa syöpäsolun linjat in vitro -tutkimuksessa. Käytimme yhden viite geenien ja yhdistelmien suhteellisen kvantifioinnin (RQ) on GPNMB
tavoitteeksi geeni. GPNMB on läpäisevä glykoproteiini ja sillä on osuuskunta rooli p53 ja sytokiinivälitteisiä transkriptiotekijöitä eriytetty immuunisolujen [22] ja rintasyövän [23]. RQ on GPNMB lausekkeen jokaisella kuudella yksittäinen viite geenien ja B2M-GAPDH yhdistelmä "mahasyöpä solulinjoissa" verrattiin (kuva 4). Rqs by B2M, GAPDH yksittäisinä viitteenä geeni ja B2M-GAPDH joka ennustettiin olevan kaikkein optimaalinen yhdistelmä viittaus geenien "mahasyöpä solulinjat" by geNorm osoitti vastaavat erittäin matala kuviot (kuvio 4A, B ja 4G). Vertailun vuoksi RQ jonka RPL29 johti näennäisesti kohonnut ekspressio SNU-216, mutta vähentää ilmentymistä SNU-719-solulinjoja (kuvio 4C). RQ by 18S rRNA osoitti myös kohonnut ilmentyminen SNU-216, mutta alensi ilmentymistä MKN-28 (kuvio 4D). RQ by ACTB ja HPRT1 osoitti erittäin vähäinen ekspressio SNU-719 ja KATOIII (kuvio 4E ja 4F). Kuva 4 suhteellinen kvantitointi GPNMB ilmentymisen mahasyöpä solulinjoissa riippuu eri viite geenejä. GPNMB ilme kuudessa mahasyöpä solulinjoissa normalisoitiin kuusi single viittaamalla geenien ja paras yhdistelmä johdettu geNorm (keskiarvo ± SD); normalisoitu B2M (A), jonka GAPDH (B), jonka RPL29 (C), jonka 18S rRNA (D), jonka ACTB (E), HPRT1 (F) ja geometrinen keskiarvo B2M-GAPDH yhdistelmä (G).
ero GPNMB RQ välillä normaalin ja kasvaimen vatsa kudoksissa oli potilaan riippuvainen. RQ on yleisempää joissakin kasvaimissa mutta päinvastainen toisissa. RQ normalisoitu kunkin kuuden yksittäinen viittaus geeni ei näytä täsmälleen samoja kuvio. Mikäli normalisoinnin mukaan RPL29 joka ennustettiin kuin vakain yksittäinen viittaus geenin NormFinder ja vakain yhdistettynä HPRT1 vuonna geNorm, korkea-matala kuvio RQ ero normaalin ja kasvaimen (kuva 5A) oli samankaltainen RQ by HPRT1 vaikka oli eroa kolmella potilaalla (kuvio 5B). RQ by B2M (kuvio 5c) ja 18S rRNA (kuva 5d) osoitti erilaista kuvion korkealle rankattu yksi viittaus geenejä enemmän potilaita. With ACTB (kuvio 5E) GAPDH (kuvio 5F), ero tuli suurempi; oli eroja 35% kaikista potilaista. RQ normalisoitu geometriset keskiarvot RPL29-HPRT1 yhdistelmää geNorm (kuvio 5G) ja RPL29-B2M peräisin NormFinder (kuvio 5H) osoitti samanlaista mallia. Kun yleinen fold muutos (kasvain /Normaali) verrattiin, RQ on GPNMB mukaan B2M (T /N = 2,46 ×, pariksi t
-testi p
= 0,017) ja RPL29-B2M (T /N = 2,08 ×, p
= 0,025) osoitti merkittävää kasvua normaalista kasvaimen vatsaan kudoksiin. RQ by RPL29 (T /N = 2,23 x, p
= 0,071), HPRT1 (T /N = 1,34 x, p
= 0,258), ACTB (T /N = 1,60 x, p
= 0,395), 18S rRNA (T /N = 1,36 x, p
= 0,527) ja RPL29-HPRT1 (T /N = 1,76 x, p
= 0,086) myös osoitti yhä GPNMB ilmentymistä kasvain mahassa kudoksissa mutta se ei ollut tilastollisesti merkitsevä. Vertailun se osoitti vastakkaiseen suuntaan ilmaisun ero (T /N = 0,75 x, p
= 0,637) mukaan GAPDH. Tämä viittaa siihen, että GAPDH-ilmentyminen kasvainkudoksessa mahan kudoksissa ovat erittäin koholla verrattuna muihin viite geenejä. Nämä tulokset viittaavat myös siihen, että RQ tiedot kohdegeenin voidaan tulkita eri tavoin riippuen viite geenejä käytetään normalisointia. Kuva 5 suhteellinen kvantitointi GPNMB ilmentymistä normaalissa ja kasvaimen vatsassa kudosten riippuu eri viite geenejä. GPNMB ilmentyminen mahasyöpä kudoksissa (pylväs: Normaali, avoin baari: kasvain) normalisoitiin kuusi single viittaamalla geenien ja kaksi yhdistelmät johdettu geNorm ja NormFinder (keskiarvo ± SD); normalisoitu RPL29 (A), jonka HPRT1 (B), jonka B2M (C), jonka 18S rRNA (D), jonka ACTB (E), GAPDH (F), geometrinen keskiarvo RPL29-HPRT1 (G) ja RPL29-B2M (H).
sillä "kaikki mahasyöpä solulinjoissa ja kudoksissa", NormFinder ja geNorm ennustettu 18S rRNA-B2M ja 18S rRNA-ACTB paras yhdistelmä. Rakenteessa GPNMB RQ jonka geometrinen keskiarvo näistä yhdistelmistä oli samanlainen niiden välillä. GPNMB rqs välillä "mahasyöpä solulinjat" ja "kaikki mahan kudoksissa" voitaisiin verrata sisällä samalla alueella, jossa 18S rRNA-ACTB, mutta siellä oli 1 log järjestyksen erotus 18S rRNA-B2M yhdistelmä. Patterns of RQ "mahasyöpä solulinjoissa (kuvio 6A, 6B) olivat samankaltaisia ​​RQ by B2M-GAPDH (Kuva 4G), mutta RQ on" kaikki mahan kudoksissa "by 18S rRNA-ACTB (kuvio 6B) oli erilainen ( Kuvio 5G, 5H). Vaikuttaa siltä, ​​että huomattavasti 18S rRNA ilmentyminen kasvaimen vatsassa kudoksissa (kuvio 1) voi vaikuttaa tähän tulokseen. Näin ollen, vaikka nämä yhdistelmät ennustaa paras, ne eivät ole sopivia tietojen tulkinnassa. Kuva 6 suhteellinen kvantitointi GPNMB ilmaisun altaassa kaikkien mahasyöpä solulinjoissa ja kudoksissa riippuu eri yhdistelmiä viite geenejä. GPNMB ilmentyminen mahasyöpä solulinjoissa ja mahan kudoksissa (pylväs: Normaali, avoin baari: kasvain) normalisoitiin kaksi yhdistelmät johdettu geNorm ja NormFinder (keskiarvo ± SD); normalisoitu by 18S rRNA-ACTB in mahasyöpä solulinjoissa (A) ja mahan kudoksissa (C) ja normalisoitu 18S rRNA-B2M vatsassa tasyöpäsolulinja (B) ja mahan kudoksissa (D).
Keskustelu
Differential geenien ilmentyminen syövässä tunnistaa transcriptome tutkimus osoittaa, että tiettyjä geenejä voidaan kasvaimien syntyyn liittyvien ja syövän metastaasia. RT-qPCR on kestävä ja erityinen menetelmä validointi identiteetin kandidaattigeenien mahasyöpä, koska se havaitsee jopa hyvin heikkoja signaaleja erittäin pieniä määriä koepala näytteitä, jos potilas on varhaisessa vaiheessa syöpä. Kuitenkin jos asianmukaisia ​​viittaus geenien, saadut tiedot ovat avoin kysymys, joka johtaa väärään tulkintaan. Ennen tätä tutkimusta, yksikään vahvistettu viite-geeni on tunnistettu "mahasyöpä solulinja" tai "mahasyöpä kudos", mutta ACTB ja GAPDH on käytetty useimmin asti ilman huomioon niiden epäjohdonmukainen ilmaisut eri kokeellisia asetuksia ja kliinisissä tiloissa . Tutkimme lisäksi ACTB ja GAPDH, neljä muuta viittaus geenejä, HPRT1, RPL29, 18S rRNA ja B2M jotka on arvioitu referenssinä geenien viimeaikaiset tutkimukset muiden ihmisten syöpiin.
On ilmeistä, että valitsemalla sopiva alukesarjan on tärkeä lähtökohta saada tarkkoja tuloksia. Mietimme seuraavat kohdat valinnassa alukkeita. Ensin hyväksytään alukesarjoista jotka raportoitiin aiemmin olla tai suunniteltu hallussaan amplikonin pituus noin 200 emäsparia. Toiseksi, kaikki alukesarjat edellytettiin ulottuvat ainakin kahden vierekkäisen eksonia, lukuun ottamatta 18S rRNA-geenin, joka ei ole mRNA. Edellä mainitut kaksi pistettä, jotka liittyvät monistuksen tehokkuus. On välttämätöntä, että viittaus geenin ja kohdegeenin ylläpitää samanlainen monistustehokkuudessa [13]. Amplikoni pituus liittyy läheisesti monistustehokkuudessa [24]. Joten voisi odottaa samanlainen kannattavuuttaan amplikonin samanlaisia ​​pituuden ja suurempi tehokkuus peräisin lyhyemmällä amplikonin. Hyöty lyhyempiä amplikonin, 70-250 emäsparia, RT-qPCR on se, että vahvistus on "riippumaton" RNA laadun [25]. Vahvistus tehokkuus vaikuttaa myös gDNA saastuminen, koska kilpailevan sitoutumisen alukkeita toimii rajoittava tekijä aiheuttaa laskua monistuksen tehokkuus [13]. Tässä yhteydessä DNaseI hoito aikana RNA puhdistaminen on tärkeää välttää monistaminen jäljellä gDNA, mutta se ei ehkä ole täysin tehokas. Siksi meidän toinen näkökohta auttaa havaitsemaan mahdollinen saastuminen gDNA eri amplikonin kokoja. Olemme vahvistaneet, että kukin eteenpäin ja taaksepäin aluketta ankkuroitu eri eksonia mukaan BLAT hakuja ihmisen geeniperimän ja ettei Amplified tuotetta saastuttamasta gDNA laajennettu amplikonin pituus (taulukko 2). Lisäksi meillä on myös varmistettu korkean laadun RNA, lähtöaineen, useilla tavoilla. Olemme myös suorittaneet kokeita kolmena kappaleena jokaista geeniä ja jokainen näyte.
Koska kehitys qPCR useita tilasto kehitettiin tunnistamaan optimaaliset viite geenejä. Valitsimme geNorm ja NormFinder analysoida vakautta kuuden viite geenejä olemme tutkineet. GeNorm Ohjelma laskee M-arvot perustuvat keskimääräiseen pareittain vaihtelua tietyn geenin verrattuna kaikkiin muihin tutkittu ehdokas viite geenejä ja sijoittuu niitä [8]. Vertailun NormFinder hyväksyy strategia, jota kutsutaan "malli lähestymistavasta arvio ilmaisun vaihtelu" [7].

• In silico analyysi mahakarsinooman Serial analyysi Gene Expression kirjastojen paljastaa eri liittyviä profiileja etnisyys
• Adjuvantti Kemoterapia kanssa mahalaukun adenokarsinoomaa: institutionaalinen kokemus