Azonosítása érvényes referencia gének génexpressziós vizsgálatokban a humán gyomorrák reverz transzkripciós qPCR

azonosítása érvényes referencia gének génexpressziós vizsgálatokban a humán gyomorrák reverz transzkripció-qPCR
Abstract
alapon
mennyiségét reverz transzkripciós kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakció (RT-qPCR) van egy erős módszer elemzéséhez génexpressziót. Cél gén expressziós szintek általában normalizáltuk egy következetesen kifejezve referencia gén néven is ismert belső standard, ugyanabban a mintában. Azonban sok erőfeszítést nem tettek, így messze a keresést referencia gének alkalmasak a tanulmány a gyomorrák RT-qPCR, bár válogatott optimális referencia gének kritikus az eredmények értelmezése. Katalógusa Módszerek katalógusa Megvizsgáltuk alkalmasságának hat lehetséges referencia gének, a béta-aktin (ACTB), gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH), a hipoxantin foszforibozil-transzferáz 1 (HPRT1), a béta-2-mikroglobulin (B2M), riboszomális alegység L29 (RPL29) és 18S riboszomális RNS (18S rRNS) 20 normális és tumoros gyomor szöveti pár gyomor rákos betegek és a 6. gyomor rákos sejtvonalak, RT-qPCR. Foglalkoztató kifejezés stabilitás analízisek NormFinder és geNorm algoritmusok határozzák meg a sorrendben a teljesítés az említett referencia-géneket és ezek változása értékeket. Katalógusa Eredmények
RT-qPCR tanulmány kimutatta, hogy vannak olyan statisztikailag szignifikáns (p katalógusa < 0,05 ) különbségek a expressziós szintjét HPRT1 és 18S rRNS-in 'normál- "versus" tumor gyomor szövetek ". A stabilitási elemzéseket, geNorm sugallják B2M-GAPDH, mint a legjobb referencia gén kombináció "gyomor rákos sejtvonalak '; RPL29-HPRT1, az "összes gyomor szövetek; és ACTB-18S rRNS, az "összes gyomor sejtvonalak és szövetek." NormFinder is azonosított B2M a legjobb referencia gént "gyomor rákos sejtvonalak ', RPL29-B2M az" összes gyomor szövetek ", és a 18S rRNS-ACTB az" összes gyomor sejtvonalak és szövetek. " Az összehasonlítások normalizált expressziójának a célgén, GPNMB mutatott különböző értelmezése célgén expresszióját függ legjobb egyetlen referencia gén vagy kombinációban.
Következtetés
Ez a tanulmány validált RPL29 és RPL29-B2M, mint a legjobb egyetlen referencia gének és kombináció, az RT-qPCR elemzését "minden gyomor szövetek", és B2M és B2M-GAPDH a legjobb egy referencia gén kombinációja, a "gyomor rákos sejtvonalak." Ha ezeket az érvényesített referencia gének gondoskodnia kell pontos értelmezését eltérés génexpressziók a transzkripció szintjén gyomorrák. Katalógusa alapon
Reverz transzkripció kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakció (RT-qPCR) egy hatékony eszköz hitelesítése megfigyelt génexpressziós különbségek, mert a nagyobb érzékenység és specificitás. A hagyományos gén expressziós vizsgálatok, "referencia gén" is nevezett "belső standard" vagy "háztartási gén" kifejezés a normalizálás. A kifejezés a béta-aktin (ACTB) és gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH), használják a tanulmányok többsége [1], jelentették, hogy változik a kísérleti körülmények [2] és a klinikai állapot a szövet vizsgált (pl
asztma), így ezek a gének nem megfelelő belső standardként való alkalmazásra normalizálása génexpresszió [3]. Így az érvényességét a referencia gén választott statisztikai elemzés elengedhetetlen a veszély elkerülésére félremagyarázza adatok és érvénytelen következtetések [4].
Azt javasolták, hogy legalább három szempontokat kell figyelembe venni a választott referencia gén: 1) állandóságának expressziójának egész beavatkozás, 2) annak amplifikáció hatékonyságát és 3) a bőség, amely hasonlónak kell lennie, hogy a jelentőséggel bíró gének [5]. Ezen túlmenően, annak érdekében, relevanciáját, pontosságát és helyességét értelmezései RT-qPCR, ajánlott, hogy a pontos iránymutatásokat RT-qPCR MIQE (minimális információ közzététele kvantitatív real-time PCR-kísérlet) be kell tartani [6] . Számos eszköz a statisztikai elemzés céljából, például NormFinder [7], geNorm [8], BestKeeper [9] fejlesztettek ki, hogy segítsen a választott megfelelő referencia gének. Ezek az eszközök értékeli a variációk a kifejezés a számos potenciális referencia gének és arra utalnak, amely referencia gén (ek) alkalmas normalizálására génexpressziós adatok egy adott vizsgálatban.
Gyomorrák a negyedik leggyakoribb rák világszerte, egy jelentett 934.000 esetben 2002-ben [10]. Túlélési gyomorrák gyenge, mivel a betegek gyakran diagnosztizálják csak miután a betegség már előrehaladott jelentősen [11], ami a korai felismerés nagyon fontos. Screening célzó korai felismerés jár endoszkópos vizsgálat. Jelenlétének megerősítésére a rák, biopsziák veszik a feltételezett szövetek és vetjük alá az RT-qPCR megerősíteni abnormális expressziója rákkal kapcsolatos gének. De megfelelő referencia gének azonosítását az érvényes összehasonlítását kifejezései normál versus rák géneket. Referencia géneket is leírtak az RT-qPCR tanulmányok különböző rákokban más szövetek [1, 12-21]. Azonban úgy tűnik, hogy nincs egyetértés referencia gének génexpressziós vizsgálatok gyomorrák. Ezért keresett PubMed hálós feltételek "gyomorrák", "valós idejű", és "PCR". Annak értékelésére 115 cikket publikált 2007 májusa 2009 novemberében azt találtuk, hogy GAPDH (53 eset; 46,1%) és ACTB (41 eset; 35,7%) voltak a leggyakrabban használt referencia gének gyomorrák tanulmányok; majd 18S rRNS (8 eset; 7,0%), a béta-2-mikroglobulin (B2M; 3 esetben; 2,6%), a hipoxantin foszforibozil-transzferáz 1 (HPRT1; 2cases; 1,7%), a TATA-kötő fehérjét (TBP; 1 eset; 0,9 %), és béta-tubulin (TUBB; 1 eset; 0,9%). Öt esetben (4,3%), külső standard görbét használtunk abszolút mennyiségi (AQ) helyett normalizált érték referenciaként gén.
A jelen tanulmány született tehát, célja, hogy megtalálja a legjobb referencia gének génexpressziós vizsgálatokban gyomorrák . Ebben a vizsgálatban vizsgáltuk a öt referencia géneket, amelyeket a leggyakrabban használt gének gyomorrák tanulmányok (ACTB, GAPDH, B2M, 18S rRNS és HPRT1), és az összehasonlítás, RPL29, egy referencia gén használatos más rák vizsgálatokban, 'nem-gyomor rákos sejtvonalak "," gyomor rákos sejtvonalak "," normál gyomor szövetek "és" daganat gyomor szövetek "(1. táblázat). Annak érdekében, hogy a lehető legmegfelelőbb referencia gén a fenti listából, összehasonlítottuk a megnyilvánulásai glikoprotein NMB (GPNMB), a megcélzott gén, azokkal a fent nevezett lista a lehetséges "referencia" genes.Table 1 Lehetséges referencia gének értékelték ez a tanulmány. katalógusa Gene szimbólum

GenBank nyilvántartási szám: Matton Gene név Matton Genomikai lokalizáció
Leírás Matton ACTB katalógusa NM_001101 katalógusa béta-aktin katalógusa 7p15-12 katalógusa citoszkeletális szerkezeti fehérje katalógusa GAPDH katalógusa NM_002046 katalógusa glicerin-aldehid-3- foszfát-dehidrogenáz katalógusa 12p13 katalógusa oxidoreduktáz a glikolízis és a glükoneogenezist katalógusa HPRT1 katalógusa NM_000194 katalógusa hipoxantin foszforibozil transzferáz 1 katalógusa Xq26 katalógusa Metabolikus salvage purinszintézistől katalógusa B2M katalógusa NM_004048
a béta-2-mikroglobulin katalógusa 15q21.1 katalógusa béta-lánc fő hisztokompatibilitási komplex I. osztályú molekulák katalógusa 18S rRNS katalógusa NR_003286 katalógusa 18S riboszóma RNS katalógusa 22p12 katalógusa riboszóma alegység
RPL29 katalógusa NM_00992 katalógusa riboszóma fehérje L29
3p21.3-p21.2 katalógusa strukturális összetevője riboszóma katalógusa GPNMB katalógusa NM_001005340 katalógusa glikoprotein (transzmembrán) nmb katalógusa 7p15 || C
részt növekedés késleltetése és csökkentése metasztatikus potenciállal
Methods
sejtvonalak és emberi szövetek
kaptunk sejtvonalakat az American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA), vagy a koreai sejtvonal Bank (Szöul, Korea): Hat gyomor tumor sejtvonalak (SNU-216, SNU-638, SNU-719, AGS, MKN-28 és KATOIII), öt nem gyomor rákos sejtvonalat (JIMT1, SK-BR-3, SNU-C5, A549, és U87) és két normál humán sejtvonalak (HDF, HMEC). Az összes sejtvonalat tartjuk kijelölt média (Mediatech, Manassas, VA, USA), kiegészítve 10% magzati borjúszérummal (Invitrogen, Calsbard, CA, USA). Húsz illesztett pár normál és tumoros gyomor szöveteket úgy kaptuk, endoszkópos reszekció vizsgálata során a betegek, akik írásos beleegyezését adta (2. táblázat). Minden eljárást végeztünk a protokollok szerinti jóváhagyott intézményi felülvizsgálati testület a Nemzeti Rákkutató Központ és követnie kell a Helsinki.Table 2 Plusz betegek feltéve gyomorrák szövetekben. Katalógusa katalógusa katalógusa betegek száma Matton betegek száma katalógusa Összesen katalógusa 20 katalógusa Férfi katalógusa 14 fiatal női katalógusa 6 katalógusa Age a diagnózis (év) hotelben tartomány katalógusa 34-77 katalógusa átlag ± SD katalógusa 60,8 ± 12,1 katalógusa betegség stádiuma † katalógusa tumorstádium katalógusa T1 katalógusa 8 katalógusa T2
8
T3 katalógusa 4 katalógusa Node szakaszban katalógusa N0 katalógusa 8 katalógusa N1 katalógusa 6 katalógusa N2 katalógusa 2 | N3 katalógusa 4
† Stage besorolás az TNM osztályozási rendszer szerint a Nemzetközi Rákellenes Unió (UICC) [27]. katalógusa RNS kivonását és a cDNS szintézis katalógusa Gyomorrák szöveti mintákat tartósított RNAlater oldatban (Qiagen, Hilden, Németország), amíg használja az RNS kivonása. Teljes RNS-t extraháljuk TRIzol Regent szerint a gyártó protokollja (Invitrogen), és kezeltük DNaseI on RNeasy Mini oszlopon (Qiagen), hogy eltávolítsuk a maradék genomiális DNS-t. Koncentráció és A 260/280 arányban tisztított RNS mértük Nanodrop ND-1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA), és a minőség volt értékelni Agilent 2100 Bioanalyzer RNS 6000 Nano kit (Agilent Technologies, Santa Clara , CA, USA). Két pg poli-dT-alapozás teljes RNS-t (random hexamer légteleníteni teljes RNS 18S rRNS-amplifikáció) reverz-transzkripcióval azzal Transcriptor reverz transzkriptáz alkalmazásával a gyártó protokollja (Roche Applied Science, Mannheim, Németország).
Mennyiségét reverz transzkripciós kvantitatív valós -time PCR (RT-qPCR) összehasonlítás alapján a korábbi jelentésekben elfogadott primerek fragmentum hossz alatti 200 bp, kivéve ACTB, hogy fenntartsa az erősítés hatásfoka (3. táblázat). A primereket az erősítés a GPNMB tervezte Primer 3 szoftvert http: //Frodó. Wi. Mit. Edu /Primer3 /. Meghatároztuk mRNS expressziója 6 referencia gének és egy célgén RT-qPCR a világos-Cycler 480 II (Roche Applied Science). RT-qPCR reakció alkalmazásával végeztük 5 ng higított cDNS 5 pmol mindegyik primerből (3. táblázat), 5 ul 2 × Light-Cycler Fast DNS MasterPlus SYBR Green I végtérfogatban 10 ul. A PCR ciklus körülmények a következőképpen állapították meg: pre-inkubáció 5 percig 95 ° C hőmérsékleten, majd 45 ciklus, mindegyik ciklus, beleértve 15 másodpercig 95 ° C, 30 másodpercig, 58 ° C hőmérsékleten, és 30 másodperc 72 ° C-on. Relatív mennyiségi végeztük Fény Cycler Software 1.5.0 (Roche Applied Science) alapján a "átkelőhely" (Cp) érték, amely meghatározza a ciklus szám, amelynél a fluoreszcens jel a minta meghaladja a háttér fluoreszcencia value.Table 3 alapozók hat referencia gének és egy cél-gént.
Gene Matton Forward primer [5 '→ 3'] katalógusa fordított sorrend [5 '→ 3'] Matton Horgonyzás katalógusa exon Matton Amplicon katalógusa mérete Matton Felölelve on
genome

Amplification
efficiency

Reference

ACTB
CATCGAGCACGGCATCGTCA
TAGCACAGCCTGGATAGCAAC
Exon 3 katalógusa Exon 4 katalógusa 211 bp katalógusa 652 bp katalógusa 1.971 katalógusa [28] katalógusa GAPDH katalógusa TGCACCACCAACTGCTTA katalógusa GGATGCAGGGATGATGTTC katalógusa Exon 7 katalógusa Exon 8
177 bp katalógusa 370 bp katalógusa 1.999 katalógusa [29] katalógusa HPRT1 katalógusa AGACTTTGCTTTCCTTGGTCAG katalógusa TCAAGGGCATATCCTACAACAA katalógusa Exon 6 katalógusa Exon 8 katalógusa 151 bp katalógusa 5120 bp
1,949 katalógusa [30] katalógusa B2M katalógusa ACTGAATTCACCCCCACTGA katalógusa CCTCCATGATGCTGCTTACA katalógusa Exon 2 | Exon 4 katalógusa 114 bp katalógusa 741 bp katalógusa 1,924 katalógusa [ ,,,0],28] katalógusa 18S rRNS katalógusa GTAACCCGTTGAACCCCATT katalógusa CCATCCAATCGGTAGTAGCG katalógusa NA1 katalógusa 151 bp katalógusa 151 bp katalógusa 2.000 katalógusa [31] katalógusa RPL29 katalógusa GGCGTTGTTGACCCTATTTC katalógusa GTGTGTGGTGTGGTTCTTGG katalógusa Exon 1 katalógusa Exon 2 | 120 bp katalógusa 507 bp katalógusa 1.937 katalógusa [16] katalógusa GPNMB katalógusa TGCGTCCGTGAGAATTCA katalógusa TGTGCTCCCTCATGTAAGCA katalógusa Exon 1
Exon 2 | 144 bp katalógusa 6522 bp katalógusa 1.945 katalógusa a házban design2 katalógusa 1. Nem áll
2. primereket terveztünk a Primer 3 humán mispriming könyvtár szűrési lehetőségeket.
adatok elemzések katalógusa statisztikai elemzéseket végeztünk GraphPad Prism V4.03 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). A normalitás szerint értékeltük Kolmogorov-Smirnov (KS), D'Agostino-Pearson (DAP), és Shapiro-Wilk (SW) vizsgálatok. Az eloszlás nem normális eloszlású csoportok, nem parametrikus Mann-Whitney U-tesztet és Wilcoxon tesztet végeztünk. P-értékek p katalógusa < 0,05 tekintettük statisztikailag szignifikánsnak. Alkalmaztunk NormFinder V12 [7] és geNorm ™ V3.44 [8] szoftver, hogy meghatározza a expressziós értékek hat jelölt referencia géneket.
Eredménye
RNS minőségének értékeléséhez
Megvizsgáltuk a minőségi RNS használunk kiindulási anyag több szempontból is. A 260/280 arány mért Nanodrop volt 2,08 ± 0,09 (átlag ± SD) megerősíti, hogy az RNS-t tiszta és fehérje-mentes. RNS minősége jelentette, például RNS integritás szám (RIN) az RNS 6000 Nano Labchip a tenyésztett sejtvonal volt 9,7 ± 0,2 (átlag ± SD), és 7,4 ± 1,0 a páciens szöveti mintákat. Az illesztett pár gyomor szövetminták, nem találtunk statisztikailag szignifikáns különbség a két A 260/280 közötti arány a normál (2,05 ± 0,03) és a tumor (2,04 ± 0,05) szövetek (Student-féle t katalógusa - teszt p katalógusa -érték = 0,214), illetve RIN értékek a normál (7,2 ± 0,5) és a tumor (7,5 ± 1,4) szövetmintáról csoport (Student-féle t katalógusa próba p katalógusa -érték = 0,340).
Expression tartományok jelölt referencia gének és a megcélzott gén
végeztünk RT-qPCR és meghatározták az amplifikációs hatékonysága minden egyes primer (3. táblázat). A kifejezés a hat jelölt referencia gének szempontjából Cp értékek generált RT-qPCR, jelennek meg az 1. ábrán, mint szórásdiagramon. A sejtvonalakat mutatott spektrumát Cp értékek, ami a széles különbség kifejezés, kezdve között 14,56 és 34,89, attól függően, a referencia gén használni. ACTB és GAPDH megmutatta legnagyobb mennyiségben expressziót mind a "gyomor rákos sejtvonal" és "nem-gyomor rákos sejtvonalak", de ellentétben HPRT1 kimutatta legalacsonyabb expressziós szint. A kifejezés a megcélzott gén GPNMB CP értékek között mozgott 27,7-32,1 sejtvonalakon. A normalitás értékelés azt mutatta, HPRT1 in 'gyomorrák sejtvonalak' és a 18S rRNS-a "nem gyomor sejtvonalak 'nem normál eloszlásúak által KS-teszt. Így alkalmazott nem-parametrikus Mann-Whitney U-teszt összehasonlítva nem normális eloszlású páratlan csoportok, és ez jelentős különbségeket mutatott ki a megnyilvánulásai GAPDH (p = 0,014 katalógusa) és B2M (p = 0,035 katalógusa) között "gyomor rákos sejtvonal" és "nem-gyomor rákos sejtvonalak '. Ábra 1-expresszió szintjét, hat jelölt referencia gén által észlelt RT-qPCR. Átkelőhely (Cp) értékek "gyomorrák sejtvonalakon" és "nem-gyomor rákos sejtvonalak", "normális gyomor szövetek" és a "tumor gyomor szövetek" vannak ábrázolva expressziós szintje. Vízszintes sáv közepén szétszórt helyeken jelzi átlagos expressziós szintet. Minél alacsonyabb a Cp érték, annál nagyobb a gének expresszióját.
Emberi gyomor szövetek is kimutatta, számos változat Cp értékek terjedő 13,3-29,4 (1. ábra), és a legmagasabb kifejezése B2M és 18S rRNS és a legalacsonyabb expresszióját HPRT1 . A kifejezés a megcélzott gén GPNMB a Cp mozgott 28,5-34,7 a gyomor. Ebben normalitás vizsgálat, ACTB, HPRT1 és 18S rRNS "normál gyomor szövetek csoport és minden gén kivételével GAPDH a tumor gyomor szövetek" követ normál eloszlást KS-teszt. HPRT1, B2M és RPL29 tumor gyomor szövetek telt normálisként DAP- és SW-vizsgálatok. Így összehasonlítva nem normális eloszlású párosított csoportok végeztünk nem-paraméteres Wilcoxon tesztet. Jelentős expresszió növekedése a normális és a tumoros gyomor szövetekben (p
< 0,05) volt megfigyelhető HPRT1 (p
= 0,011) és a 18S rRNS (p
= 0,021), de nem a ACTB (p
= 0,058), GAPDH (p = 0,918 katalógusa), B2M (p = 0,740 katalógusa), vagy RPL29 (p = 0,208 katalógusa). katalógusa Expression stabilitását jelölt referencia gének
érdekében azonosítani a legstabilabb referencia gén, elemeztük a kifejezés adatokat geNorm és NormFinder. Mi kategorizált sejtvonalak és szövetek a következő csoportok - "nem a gyomor rákos sejtvonalak ',' gyomor rákos sejtvonalak", "normális gyomor szövetek", "tumor gyomor szövetek", "minden gyomor szövetek (normál + daganat a gyomor szövetek ) "és az" összes gyomor rákos sejtvonal és szövetekben. " Az alkalmazás a geNorm alapértelmezett határérték (M < 1,5) kizárni instabil referencia gének és bal minimális számú alkalmas referencia gének minden egyes csoport a végén (2. ábra). Hogy meghatározza az optimális számát szükséges gének mértani átlag normalizálás, összehasonlítottuk páros variáció (V n /V n + 1) számítják geNorm között az egyes kombinációk szekvenciális váltószámokra (NF n és NF n + 1) minden minta esetében a csoportban. Mi alkalmazott alapértelmezett küszöbérték (0,15) a cut-off [8], amely alatt felveendő további referencia gének nem szükséges. Minden csoportban értékeltük ebben a vizsgálatban, a páronkénti variációk már a küszöbérték alatt (3. ábra), így azt értelmezni, hogy a több mint két optimális gének nem előnyös a pontosság növelésére. Másrészt, azt találtuk, korrelációt variancia és meredeksége az M-érték görbe. Abban az esetben, a "nem-gyomor rákos sejtvonalak ', hozzáadásával GAPDH, mint a harmadik gén a két optimálisan várható gén B2M-RPL29 növekszik 0,0218 A stabilitási érték M, annak páronkénti variancia V 2 /3. 0,032. Ily módon, a koefficiens közötti korreláció páronként variáció és a növekmény a M-érték minden intervallumban ebben a csoportban volt szánva, hogy r katalógusa 2 = 0,956. Mert "a gyomor rákos sejtvonalak," a magasabb V 4/5 (0,018) és a V 5/6 (0,028) értékek, mint V 2/3 vagy V 3/4 miért a magas pontszámú HPRT1 és ACTB gének ki kell zárni. A korrelációs együttható r katalógusa 2 = 0,895. A korrelációs együttható "normális gyomor szövetek", "tumor gyomor szövetek" és a "minden gyomor szövetek" voltak r katalógusa 2 = 0,971, 0,996 és 0,960, ill. In 'minden gyomor rákos sejtvonalak és szövetek "azt mutatta, hogy kevesebb korrelációt (r katalógusa 2 = 0,718). 2. ábra Átlagos kifejezés stabilitás (M) hat jelölt referencia gének geNorm elemzéseket. Expression stabilitás ábrázoltuk a "nem gyomor rákos sejtvonalak '(A)," gyomor rákos sejtvonalak' (B), a "rendes gyomor szövetek" (C), "tumor gyomor szövetek" (D), "minden gyomor szövetek" (E) és az "összes gyomorrák sejtvonal és szövetek '(F). A legkevésbé stabil referencia gén (magasabb M-érték) a bal oldalon, és a legstabilabb kombináció (alsó M-érték) a jobb oldalon a telek. Legstabilabb referencia gén által levezetett lépésenkénti kizárásával a legkevésbé stabil géneket.
3. ábra páronkénti varianciaanalízis hat jelölt referencia gén. Páronként variáció érték (Vn /n + 1) által generált geNorm elemzést. Optimális gének számát becsülték összehasonlításával Vn /n + 1. Minden változatát alatt voltak alapértelmezett határa 0,15.
Is alkalmazni NormFinder program azonos adatsorokat és a számított értékek stabilitását. Amint a 4. táblázatban látható, a legalacsonyabb stabilitás érték azt jelzi, legstabilabb expresszióját, és mi rangsorolt ​​géneket kell. A legjobb egyetlen referencia gén minden egyes csoport a következő; "Nem a gyomor rákos sejtvonalak '- GAPDH (0,036)," gyomor rákos sejtvonalak' - B2M (0,014), a "rendes gyomor szövetek" - RPL29 (0,028), tumor gyomor szövetek "- RPL29 (0.028)," minden gyomor szövetek "- RPL29 (0,032) és az" összes gyomor sejtvonalak és szövetek "- ACTB (0,029). A rangsorban a referencia gének "gyomor rákos sejtvonalak" azonos volt a geNorm elemzés volt, de kissé eltérő más kategóriákban. NormFinder megbecsüli a legjobb kombináció a referencia gén által továbbadott csoportosítást "minden gyomor szövetek" - RPL29-B2M (0,005), valamint a "minden gyomor sejtvonalak és szövetek" - 18S rRNS-B2M (0,013) .table 4 rangsor az jelölt egyetlen referencia gének alapján stabilitást számított értékek NormFinder. katalógusa Nem gyomor rákos sejtvonalak
gyomor rákos sejtvonalak
Normál gyomor szövetek
tumor gyomor szövetek
Minden gyomor szövetek katalógusa
Minden gyomor sejtvonalak + szövetek
Gene rangsor Matton stabilitási értéket Matton Gene rangsor Matton stabilitási értéket Matton Gene rangsor Matton stabilitási értéket Matton Gene rangsor Matton stabilitási értéket Matton Gene rangsor Matton stabilitási értéket katalógusa
Gene rangsor Matton Stabilitási value

GAPDH
0.036
B2M
0.014
RPL29
0.028
RPL29
0.028
RPL29
0.032
ACTB
0.029
RPL29
0.052
GAPDH
0.021
B2M
0.035
B2M
0.039
B2M
0.041
HPRT1
0.038
B2M
0.053
RPL29
0.029
HPRT1
0.038
HPRT1
0.042
HPRT1
0.044
RPL29
0.068
HPRT1
0.110
18S rRNS
0,036 katalógusa ACTB
0,043 katalógusa ACTB
0.065 katalógusa ACTB
0,052 katalógusa 18S rRNS
0.071 katalógusa 18S rRNS
0,112 katalógusa ACTB
0,060 katalógusa 18S rRNS
0,062 katalógusa 18S rRNS
0,067 katalógusa 18S rRNA
0.055
GAPDH
0.082
ACTB
0.143
HPRT1
0.115
GAPDH
0.140
GAPDH
0.147
GAPDH
0.140
B2M
0.084
Cél génexpressziós profilokat befolyásolja referencia gének alkalmazott normalizálás katalógusa Az értékeléshez a referencia gének valós helyzetet, úgy döntöttünk, "gyomor rákos sejtvonalak", "minden gyomor szövetek" és a "minden gyomor sejtvonalak és szövetek", mert rák kutatók összpontosít összehasonlításával génexpresszió normál és tumoros szövetekben, valamint a gyomor származik rákos sejtvonalak in vitro vizsgálatban. Alkalmaztunk egyetlen referencia gének és kombinációk a relatív mennyiségi (RQ) A GPNMB katalógusa, mint a cél-gént. GPNMB egy transzmembrán glikoprotein, és játszik együttműködő szerepet a p53 és citokin által közvetített transzkripciós faktorok differenciált immunsejtek [22] és a mellrák [23]. Az RQ GPNMB kifejezés minden hat darab referencia gének és B2M-GAPDH kombináció "gyomor rákos sejtvonalak" hasonlították (4. ábra). A RQS által B2M, GAPDH egyetlen referencia gén és B2M-GAPDH, amelyek várhatóan a legnagyobb optimális kombinációját referencia gének "gyomor rákos sejtvonalak 'által geNorm hasonló volt magas-alacsony mintázatok (4A, ábra, B és 4G). Összehasonlításképpen, a RQ által RPL29 eredményezett egy látszólag megemelkedett expresszió SNU-216, de csökkentett expresszió SNU-719 sejtvonalat (4C). Az RQ által 18S rRNS is mutatott emelkedett expressziót SNU-216, de csökkentette kifejezést MKN-28 (ábra 4D). Az RQ által ACTB és HPRT1 mutatott rendkívül csökkent expressziót SNU-719 és KATOIII (ábra 4E és 4F). 4. ábra A relatív számszerűsítését GPNMB kifejezés gyomorrák sejtvonalakon függ különböző referencia gén. A GPNMB expresszió hat gyomor rákos sejtvonalakban normalizáltuk hat egyetlen referencia gének és legjobb kombináció által elért geNorm (átlag ± SD); normalizáltuk B2M (A), a GAPDH (B), a RPL29 (C), a 18S rRNS (D), a ACTB (E), HPRT1 (F) és mértani átlagát B2M-GAPDH kombináció (G).
A különbség GPNMB RQ között normál és daganatos szövetek gyomor türelmes volt függő. RQ magasabb bizonyos tumorok, de ellentétes mások. Az RQ normalizálódott minden hat darab referencia gén nem mutat pontosan ugyanolyan mintát. Abban az esetben, normalizálás által RPL29 amely megjósolt legstabilabb egyetlen referencia gén NormFinder és legstabilabb kombinálva HPRT1 a geNorm, a magas-alacsony minta az RQ közötti különbség normális és tumor (5A ábra) hasonló volt az RQ által HPRT1 bár voltak különbséget három betegnél (5B, ábra). Az RQ által B2M (5c) és 18S rRNS (5D ábra) azt mutatja, különböző mintát magas rangú egyetlen hivatkozási gének több beteg. A ACTB (5E ábra) GAPDH (ábra 5F), a különbség nagyobb lett; voltak különbségek 35% -át a betegek. Az RQ normalizáltuk mértani RPL29-HPRT1 kombinációt geNorm (ábra 5G) és RPL29-B2M származó NormFinder (ábra 5H) esetében hasonló mintát. Amennyiben a teljes szeres változást (Tumor /Normál) hasonlították, RQ GPNMB által B2M (T /N = 2,46 × páros t próba katalógusa p katalógusa = 0,017) RPL29-B2M (T /N = 2,08 ×, p = 0,025 katalógusa) jelentős növekedést mutatott a normál és a tumoros gyomor. RQ által RPL29 (T /N = 2,23 × p = 0,071 katalógusa), HPRT1 (T /N = 1,34 × p = 0,258 katalógusa), ACTB (T /N = 1,60 × p = katalógusa 0,395), 18S rRNS (T /N = 1,36 × p = 0,527 katalógusa) és RPL29-HPRT1 (T /N = 1,76 × p = 0,086 katalógusa) is egyre inkább GPNMB kifejezés a daganatos szövetekben gyomorban, de nem volt statisztikailag szignifikáns. Ehhez képest azt mutatta, hogy ellentétes irányba kifejezés különbség (T /N = 0,75 × p = 0,637 katalógusa) által GAPDH. Ez azt sugallja, hogy a GAPDH-expresszió a tumor gyomor szövetekben erősen emelkedett, mint a többi referencia géneket. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy az RQ adatai target gén lehet értelmezni függően különböző referencia gén használt normalizálás. 5. ábra A relatív számszerűsítését GPNMB expresszió normál és daganatos szövetek gyomor függ különböző referencia gén. A GPNMB kifejezés gyomorrák szövetekben (szilárd bar: Normál, nyitott bár tumor) normalizáltuk hat darab referencia gének és két kombináció származó geNorm és NormFinder (átlag ± SD); normalizáltuk RPL29 (A), a HPRT1 (B), a B2M (C), a 18S rRNS (D), a ACTB (E), GAPDH (F), a geometriai középértéke RPL29-HPRT1 (G) és RPL29-B2M (H).
a "minden gyomor rákos sejtvonal és szövetekben ', NormFinder és geNorm megjósolt 18S rRNS-B2M és 18S rRNS-ACTB, mint a legjobb kombináció. A minta a GPNMB RQ geometriai középértéke ezek a kombinációk hasonló volt közöttük. GPNMB RQS között "gyomor rákos sejtvonal" és "minden gyomor szövetek" lehetne hasonlítani belül ugyanabban a tartományban a 18S rRNS-ACTB, de volt 1 log rend különbség a 18S rRNS-B2M pályára. Minták az RQ a gyomra rákos sejtvonalak '(6A, 6B) hasonló volt a RQ által B2M-GAPDH (ábra 4G), de RQ "minden gyomor szövetek" által 18S rRNS-ACTB (6B) eltértek ( ábra 5G, 5H). Úgy tűnik, hogy jelentősen megnövekedett 18S rRNS expresszió a tumor gyomor szövetekben (1. ábra), hozzájárulhat ezt az eredményt. Így, bár ezek a kombinációk kerültek megjósolta, mint a legjobb, ezek nem alkalmasak az adatok értelmezése. 6. ábra relatív mennyiségi meghatározására GPNMB kifejezés a medencében az összes gyomor rákos sejtvonalakban és szövetekben függ különböző kombinációi referencia géneket. A GPNMB kifejezés gyomorrák sejtvonalakon és gyomor (szilárd bar: Normál, nyitott bár tumor) normalizálódtak a két kombináció származó geNorm és NormFinder (átlag ± SD); normalizáltuk 18S rRNS-ACTB a gyomor rákos sejtvonalak (A) és a gyomor szövetekben (C) és a normalizált által 18S rRNS-B2M gyomorrák sejtvonalon (B) és a gyomor szövetekben (D).
Megbeszélés
Differenciál génexpresszió rák azonosított transzkriptom tanulmány arra utal, hogy bizonyos specifikus gének esetleg részt vesz a tumorigenezis és metasztázis a rák. RT-qPCR egy robusztus és specifikus módszer validálása azonosságát jelölt gének gyomorrák, mert érzékeli, még nagyon gyenge jeleket csak rendkívül kis mennyiségű biopsziát mintát, ha a beteg a korai szakaszában a rák. Azonban, ha nincs megfelelő referencia gének kapott adatok nyitott kérdés, ami félreérthető. A vizsgálat előtt, egyetlen érvényesített referencia gént azonosítottak "gyomorrák sejtvonal" vagy "gyomorrák szövet", de ACTB és GAPDH használták leggyakrabban mostanáig tekintet nélkül azok következetlen kifejezések különböző kísérleti beállítások és klinikai körülmények között . Megvizsgáltuk, amellett, hogy ACTB és GAPDH, négy másik referencia gének HPRT1, RPL29, 18S rRNS, és B2M már értékelt referenciaként gének legújabb tanulmányok más emberi rákok.
Nyilvánvaló, hogy a választott megfelelő primer készlet fontos kiindulási pont, hogy pontos eredményeket kapjunk. Mi tekinthető a következő pontokat kiválasztásában alapozók. Először is elfogadott primer készlet a korábban leírták, hogy vagy úgy tervezték, hogy rendelkezzen a fragmentum hossza körülbelül 200 bp. Másodszor, az összes primer készleteket kell befogják legalább két szomszédos exont kivéve 18S rRNS gén, amely nem egy mRNS. A fenti két pont kapcsolódik az amplifikációs hatékonyságot. Szükséges, hogy a referencia gén és a megcélzott gén fenntartása hasonló amplifikációs hatékonyság [13]. Amplicon hossza szorosan összefügg erősítés hatásfoka [24]. Tehát az egyik elvár hasonló hatékonyságot fragmentum hasonló hosszúságú, és a nagyobb hatékonyság rövidebb fragmentum. Az előny a rövidebb fragmentum, 70-250 bp, az RT-qPCR hogy erősítés "független" RNS minőségét [25]. Az erősítés hatásfoka is befolyásolja gDNS szennyeződés, mert a kompetitív kötődés primerek viselkedik, mint korlátozó tényező okoz csökkenést az erősítés hatásfoka [13]. Ebben az összefüggésben, DNaseI kezelés során az RNS-tisztítás elengedhetetlen, hogy elkerüljék amplifikációs származó maradék gDNS, de lehet, hogy nem teljesen hatásos. Ezért a második szempont segít felismerni lehetséges szennyeződés gDNS különböző amplikonnal méretben. Igazoltuk, hogy minden egyes előre és reverz primer van lehorgonyozva különböző exon által blat keresések emberi genom szekvenciák és azt is, hogy nem volt amplifikált termék szennyezze gDNS bővített amplikonnal hossz (2. táblázat). Különben is, mi is biztosított a magas minőségű RNS, a kiindulási anyag, több szempontból is. Azt is végzett kísérletek három példányban minden gén és minden minta.
Mivel a fejlesztő qPCR számos statisztikai programokat fejlesztettek azonosítani optimális referencia gének. Azért választottuk geNorm és NormFinder elemezni a stabilitást a hat referencia gén általunk vizsgált. A program kiszámolja geNorm M-értékek átlaga alapján páronkénti változását egy adott gén képest az összes többi vizsgált jelölt referencia gének és rangsorolja őket. [8] Összehasonlításképpen, NormFinder elfogad egy stratégiát, az úgynevezett "modell-alapú megközelítés a becslés kifejezés variáció" [7].

• In silico elemzése a gyomorrák Serial Analysis of Gene Expression könyvtárak feltárja a különböző profilok összefüggő etnikai
• Adjuváns kemo-sugárzás gyomor adenokarcinóma: intézményi tapasztalatok