L'identification des gènes de référence valables pour les études d'expression génique du cancer de l'estomac humain par transcription inverse-qPCR

identification des gènes de référence valables pour les études d'expression génique du cancer de l'estomac humain par transcription inverse-qPCR
Résumé de l'arrière-plan
transcription inverse quantitative en temps réel, la réaction en chaîne par polymérase (RT-qPCR) est une méthode puissante pour l'analyse de l'expression génique. les niveaux d'expression de gènes cibles sont généralement normalisées par rapport à un gène exprimé de façon constante référence également connu en tant qu'étalon interne, dans le même échantillon. Cependant, beaucoup d'efforts n'a pas été dépensé jusqu'à présent dans la recherche de gènes de référence appropriés pour l'étude du cancer de l'estomac en utilisant RT-qPCR, bien que la sélection de gènes de référence optimaux est essentielle pour l'interprétation des résultats.
Méthodes
Nous avons évalué l'aptitude des six gènes de référence possibles, la bêta-actine (ACTB), glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH), l'hypoxanthine phosphoribosyl-transférase 1 (HPRT1), la bêta-2-microglobuline (B2M), sous-unité ribosomale L29 (RPL29) et 18S l'ARN ribosomal (ARNr 18S) dans 20 paires de tissus normaux et de l'estomac de la tumeur de patients atteints de cancer de l'estomac et de l'estomac 6 lignées cellulaires cancéreuses, par RT-PCR quantitative. . Les résultats de Employant la stabilité d'expression des analyses en utilisant des algorithmes NormFinder et geNorm nous avons déterminé l'ordre d'exécution de ces gènes de référence et leurs valeurs de variation
Cette étude RT-qPCR montrent qu'il ya statistiquement significative (p
< 0,05 ) des différences dans les niveaux d'expression de HPRT1 et 18S dans «normal-» contre «les tissus de l'estomac de la tumeur». Les analyses de la stabilité par geNorm suggèrent B2M GAPDH comme meilleure combinaison de gènes de référence pour «lignées cellulaires de cancer de l'estomac»; RPL29-HPRT1, pour 'tous les tissus de l'estomac »; et ACTB-18S, pour 'toutes les lignées cellulaires de l'estomac et des tissus ». NormFinder a également identifié comme étant le meilleur B2M gène de référence pour 'estomac lignées de cellules cancéreuses ", RPL29-B2M' pour tous les tissus de l'estomac», et l'ARNr 18S-ACTB pour 'toutes les lignées cellulaires et les tissus de l'estomac ». Les comparaisons d'expression normalisée du gène cible, GPNMB, ont montré une interprétation différente de l'expression du gène cible dépendra de la meilleure gène de référence unique ou combinaison.
Conclusion
Cette RPL29 d'étude validé et RPL29-B2M comme les meilleurs gènes de référence unique et la combinaison, pour une analyse par RT-PCR quantitative de «tous les tissus de l'estomac», et B2M et B2M GAPDH comme le meilleur gène de référence unique et la combinaison, pour 'estomac lignées cellulaires du cancer ». L'utilisation de ces gènes de référence validés devrait fournir une interprétation plus précise des expressions géniques différentielles au niveau de la transcription dans le cancer de l'estomac.
Contexte
transcription inverse quantitative en temps réel la réaction en chaîne par polymérase (RT-qPCR) est un outil puissant pour valider la observé des différences d'expression génique, en raison de sa plus grande sensibilité et la spécificité. Dans les études traditionnelles d'expression génique, un «gène de référence», également appelé «étalon interne» ou «gène de ménage» est utilisé pour la normalisation. L'expression de la bêta-actine (ACTB) et glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH), utilisé dans la plupart des études [1], a été signalé à varier selon les conditions expérimentales [2] et l'état clinique du tissu étudié (par exemple
asthme), ce qui rend ces gènes ne conviennent pas comme étalons internes pour une utilisation dans la normalisation de l'expression génique [3]. . Ainsi, la validité du gène de référence choisie pour l'analyse statistique est cruciale pour éviter le danger de mal interpréter les données et les conclusions non valides [4]
Il a été suggéré qu'au moins trois considérations doivent être prises en compte dans le choix d'un gène de référence: 1) la constance de son expression tout au long de l'intervention, 2) l'efficacité d'amplification et 3), son abondance, qui devrait être similaire à celle des gènes d'intérêt [5]. En outre, pour assurer la pertinence, la précision et l'exactitude des interprétations de RT-qPCR, il est recommandé que les lignes directrices précises pour RT-qPCR MIQE (Information minimum pour la publication du Temps réel Expérience PCR quantitative) doivent être respectées [6] . Plusieurs outils d'analyse statistique tels que NormFinder [7], geNorm [8], BestKeeper [9] ont été développés pour aider dans le choix des gènes de référence appropriés. Ces outils évaluent les variations dans l'expression d'un certain nombre de gènes de référence potentiels et suggèrent que le gène de référence (s) est appropriée pour la normalisation des données d'expression génique dans une étude donnée. Cancer
de l'estomac est le quatrième cancer le plus répandu dans le monde entier, avec a rapporté 934.000 cas en 2002 [10]. Survie au cancer de l'estomac est faible puisque les patients sont souvent diagnostiqués seulement après que la maladie a déjà progressé de manière significative [11], ce qui rend la détection précoce très important. Le dépistage visant à la détection précoce implique un examen endoscopique. Pour confirmer la présence d'un cancer, des biopsies sont prises à partir de tissus suspectés et soumis à une RT-PCR quantitative pour confirmer l'expression anormale de gènes liés au cancer. Mais les gènes de référence appropriés doivent être identifiés pour des comparaisons valables entre les expressions de la normale par rapport aux gènes du cancer. les gènes de référence ont été décrites pour les études par RT-qPCR dans divers cancers des autres tissus [1, 12-21]. Cependant, il semble y avoir aucun consensus sur les gènes de référence pour les études d'expression génique dans le cancer de l'estomac. Nous avons donc cherché PubMed avec les termes MeSH "de cancer gastrique", "en temps réel", et "PCR". Dans une évaluation de 115 articles publiés de mai 2007 à Novembre 2009, nous avons constaté que GAPDH (53 cas; 46,1%) et ACTB (41 cas; 35,7%) étaient des gènes les plus fréquemment utilisés dans les études de référence de cancer gastrique; suivie par 18S ARNr (8 cas; 7,0%), bêta-2-microglobuline (B2M, 3 cas; 2,6%), hypoxanthine phosphoribosyl transférase 1 (HPRT1; 2 cas; 1,7%), la protéine de liaison TATA (TBP; 1 cas; 0,9 %), et la bêta-tubuline (TUBB; 1 cas; 0,9%). Dans cinq cas (4,3%), la courbe de l'étalon externe a été utilisé pour la quantification absolue (AQ) au lieu de la valeur normalisée par le gène de référence.
La présente étude a donc été conçu pour trouver les meilleurs gènes de référence pour les études d'expression génique dans le cancer de l'estomac . Dans cette étude, nous avons étudié les cinq gènes de référence qui ont été les plus fréquemment utilisés gènes dans les études sur le cancer de l'estomac (ACTB, GAPDH, B2M, 18S ARNr et HPRT1) et à titre de comparaison, RPL29, un gène de référence utilisé dans d'autres études sur le cancer en «non-estomac des lignées cellulaires de cancer d'estomac", "lignées cellulaires du cancer», «tissus stomacaux normaux" et "tissus de l'estomac de tumeur" (tableau 1). Afin de choisir le gène de référence le plus approprié dans la liste ci-dessus, nous avons comparé les expressions de la glycoprotéine NMB (GPNMB), notre gène cible, avec ceux de la liste nommée ci-dessus possible "référence" genes.Table 1 gènes de référence potentiels évalués dans cette étude.
symbole de Gene

GenBank No.
Gene nom
localisation génomique
description de
ACTB
NM_001101
bêta-actine
7p15-12
cytosquelette protéine structurale
GAPDH
NM_002046
glycéraldéhyde-3- phosphate déshydrogénase
12p13
oxydoréductase dans la glycolyse et la néoglucogenèse
HPRT1
NM_000194
hypoxanthine phosphoribosyl transférase 1
récupération métabolique de Xq26 de purines
B2M
NM_004048
Beta-2-microglobuline
15q21.1
Beta-chaîne de molécules majeur d'histocompatibilité de classe I
18S
NR_003286
ARN ribosomal 18S
22p12
ribosome sous-unité
RPL29
protéine ribosomique de NM_00992 L29
3p21.3-p21.2
constituant structurel du ribosome
GPNMB
NM_001005340
glycoprotéine (transmembranaire) NMB
7p15 || C
Impliqué dans le retard et la réduction du potentiel métastatique
Méthodes croissance
lignées cellulaires et tissus humains
Nous avons obtenu des lignées de cellules de la collection American type Culture (Manassas, VA, USA) ou Korean Cell Line Bank (Séoul, Corée): des lignées de cellules tumorales Six d'estomac (SNU-216, SNU-638, SNU-719, AGS, MKN-28 et KATOIII), cinq non-estomac des lignées de cellules de cancer (JIMT1, SK-BR-3, SNU-C5 A549 et U87), et deux lignées de cellules humaines normales (HDF, HMEC). Toutes les lignées cellulaires ont été maintenues dans des milieux désignés (Mediatech, Manassas, VA, USA) supplémenté avec du sérum de veau fœtal à 10% (Invitrogen, Calsbard, CA, USA). Vingt paires de tissus stomacaux normaux et tumoraux ont été obtenues par résection endoscopique lors de l'examen des patients ayant donné leur consentement éclairé (tableau 2). Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par examen institutionnel du conseil d'administration du National Cancer Center et suivent la déclaration de Helsinki.Table 2 Caractéristiques des patients qui ont fourni les tissus cancéreux de l'estomac


Nombre de
Nombre de patients de 6
Age 14
Femme de patients au total de 20
Homme au moment du diagnostic (années)
Gamme
34-77
moyenne ±
60,8 ± 12,1
stade de la maladie †
stade de la tumeur 8
T2 T1 8
4
stade Node de T3
N0 8
N1
6
N2 2
N3
4
† classement de l'étape suit le système de classification TNM par l'Union internationale contre le cancer (UICC) [27]. extraction
de l'ARN et des échantillons de tissus de cancer de l'estomac ADNc synthèse de ont été conservés dans une solution RNAlater (Qiagen, Hilden, Allemagne) jusqu'à ce que utiliser pour l'extraction de l'ARN. L'ARN total a été extrait avec du Trizol Régent selon le protocole du fabricant (Invitrogen) et traité avec la DNase I sur colonne RNeasy Mini (Qiagen) pour éliminer l'ADN génomique résiduel. Concentration et A 260/280 rapport de l'ARN purifié ont été mesurés avec Nanodrop ND-1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA), et la qualité a été évaluée sur Agilent 2100 Bioanalyseur utilisant RNA 6000 kit Nano (Agilent Technologies, Santa Clara , CA, USA). Deux pg de poly-dT ARN total amorcé (hexamère aléatoire amorcée ARN total pour 18S amplification) ont été reverse-transcrits avec Transcriptor transcriptase inverse selon le protocole du fabricant (Roche Applied Science, Mannheim, Allemagne).
Transcription inverse réelle quantitative -time PCR (RT-qPCR)
Basé sur les rapports précédents, nous avons adopté des amorces d'une longueur de 200 pb amplicon ci-dessous, sauf pour ACTB, pour maintenir la cohérence dans l'amplification d'efficacité (tableau 3). Les amorces pour l'amplification de GPNMB ont été conçus par Primer 3 logiciels http: //frodo wi mit edu /primer3 /.... Nous avons quantifié l'expression de l'ARNm de 6 gènes de référence et un gène cible par RT-qPCR sur un Light-Cycler 480 II (Roche Applied Science). réaction de RT-PCR quantitative a été effectuée en utilisant 5 ng d'ADNc dilué, 5 pmol de chaque amorce (tableau 3), 5 ul de 2 x Light-Cycler Fast-MasterPlus ADN SYBR Green I dans un volume final de 10 ul. Les conditions de cycle de PCR sont définies comme suit: une pré-incubation pendant 5 minutes à 95 ° C, puis 45 cycles, chaque cycle comportant 15 secondes à 95 ° C, 30 secondes à 58 ° C et 30 secondes à 72 ° C. quantification relative a été réalisée par la Lumière Cycler Software 1.5.0 (Roche Applied Science) sur la base de «point de passage» (Cp) valeur qui définit le nombre de cycle auquel le signal de fluorescence de l'échantillon dépasse une fluorescence de fond value.Table 3 Amorces pour six gènes de référence et un gène cible.

amorce Forward
Gene [5 '→ 3']
Inverser la séquence [5 '→ 3']
Ancrage
exons
amplicon
taille
Spanning on
genome

Amplification
efficiency

Reference

ACTB
CATCGAGCACGGCATCGTCA
TAGCACAGCCTGGATAGCAAC
Exon 3
Exon 4
211 pb
652 pb
1.971
[28]
GAPDH
TGCACCACCAACTGCTTA
GGATGCAGGGATGATGTTC
Exon 7
Exon 8
177 pb
370 pb
1.999
[29]
HPRT1
AGACTTTGCTTTCCTTGGTCAG
TCAAGGGCATATCCTACAACAA
Exon 6
Exon 8
151 pb
5120 pb
1.949
[30]
B2M
ACTGAATTCACCCCCACTGA
CCTCCATGATGCTGCTTACA
Exon 2
Exon 4
114 pb
741 pb
1.924
[ ,,,0],28]
18S
GTAACCCGTTGAACCCCATT
CCATCCAATCGGTAGTAGCG
NA1
151 pb
151 pb
2,000
[31]
RPL29
GGCGTTGTTGACCCTATTTC
GTGTGTGGTGTGGTTCTTGG
Exon 1
Exon 2
120 pb
507 pb
1.937
[16]
GPNMB
TGCGTCCGTGAGAATTCA
TGTGCTCCCTCATGTAAGCA
Exon 1
Exon 2
144 pb
6522 pb
1.945
Dans la maison design2
1. Non disponible
2. Amorces ont été conçus par Primer 3 avec des options de sélection de la bibliothèque de mésamorçage humaine.
analyses de données
les analyses statistiques ont été réalisées avec GraphPad Prism V4.03 (GraphPad Software, la Jolla, CA, USA). Normalité a été évaluée en fonction de Kolmogorov-Smirnov (KS), D'Agostino-Pearson (DAP), et Shapiro-Wilk Tests (SW). Pour la répartition des groupes distribués non-normales, non-paramétrique de Mann-Whitney U-test et Wilcoxon signé test de rang ont été réalisées. P-valeurs avec p <
0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives. Résultats Nous avons appliqué de NormFinder V12 [7] et geNorm ™ V3.44 [8] logiciel pour déterminer les valeurs d'expression des gènes de référence de six candidats.
évaluation de la qualité de l'ARN
Nous avons évalué la qualité de l'ARN utilisé comme départ matériel de plusieurs façons. A 260/280 mesuré par rapport Nanodrop était de 2,08 ± 0,09 (moyenne ± écart-type) confirmant que l'ARN était pur et exempt de protéines. la qualité de l'ARN rapporté que le numéro de l'intégrité de l'ARN (RIN) par RNA 6000 Nano LabChip pour lignée cellulaire cultivée était de 9,7 ± 0,2 (moyenne ± écart-type), et 7,4 ± 1,0 pour les échantillons de tissus des patients. Pour les paires d'échantillons de tissus de l'estomac, on n'a pas trouvé de différence statistiquement significative dans les deux A 260/280 rapport entre la normale (2,05 ± 0,03) et de la tumeur (2,04 ± 0,05) tissus (t apparié
Student - essai p
-value = 0,214) ou RIN valeurs entre le normal (7,2 ± 0,5) et de la tumeur (7,5 ± 1,4) groupes d'échantillons de tissu (t apparié de Student
-test p
-value = 0,340).
gammes d'expression des gènes de référence candidats et gène cible
Nous avons effectué RT-qPCR et déterminé l'efficacité de l'amplification de chaque jeu d'amorces (tableau 3). L'expression des gènes de référence de six candidats en termes de valeurs Cp générées par RT-qPCR, sont affichés dans la figure 1 comme diagramme de dispersion. Les lignées cellulaires présentaient un spectre de valeurs Cp, ce qui représente une grande différence dans l'expression, comprise entre 14,56 et 34,89, en fonction du gène de référence utilisé. ACTB et GAPDH ont montré l'expression la plus abondante dans les deux 'estomac des lignées cellulaires du cancer »et« non-estomac des lignées cellulaires du cancer », mais contrairement HPRT1 montré le plus faible niveau d'expression. L'expression de la GPNMB du gène cible dans les valeurs Cp variait de 27,7 à 32,1 dans les lignées cellulaires. L'évaluation de la normalité a montré HPRT1 dans 'estomac des lignées cellulaires de cancer »et 18S ARNr' non-estomac lignées cellulaires» ne sont pas normalement distribué par KS-test. Ainsi, nous avons appliqué non paramétrique U-test de Mann-Whitney pour comparer les groupes inégalés distribués non-normales, et il a montré des différences significatives dans les expressions de GAPDH (p = 0,014
) et B2M (p = 0,035
) entre "l'estomac des lignées cellulaires du cancer» et «non-estomac des lignées cellulaires du cancer». Figure 1 Les niveaux d'expression des gènes de référence de six candidats détectés par RT-qPCR. Lieu de passage (Cp) valeurs dans 'estomac lignées cellulaires de cancer »et« non-estomac des lignées cellulaires de cancer »,« tissus de l'estomac normaux »et les« tissus de l'estomac de la tumeur »sont représentés comme niveau d'expression. Barre horizontale au milieu de taches dispersées indique le niveau d'expression moyen. Plus la valeur de Cp est élevé, plus l'expression des gènes.
Tissus de l'estomac humaines ont également montré de grandes variations dans les valeurs Cp allant de 13,3 à 29,4 (Figure 1), avec la plus haute expression de B2M et 18S et la plus faible expression de HPRT1 . L'expression de la GPNMB du gène cible en Cp variait de 28,5 à 34,7 dans les tissus de l'estomac. Dans le test de normalité, ACTB, HPRT1 et 18S dans le groupe «tissus de l'estomac normales et tous les gènes à l'exception de GAPDH dans les« tissus de l'estomac de la tumeur »suivie distribution normale par KS-test. HPRT1, B2M et RPL29 dans les tissus de l'estomac de la tumeur a passé la normalité dans DAP- et SW-tests. Ainsi, pour comparer les groupes appariés distribués non-normales, nous avons effectué des non-paramétrique de Wilcoxon rank test. Augmentation significative de l'expression de la normale dans les tissus de l'estomac de la tumeur (p
< 0,05) ont été observées dans HPRT1 (p = 0,011
) et l'ARNr 18S (p = 0,021)
, mais pas dans ACTB (p
= 0,058), GAPDH (p = 0,918
), B2M (p = 0,740
), ou RPL29 (p = 0,208
)
. la stabilité de l'expression des gènes de référence candidats
pour pour identifier des gènes de référence les plus stables, nous avons analysé les données d'expression avec geNorm et NormFinder. Nous avons classé les lignées de cellules et de tissus dans les groupes suivants - «lignées cellulaires de cancer non-estomac ',' estomac lignées cellulaires de cancer», «les tissus normaux de l'estomac», «les tissus de l'estomac de la tumeur», «tous les tissus de l'estomac (tissus normaux + de l'estomac de la tumeur ) 'et' tout cancer de l'estomac des lignées cellulaires et des tissus. L'application de geNorm avec limite par défaut (M < 1,5) exclu gènes de référence instables et laissé nombre minimal de gènes de référence appropriés pour chaque groupe à la fin (Figure 2). Pour déterminer le nombre optimal de gènes nécessaires à la normalisation moyenne géométrique, nous avons comparé paires variation (V n /V n + 1) calculé par geNorm entre chaque combinaison de facteurs de normalisation séquentielles (NF n et NF n + 1) pour tous les échantillons dans le groupe. Nous avons appliqué le seuil par défaut (0,15) pour coupure [8] au-dessous duquel l'inclusion de gènes de référence supplémentaires ne sont pas nécessaires. Dans tous les groupes évalués dans cette étude, les variations de paires sont déjà en dessous du seuil (Figure 3), il a donc été interprété que l'utilisation de plus de deux gènes optimales ne sont pas bénéfiques pour améliorer la précision. D'autre part, nous avons trouvé une corrélation entre la variance et la pente de la courbe M-valeur. Dans le cas de «lignées de cellules cancéreuses non estomac", l'addition de la GAPDH comme troisième gène pour les deux gènes de manière optimale prévus B2M-RPL29 augmente de 0,0218 de la valeur de la stabilité M, avec sa variance par paires V 2 /3 de 0,032. De cette manière, le coefficient de corrélation entre paires variation et l'incrément de M-valeur à chaque intervalle dans ce groupe était déterminé à être r
2 = 0,956. Pour «lignées cellulaires de cancer de l'estomac, la plus élevée V 4/5 (0,018) et V 5/6 (0.028) valeurs que V 2/3 ou V 3/4 expliquent pourquoi le HPRT1 score élevé et les gènes ACTB devraient être exclus. Le coefficient de corrélation est r
2 = 0,895. Les coefficients de corrélation dans les «tissus normaux de l'estomac», «tissus de l'estomac de la tumeur» et «tous les tissus de l'estomac» étaient r
2 = 0,971, 0,996 et 0,960, respectivement. Dans «toutes les lignées cellulaires et les tissus de cancer de l'estomac", il a montré moins de corrélation (r
2 = 0,718). Figure 2 Stabilité moyen d'expression (M) de six gènes de référence candidate par geNorm analyse. la stabilité de l'expression ont été tracées en «non-estomac des lignées cellulaires de cancer» (A), 'estomac lignées de cellules cancéreuses "(B)", tissus de l'estomac normaux' (C '), les tissus de l'estomac de la tumeur' (D '), tous les tissus de l'estomac' (E) et «toutes les lignes et dans les tissus des cellules du cancer de l'estomac" (F). Le gène de référence stable moins (valeur M supérieure) est sur la gauche et la combinaison la plus stable (valeur M inférieure) est sur la droite du terrain. gènes de référence les plus stables ont été déduites par l'exclusion progressive des gènes les moins stables.
Figure 3 Pair-wise analyse de variation de six gènes de référence de candidat. La valeur de variation par paires (Vn /n + 1) a été généré par une analyse geNorm. nombre optimal de gènes a été estimée en comparant Vn /n + 1. Toutes les variations étaient sous la limite par défaut de 0,15.
Nous avons également appliqué le programme NormFinder aux mêmes ensembles de données et des valeurs de stabilité calculées. Comme on le voit dans le tableau 4, la valeur la plus faible stabilité indique l'expression la plus stable et on a classé les gènes en conséquence. Le meilleur gène de référence unique pour chaque groupe est le suivant; «non-estomac des lignées cellulaires du cancer» - GAPDH (0,036), «l'estomac des lignées cellulaires du cancer» - B2M (0,014), «tissus stomacaux normaux» - RPL29 (0,028), «tissus de l'estomac de la tumeur '- RPL29 (0,028'), toutes tissus de l'estomac »- RPL29 (0,032) et« toutes les lignées cellulaires de l'estomac et des tissus »- ACTB (0,029). Le rang de gènes de référence pour 'estomac lignées cellulaires de cancer »est identique à celui de l'analyse de geNorm, mais était légèrement différente dans d'autres catégories. NormFinder estime également la meilleure combinaison de gènes de référence par sous-regroupement dans «tous les tissus de l'estomac» - RPL29-B2M (0,005) et dans 'toutes les lignées cellulaires de l'estomac et des tissus »- 18S-B2M (0,013) .Table 4 Classement du gènes candidats de référence unique en fonction de leurs valeurs de stabilité calculées à partir de NormFinder.
lignées cellulaires de cancer non-estomac
lignées cellulaires de cancer de l'estomac
tissus de l'estomac normal

tissus des tumeurs de l'estomac
Tous les tissus de l'estomac

Toutes les lignées de cellules de l'estomac + tissus
Gene pour le classement
valeur stabilité
Gene pour le classement
valeur stabilité
Gene en ordre de classement
valeur stabilité
Gene dans l'ordre de classement
valeur stabilité
Gene dans l'ordre de classement
valeur stabilité

Gene pour le classement
stabilité value

GAPDH
0.036
B2M
0.014
RPL29
0.028
RPL29
0.028
RPL29
0.032
ACTB
0.029
RPL29
0.052
GAPDH
0.021
B2M
0.035
B2M
0.039
B2M
0.041
HPRT1
0.038
B2M
0.053
RPL29
0.029
HPRT1
0.038
HPRT1
0.042
HPRT1
0.044
RPL29
0.068
HPRT1
0.110
18S ARNr
0,036
ACTB
0,043
ACTB
0,065
ACTB
0,052
18S
0,071
18S
0.112
ACTB
0,060
18S
0,062
18S
0.067
18S rRNA
0.055
GAPDH
0.082
ACTB
0.143
HPRT1
0.115
GAPDH
0.140
GAPDH
0.147
GAPDH
0.140
B2M
0.084
profils d'expression des gènes cibles sont influencés par des gènes de référence utilisés pour la normalisation
Pour l'évaluation des gènes de référence en situation réelle, nous avons choisi 'estomac des lignées de cellules de cancer »,« tous les tissus de l'estomac »et« toutes les lignées de cellules de l'estomac et des tissus »parce que la mise au point de recherche sur le cancer en comparant l'expression des gènes dans des tissus normaux et tumoraux, ainsi que l'estomac est issue des lignées de cellules cancéreuses in vitro pour l'étude. Nous avons appliqué les gènes et les combinaisons de référence unique dans la quantification relative (RQ) de GPNMB
comme un gène cible. GPNMB est une glycoprotéine transmembranaire et joue un rôle de coopération avec p53 et des facteurs de transcription à médiation par des cytokines dans les cellules différenciées immunitaires [22] et le cancer du sein [23]. Le RQ de l'expression de la GPNMB par chacun six gènes de référence unique et la combinaison B2M-GAPDH dans 'estomac des lignées cellulaires de cancer »a été comparé (figure 4). Le QR par B2M, GAPDH comme gène de référence unique et B2M-GAPDH qui ont été prévu pour être la combinaison la plus optimale des gènes de référence pour 'estomac lignées cellulaires de cancer »par geNorm a montré des tendances similaires haut-bas (figure 4A, B et 4G). En comparaison, le RQ par RPL29 a donné lieu à une expression apparemment élevée dans SNU-216, mais a réduit l'expression dans SNU-719 lignées cellulaires (figure 4C). Le RQ par 18S a également montré une expression élevée dans SNU-216, mais réduit l'expression dans MKN-28 (Figure 4D). Le RQ par ACTB et HPRT1 montré extrêmement réduit l'expression dans SNU-719 et KATOIII (Figure 4E et 4F). La figure 4 quantification relative de l'expression de la GPNMB dans des lignées cellulaires de cancer de l'estomac dépend de différents gènes de référence. L'expression de la GPNMB dans des lignées cellulaires de cancer de l'estomac six ont été normalisés par six gènes de référence individuelles et la meilleure combinaison obtenue par geNorm (moyenne ± écart-type); normalisée par B2M (A), de la GAPDH (B), par RPL29 (C), par l'ARNr 18S (D), par ACTB (E), HPRT1 (F) et la moyenne géométrique de la combinaison B2M GAPDH (G).
La différence de GPNMB RQ entre les tissus de l'estomac normales et tumorales était dépendante du patient. RQ est plus élevé dans certaines tumeurs, mais contraire, dans d'autres. Le RQ normalisé par chaque gène unique de référence de six n'a pas montré le même schéma exact. Dans le cas de la normalisation par RPL29 qui a été prédite comme gène de référence unique le plus stable dans NormFinder et combinaison la plus stable avec HPRT1 dans geNorm, le modèle haut-bas de la différence de RQ entre le normal et la tumeur (figure 5A) était similaire à RQ par HPRT1 bien qu'il y étaient différence de trois patients (figure 5B). Le RQ par B2M (Figure 5c) et 18S (Figure 5d) a montré motif différent de gènes de référence unique hautement cotées dans plus de patients. Avec ACTB (figure 5E) GAPDH (figure 5F), la différence devient plus grande; il y avait des différences de 35% du total des patients. Le RQ normalisé par les moyennes géométriques de combinaison RPL29-HPRT1 de geNorm (Figure 5G) et RPL29-B2M de NormFinder (figure 5H) a montré le même modèle. Lorsque le changement global de pliage (tumeur /Normal) a été comparée, RQ de GPNMB par B2M (T /N = 2,46 ×, t apparié
-test p
= 0,017) et RPL29-B2M (T /N = 2,08 ×, p = 0,025
) montré une augmentation significative de la normale dans les tissus de l'estomac de la tumeur. RQ par RPL29 (T /N = 2,23 ×, p = 0,071
), HPRT1 (T /N = 1,34 ×, p = 0,258
), ACTB (T /N = 1,60 ×, p =
0,395), 18S (T /N = 1,36 ×, p = 0,527
) et RPL29-HPRT1 (T /N = 1,76 ×, p = 0,086
) ont également montré de plus en plus l'expression de la GPNMB dans les tissus de l'estomac de la tumeur, mais il n'a pas été statistiquement significative. En comparaison, il a montré la direction opposée de la différence d'expression (T /N = 0,75 ×, p = 0,637
) par GAPDH. Ceci suggère que l'expression de GAPDH dans les tissus de l'estomac tumorales sont très élevée par rapport aux autres gènes de référence. Ces résultats suggèrent également que les données RQ du gène cible peuvent être interprétées de différentes manières en fonction des gènes de référence utilisés pour la normalisation. La figure 5 la quantification relative de l'expression de la GPNMB dans des tissus stomacaux normaux et tumoraux dépend de différents gènes de référence. L'expression de la GPNMB dans les tissus de cancer de l'estomac (barre solide: Normal, bar ouvert: Tumeur) ont été normalisés par six gènes de référence simples et deux combinaisons dérivées de geNorm et NormFinder (moyenne ± écart-type); normalisée par RPL29 (A), par HPRT1 (B), par B2M (C), de l'ARNr 18S (D), par ACTB (E), GAPDH (F), moyenne géométrique de RPL29-HPRT1 (G) et RPL29-B2M (H).
Pour les 'toutes les lignes et les tissus cellulaires de cancer de l'estomac », NormFinder et geNorm prédit 18S-B2M et 18S-ACTB comme les meilleures combinaisons. Le modèle de GPNMB RQ par la moyenne géométrique de ces combinaisons était similaire entre eux. QR GPNMB entre 'estomac lignées cellulaires de cancer »et« tous les tissus de l'estomac »pourraient être comparés au sein même gamme avec 18S-ACTB, mais il y avait 1 log de la différence de l'ordre par la combinaison 18S-B2M. Les modèles de RQ dans 'estomac lignées cellulaires de cancer »(figure 6A, 6B) étaient similaires à RQ par B2M-GAPDH (figure 4G), mais RQ de« tous les tissus de l'estomac »par 18S-ACTB (figure 6B) étaient différentes de ( Figure 5G, 5H). Il apparaît que l'augmentation de manière significative l'expression de 18S dans les tissus de l'estomac de la tumeur (figure 1) pourrait contribuer à ce résultat. Ainsi, bien que ces combinaisons ont été prédits comme mieux, ils ne sont pas adaptés pour l'interprétation des données. La figure 6 quantification relative de l'expression de la GPNMB dans la mare de toutes les lignées cellulaires et des tissus de cancer de l'estomac dépend de différentes combinaisons de gènes de référence. L'expression de la GPNMB dans des lignées cellulaires de cancer de l'estomac et les tissus de l'estomac (barre solide: Normal, bar ouvert: Tumeur) ont été normalisés par deux combinaisons dérivées de geNorm et NormFinder (moyenne ± écart-type); Rapport de normalisé par 18S-ACTB dans des lignées cellulaires de cancer de l'estomac (A) et les tissus de l'estomac (C) et normalisée par l'ARNr 18S-B2M dans la lignée cellulaire de cancer de l'estomac (B) et les tissus de l'estomac (D).
différentiel l'expression génique dans le cancer identifié à partir de l'étude du transcriptome suggère que certains gènes spécifiques pourraient être impliqués dans la tumorigenèse et les métastases du cancer. RT-PCR quantitative est une méthode robuste et spécifique pour la validation de l'identité des gènes candidats du cancer de l'estomac, car il détecte des signaux très faibles à partir de très petites quantités d'échantillons de biopsie, si le patient est en phase précoce du cancer. Cependant, en l'absence de gènes de référence appropriés, les données obtenues sont ouverts à la question qui conduit à une mauvaise interprétation. Avant cette étude, le gène de référence ne validé a été identifié pour 'estomac lignée cellulaire de cancer »ou« tissu de cancer de l'estomac », mais ACTB et GAPDH ont été utilisés le plus fréquemment jusqu'à présent sans tenir compte de leurs expressions contradictoires dans différents contextes expérimentaux et les conditions cliniques . Nous avons examiné, en plus de ACTB et GAPDH, quatre autres gènes de référence, HPRT1, RPL29, ARNr 18S, et B2M qui ont été évalués comme des gènes de référence au cours des dernières études pour d'autres cancers humains.
Il est évident que le choix d'amorces appropriée est un important point de départ pour obtenir des résultats précis. Nous avons examiné suivant les points dans le choix des amorces. Tout d'abord, nous avons adopté les jeux d'amorces qui ont été précédemment rapportés d'avoir ou conçus pour posséder une longueur d'amplicon d'environ 200 pb. D'autre part, tous les jeux d'amorces ont été nécessaires pour couvrir au moins deux exons voisins, sauf pour le gène d'ARNr 18S qui ne soit pas un ARNm. Les deux points ci-dessus sont liés à l'efficacité de l'amplification. Il est nécessaire que le gène de référence et gène cible maintiennent une amplification efficacité similaire [13]. Longueur de l'amplicon est étroitement liée à l'amplification d'efficacité [24]. Donc, on pourrait attendre une efficacité similaire de amplicon de longueur similaire, et une plus grande efficacité d'un amplicon plus courte. L'avantage de amplicon plus courte, 70-250 pb, en RT-qPCR est que l'amplification est «indépendant» de la qualité de l'ARN [25]. L'efficacité d'amplification est également affectée par la contamination ADNg, parce que la liaison compétitive des amorces agit comme un facteur limitant provoquant la diminution de l'amplification efficacité [13]. Dans ce contexte, le traitement à la DNase I pendant la purification de l'ARN est essentielle pour éviter l'amplification de l'ADNg résiduel, mais il pourrait ne pas être totalement efficace. Par conséquent, notre deuxième examen permet de détecter la contamination possible avec ADNg avec différentes tailles d'amplicons. Nous avons confirmé que chaque amorce avant et arrière est ancrée sur exon différente par des recherches Blat sur les séquences du génome humain et aussi qu'il n'y avait pas de produit amplifié de contaminer ADNg avec une longueur de amplicon prolongée (tableau 2). D'ailleurs, nous avons également veillé à la qualité de l'ARN, le matériau de départ, de plusieurs façons. Nous avons également effectué des expériences en triple pour chaque gène et chaque échantillon.
Depuis le développement de qPCR, plusieurs programmes statistiques ont été développés pour identifier les gènes de référence optimaux. Nous avons choisi geNorm et NormFinder pour analyser la stabilité des six gènes de référence que nous avons étudiés. Le programme de geNorm calcule M-valeurs basées sur la paire sage variation moyenne d'un gène particulier par rapport à tous les autres gènes de référence candidats étudiés et les classe [8]. En comparaison, NormFinder adopte une stratégie, appelée «approche basée sur un modèle d'estimation de la variation de l'expression" [7].

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