Identifizierung gültiger Referenzgene für Genexpressionsstudien des menschlichen Magenkrebs durch reverse Transkription-qPCR

Identifizierung gültiger Referenzgene für Genexpressionsstudien des menschlichen Magenkrebs durch reverse Transkription-qPCR
Zusammenfassung
Hintergrund
Transkription quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) ist eine leistungsfähige Methode für die Analyse umkehren der Genexpression. Zielgen-Expressionsniveaus sind in der Regel normalisiert auf einem konstant ausgedrückt Referenzgens auch als interner Standard bekannt ist, in der gleichen Probe. Allerdings hat sich viel Mühe nicht so weit bei der Suche nach Referenzgenen geeignet für die Untersuchung von Magenkrebs mittels RT-qPCR aufgewandt, obwohl Auswahl der optimalen Referenzgene für die Interpretation der Ergebnisse entscheidend ist.
Methoden kaufen Wir bewertet die Eignung der sechs möglichen Referenzgenen, beta-Aktin (ACTB), Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH), Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase-1 (HPRT1), beta-2-Mikroglobulin (B2M) ribosomalen Untereinheit L29 (RPL29) und 18S ribosomale RNA (18S rRNA) in 20 normalen und Tumormagengewebe Paare von Magenkrebs-Patienten und 6 Magenkrebs-Zelllinien, die von RT-qPCR. . Ausdruck Stabilität Der Einsatz analysiert und Normfinder geNorm Algorithmen wir die Reihenfolge der Leistung dieser Referenzgenen und deren Variationswerte bestimmt
Ergebnisse
Dieser RT-qPCR-Studie zeigte, dass es statistisch signifikant sind (p
< 0,05 ) Unterschiede in den Expressionsniveaus von HPRT1 und 18S rRNA in 'normal- "versus" Tumor Magen Gewebe ". Die Stabilitätsanalysen von geNorm vorschlagen B2M-GAPDH, als beste Kombination Referenz-Gen für 'Magenkrebs-Zelllinien'; RPL29-HPRT1, für "alle Magengewebe"; und ACTB-18S rRNA, für "alle Magen-Zelllinien und Geweben". Normfinder auch B2M als die beste Referenz-Gen identifiziert für 'Magenkrebs-Zelllinien', RPL29-B2M für "alle Magengewebe", und 18S rRNA-ACTB für "alle Magen-Zelllinien und Geweben". Die Vergleiche der normierten Expression des Zielgens, GPNMB, zeigten unterschiedliche Interpretation der Zielgenexpression hängen von besten Single Referenz-Gen oder eine Kombination.
Fazit
Diese Studie bestätigt RPL29 und RPL29-B2M als die besten Einzelreferenzgenen und Kombination, für die RT-qPCR-Analyse von "alle Magengewebe", und B2M und B2M-GAPDH als beste Single Referenz-Gen und Kombination, für 'Magenkrebs-Zelllinien'. Die Verwendung dieser validierten Referenzgene sollte genauere Interpretation der differentiellen Genexpression auf Transkriptionsebene in Magenkrebs zur Verfügung stellen.
Hintergrund reversen Transkription
quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Validierung beobachteter Genexpression Unterschiede aufgrund seiner größeren Empfindlichkeit und Spezifität. In der traditionellen Genexpressionsstudien, ein "Referenz-Gen", auch "interne Standard" oder "Housekeeping-Gen" genannt wird, für die Normalisierung verwendet. Die Expression von beta-Aktin (ACTB) und Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH), in der Mehrzahl der Studien [1], berichtet wurde mit Versuchsbedingungen zu variieren, [2] und klinischen Zustand des Gewebes untersucht (zB
Asthma), so dass diese Gene nicht geeignet als interne Standards zur Verwendung bei der Normalisierung der Genexpression [3]. . So entscheidend die Gültigkeit des Referenzgens für die statistische Analyse ausgewählt ist zur Vermeidung der Gefahr von Daten und ungültige Schlussfolgerungen falsch interpretiert [4]
Es wurde vorgeschlagen, dass mindestens drei Überlegungen sollten bei der Auswahl eines Referenzgens berücksichtigt werden: 1) Beständigkeit seiner Expression in der gesamten Intervention, 2) seine Amplifikationseffizienz und 3) seine Fülle, die derjenigen der Gene von Interesse ähnlich sein sollten [5]. Darüber hinaus die Relevanz, Genauigkeit und Richtigkeit der Interpretationen der RT-qPCR zu gewährleisten, empfiehlt es sich, dass die genauen Richtlinien für die RT-qPCR MIQE (Minimum Informationen zur Veröffentlichung von Quantitative Experiment Real-Time PCR) eingehalten werden sollte [6] . Mehrere Werkzeuge zur statistischen Analyse wie Normfinder [7], geNorm [8], BestKeeper [9] wurden bei der Auswahl der geeigneten Referenz Gene zu helfen entwickelt. Diese Tools beurteilen die Veränderungen in der Expression von einer Reihe von potenziellen Referenzgenen und deuten darauf hin, welche Referenz-Gen (en) ist für die Normalisierung von Genexpressionsdaten in einer gegebenen Studie.
Magenkrebs die vierthäufigste Krebs ist weltweit, mit eine gemeldete 934.000 Fälle im Jahr 2002 [10]. Überleben von Magenkrebs ist schlecht, da die Patienten oft nur diagnostiziert werden, nachdem die Krankheit bereits deutlich fortgeschritten ist [11], was sehr wichtig Früherkennung macht. Screening bei der Früherkennung Ziel beinhaltet endoskopische Untersuchung. Um das Vorhandensein von Krebs bestätigen, werden Biopsien verdächtiger Gewebe entnommen und auf RT-qPCR zu abnormen Expression von Krebs in Zusammenhang stehenden Genen bestätigen. Aber entsprechende Referenzgene haben für gültige Vergleiche zwischen Ausdrücken von normalen gegenüber Krebsgene identifiziert werden. Referenz-Gene wurden für die RT-qPCR-Studien in verschiedenen Krebserkrankungen von anderen Geweben beschrieben [1, 12-21]. Allerdings scheint es für Genexpressionsstudien in Magenkrebs keinen Konsens über Referenzgene zu sein. Wir suchten daher PubMed mit MeSH Begriffe "Magenkrebs", "real-time" und "PCR". Bei einer Auswertung von 115 Artikel von Mai 2007 bis November 2009 veröffentlicht wurde, fanden wir, dass GAPDH (53 Fälle; 46,1%) und ACTB (41 Fälle; 35,7%) sind die am häufigsten verwendeten Referenzgene bei Magenkrebs-Studien waren; gefolgt von 18S rRNA (8 Fälle; 7,0%), Beta-2-Mikroglobulin (B2M; 3 Fälle; 2,6%), Hypoxanthinphosphoribosyltransferase 1 (HPRT1; 2cases; 1,7%), TATA-bindendes Protein (TBP; 1 Fall; 0,9 %) und beta-Tubulin (TUBB; 1 Fall; 0,9%). In fünf Fällen (4,3%), wurde ein externer Standardkurve für die absolute Quantifizierung (AQ) anstelle von normalisierten Wert von Referenz-Gen verwendet.
Die vorliegende Studie daher am besten Referenzgene für die Genexpressionsstudien bei Magenkrebs zu finden, wurde entwickelt, . In dieser Studie untersuchten wir die fünf Referenzgene, die am häufigsten Gene in Magenkrebsforschung (ACTB, GAPDH, B2M, 18S rRNA und HPRT1) und zum Vergleich RPL29, eines Referenzgens in anderen Krebsstudien verwendet wurden, in "nicht-Magenkrebs-Zelllinien", "Magenkrebs-Zelllinien", "normale Magen Gewebe" und "Tumor Magen Gewebe" (Tabelle 1). Um die am besten geeignete Referenz-Gen aus der obigen Liste zu wählen, verglichen wir die Ausdrücke von Glykoprotein NMB (GPNMB), unser Ziel-Gen, mit denen in der oben genannten Liste der möglichen "Referenz" genes.Table 1 Potentialreferenzgene ausgewertet diese Studie.
Gene Symbol
GenBank Accession Nr
Genname
Genomic Lokalisierung

Beschreibung
ACTB
NM_001101
Beta-Actin
7p15-12
Zytoskelett-Strukturprotein
GAPDH
NM_002046
Glyceraldehyde-3- Phosphat-Dehydrogenase
12p13
Oxidoreduktase in Glykolyse und Gluconeogenese
HPRT1
NM_000194
Hypoxanthinphosphoribosyltransferase 1

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