L'identificazione di geni di riferimento validi per studi di espressione genica del cancro allo stomaco umano trascrizione inversa-qPCR
Abstract
sfondo
inversione di trascrizione in tempo reale reazione a catena della polimerasi quantitativa (RT-qPCR) è un potente metodo per l'analisi dell'espressione genica. livelli di espressione del gene bersaglio sono solitamente normalizzato a un gene di riferimento costantemente espresso noto anche come standard interno, nello stesso campione. Tuttavia, molti sforzi non è stato speso finora nella ricerca di geni di riferimento adeguati per lo studio del cancro allo stomaco con RT-qPCR, anche se la selezione di geni di riferimento ottimale è fondamentale per l'interpretazione dei risultati.
Metodi
abbiamo valutato l'idoneità dei sei possibili geni di riferimento, il beta-actina (ACTB), glyceraldehydes-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH), ipoxantina fosforibosil transferasi 1 (HPRT1), beta-2-microglobulina (B2M), ribosomiale subunità L29 (RPL29) e 18S RNA ribosomiale (rRNA 18S) in 20 coppie di tessuti normali e tumorali dello stomaco di pazienti affetti da cancro allo stomaco e 6 linee di cellule di cancro allo stomaco, mediante RT-qPCR. . Impiegando stabilità espressione analisi utilizzando algoritmi NormFinder e geNorm abbiamo determinato l'ordine di esecuzione di questi geni di riferimento ei relativi valori di variazione
Risultati
Questo studio RT-qPCR ha dimostrato che ci sono statisticamente significativi (p
< 0,05 ) differenze nei livelli di espressione di HPRT1 e 18S rRNA in 'normal-' contro 'i tessuti del tumore dello stomaco'. La stabilità analizza da geNorm suggeriscono B2M-GAPDH, come migliore combinazione gene di riferimento per 'linee cellulari di cancro allo stomaco'; RPL29-HPRT1, per 'tutti i tessuti dello stomaco'; e ACTB-18S rRNA, per 'tutte le linee cellulari e tessuti dello stomaco'. NormFinder anche identificato B2M come il miglior gene di riferimento per lo stomaco linee cellulari di cancro ', RPL29-B2M per' tutti i tessuti dello stomaco ', e 18S rRNA-ACTB per' tutte le linee cellulari e tessuti dello stomaco. I confronti di espressione normalizzata del gene bersaglio, GPNMB, hanno mostrato diversa interpretazione dell'espressione genica bersaglio dipenderà migliore gene di riferimento unico o la combinazione.
Conclusione
Questo studio ha convalidato RPL29 e RPL29-B2M come i migliori geni di riferimento unico e combinazione, per l'analisi RT-qPCR di "tutti i tessuti dello stomaco ', e B2M e B2M-GAPDH come il miglior gene di riferimento unico e combinazione, per lo stomaco linee cellulari tumorali. L'utilizzo di questi geni di riferimento convalidati dovrebbe fornire più esatta interpretazione delle espressioni genica differenziale a livello di trascrizione di cancro allo stomaco.
Sfondo
Reverse trascrizione in tempo reale reazione a catena della polimerasi quantitativa (RT-qPCR) è un potente strumento per la validazione del differenze di espressione genica osservati, a causa della sua maggiore sensibilità e specificità. Negli studi di espressione genica tradizionali, un 'gene di riferimento', chiamato anche 'standard interno' o 'gene housekeeping' è usato per la normalizzazione. L'espressione di beta-actina (ACTB) e glyceraldehydes-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH), utilizzato nella maggior parte degli studi [1], è stata riportata a variare con le condizioni sperimentali [2] e lo stato clinico del tessuto studiato (ad esempio
asma), rendendo questi geni inadatti come standard interni per l'uso in normalizzazione dell'espressione genica [3]. . Pertanto, la validità del gene di riferimento prescelto per l'analisi statistica è indispensabile per evitare il rischio di mal interpretare dati e le conclusioni validi [4]
stato suggerito che almeno tre considerazioni devono essere prese in considerazione nella scelta di un gene di riferimento: 1) costanza della sua espressione durante l'intervento, 2) la sua efficienza di amplificazione e 3) la sua abbondanza, che dovrebbe essere simile a quello dei geni di interesse [5]. Inoltre, per garantire la pertinenza, l'accuratezza e la correttezza dei interpretazioni di RT-qPCR, si raccomanda che le linee guida precise per RT-qPCR MIQE (informazioni minime per la Pubblicazione di Quantitative Real-Time PCR Experiment) devono essere rispettate [6] . Diversi strumenti per l'analisi statistica, come NormFinder [7], geNorm [8], BestKeeper [9] sono stati sviluppati per aiutare nella scelta di opportuni geni di riferimento. Questi strumenti valutare le variazioni nell'espressione di una serie di potenziali geni di riferimento e suggeriscono che gene di riferimento (s) è appropriato per la normalizzazione dei dati di espressione genica in un dato studio. Cancro
stomaco è il quarto cancro più comune al mondo, con una segnalati 934.000 casi nel 2002 [10]. La sopravvivenza da cancro allo stomaco è scarsa poiché i pazienti sono spesso diagnosticati solo dopo che la malattia ha già avanzato in maniera significativa [11], il che rende la diagnosi precoce molto importante. Screening che mira a una diagnosi precoce comporta un esame endoscopico. Per confermare la presenza del cancro, biopsie sono prese dai tessuti sospetti e sottoposti a RT-qPCR per confermare l'espressione anormale di geni connessi con il cancro. Ma opportuni geni di riferimento devono essere identificati per i confronti validi tra espressioni del normale rispetto a geni del cancro. geni di riferimento sono stati descritti per gli studi di RT-qPCR in vari tipi di cancro di altri tessuti [1, 12-21]. Tuttavia sembra che ci sia consenso sui geni di riferimento per gli studi di espressione genica nel cancro allo stomaco. Abbiamo quindi cercato PubMed con termini MeSH "cancro gastrico", "in tempo reale", e "PCR". In una valutazione di 115 articoli pubblicati da maggio 2007 a novembre 2009 abbiamo scoperto che GAPDH (53 casi; 46,1%) e ACTB (41 casi; 35,7%) sono stati i geni di riferimento più frequentemente utilizzati negli studi di cancro gastrico; seguito da 18S rRNA (8 casi; 7,0%), beta-2-microglobulina (B2M; 3 casi, 2,6%), ipoxantina fosforibosil transferasi 1 (HPRT1; 2cases; 1,7%), TATA legarsi alle proteine (TBP, 1 caso; 0.9 %), e beta-tubulina (TUBB, 1 caso; 0,9%). In cinque casi (4,3%), la curva standard esterno è stato utilizzato per la quantificazione assoluta (AQ), invece di valore normalizzato dal gene di riferimento.
Il presente studio è stato quindi progettato per trovare migliori geni di riferimento per gli studi di espressione genica nel cancro allo stomaco . In questo studio, abbiamo studiato i cinque geni di riferimento che sono stati utilizzati più frequentemente geni negli studi di cancro allo stomaco (ACTB, GAPDH, B2M, 18S rRNA, e HPRT1) e per il confronto, RPL29, un gene di riferimento utilizzati in altri studi sul cancro, in 'non-stomaco linee cellulari di cancro "," stomaco linee cellulari di cancro', 'normali tessuti dello stomaco e dei "tessuti dello stomaco tumorali' (Tabella 1). Al fine di scegliere il gene di riferimento più appropriato dall'elenco di cui sopra, abbiamo confrontato le espressioni della glicoproteina NMB (GPNMB), il nostro gene bersaglio, con quelli in questo elenco denominata di possibile "riferimento" genes.Table 1 geni potenziale di riferimento valutati in questo studio.
Gene simbolo
il GenBank adesione No.
Gene nome
localizzazione genomica
Descrizione
ACTB
NM_001101
Beta-actina
7p15-12
citoscheletro proteina strutturale
GAPDH
NM_002046
Glyceraldehyde-3- fosfato deidrogenasi
12p13
Ossidoreduttasi nella glicolisi e la gluconeogenesi
HPRT1
NM_000194
Hypoxanthine fosforibosil transferasi 1
Xq26
salvataggio metabolica delle purine
B2M
NM_004048
Beta-2 microglobulina
15q21.1
Beta-catena di grande classe complesso di istocompatibilità molecole I
18S rRNA
NR_003286
18S RNA ribosomiale
22p12
Ribosoma subunità
RPL29
NM_00992
proteina ribosomiale L29
3p21.3-p21.2
costituente strutturale del ribosoma
GPNMB
NM_001005340
glicoproteina (transmembrana) NMB
7p15
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