Identificatie van geldige referentie genen voor genexpressie studies van humane maagkanker door reverse transcriptie-qPCR
Abstract achtergrond
Omgekeerde transcriptie kwantitatieve Real-time PCR (RT-qPCR) is een krachtige methode voor de analyse van genexpressie. Doelwitgen expressieniveaus doorgaans genormaliseerd naar consistent expressie referentiegen ook bekend als interne standaard in hetzelfde monster. Echter, veel inspanning niet is tot nu toe in de zoektocht naar referentie genen die geschikt zijn voor de studie van maagkanker met behulp van RT-qPCR besteed, hoewel selectie van de optimale verwijzing genen is van cruciaal belang voor de interpretatie van de resultaten.
Methods
We geëvalueerd de geschiktheid van zes mogelijke verwijzing genen, beta-actine (ACTB), glyceraldehydes-3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH), hypoxanthine fosforibosyltransferase 1 (HPRT1), beta-2-microglobuline (B2M), ribosomale subeenheid L29 (RPL29) en 18S ribosomaal RNA (18S rRNA) in 20 normale en maag tumorweefsel paren maagkanker patiënten en 6 maagkanker cellijnen door RT-qPCR. . Gebruikmakend van expressie stabiliteit analyseert met behulp van NormFinder en geNorm algoritmes we de volgorde van de prestaties van deze referentie-genen en hun variatie waarden bepaald
Resultaten Inloggen Deze RT-qPCR studie toonde aan dat er een statistisch significant (p Restaurant < 0,05 ) verschillen in expressieniveaus van HPRT1 en 18S rRNA in 'normaal-' versus 'maag tumorweefsels. De stabiliteit analyseert door geNorm suggereren B2M-GAPDH, als beste referentie-gen combinatie voor 'maagkanker cellijnen'; RPL29-HPRT1, voor 'alle maag weefsels'; en ACTB-18S rRNA, voor 'alle maag cellijnen en weefsels'. NormFinder ook geïdentificeerd B2M als de beste referentie-gen voor 'maagkanker cellijnen', RPL29-B2M voor 'alle maag weefsels', en 18S rRNA-ACTB voor 'alle maag cellijnen en weefsels'. De vergelijkingen van genormaliseerde expressie van het doelwitgen, GPNMB toonde andere interpretatie van doelwitgenexpressie afhankelijk beste single referentie-gen of formatie.
Conclusie
Deze studie gevalideerd RPL29 en RPL29-B2M als beste enkele referentie genen en combinatie, voor RT-qPCR analyse van 'all maag weefsels', en B2M en B2M-GAPDH als de beste single referentie-gen en de combinatie, voor 'maagkanker cellijnen'. Het gebruik van deze gevalideerde referentie-genen zouden meer precieze invulling van differentiële gen expressies op transcriptie niveau in maagkanker. Achtergrond
reverse transcriptie van kwantitatieve real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR) is een krachtig hulpmiddel voor het valideren van de waargenomen genexpressie verschillen vanwege de grotere gevoeligheid en specificiteit. In de traditionele genexpressie studies, is een 'referentie-gen', ook wel 'interne standaard' of 'housekeeping gen' gebruikt voor de normalisering. De expressie van beta-actine (ACTB) en glyceraldehydes-3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH), die in de meeste studies [1], werd gemeld te variëren met experimentele condities [2] en de klinische toestand van het weefsel onderzocht (bijvoorbeeld
astma), waardoor deze genen geschikt als interne standaards voor normalisering van genexpressie [3]. . Zo is de geldigheid van de referentie-gen gekozen voor statistische analyse is van cruciaal belang voor het vermijden van het gevaar van een verkeerde interpretatie van de gegevens en ongeldige conclusies [4]
Er werd gesuggereerd dat ten minste drie overwegingen rekening moet worden gehouden bij het kiezen van een referentie-gen: 1) bestendigheid van de expressie gedurende de interventie, 2) de amplificatie-efficiëntie en 3) zijn overvloed, die vergelijkbaar is met die van de genen van belang moeten [5]. Bovendien, om de relevantie, accuraatheid en juistheid van interpretaties van RT-qPCR te verzekeren, wordt aanbevolen dat de precieze richtlijnen voor de RT-qPCR MiQE (Minimum Informatie voor de publicatie van kwantitatieve real-time PCR Experiment) moet worden nageleefd [6] . Verscheidene hulpmiddelen voor statistische analyse zoals NormFinder [7], geNorm [8], BestKeeper [9] zijn ontwikkeld om te helpen bij de keuze van geschikte referentie genen. Deze hulpmiddelen beoordeling van de verschillen in de expressie van een aantal potentiële referentie genen en suggereren waarnaar gen (en) dient voor normalisatie van genexpressie data in een gegeven studie.
Maagkanker is de vierde meest voorkomende kanker wereldwijd, met een gerapporteerde 934.000 gevallen in 2002 [10]. Survival van maagkanker is slecht, omdat de patiënten vaak gediagnosticeerd pas na de ziekte al aanzienlijk [11] beschikt over geavanceerde, die vroege opsporing zeer belangrijk maakt. Screening gericht op vroege opsporing gaat endoscopisch onderzoek. Om de aanwezigheid van kanker te bevestigen, worden biopsies genomen van verdachte weefsel en onderworpen aan RT-qPCR abnormale expressie van kanker-gerelateerde genen te bevestigen. Maar passende verwijzing genen te identificeren voor geldige vergelijkingen tussen uitingen van normale versus kankergenen. Referentie genen zijn beschreven voor RT-qPCR studies bij verschillende kankersoorten of andere weefsels [1, 12-21]. lijkt er echter geen consensus over verwijzing genen voor genexpressie studies in de maag kanker. Daarom zocht met PubMed MeSH termen "maagkanker", "real-time" en "PCR". In een evaluatie van de 115 gepubliceerde artikelen van mei 2007 tot november 2009, vonden we dat GAPDH (53 gevallen; 46,1%) en ACTB (41 gevallen; 35,7%) waren de meest gebruikte referentie-genen in maagkanker studies; gevolgd door 18S rRNA (8 gevallen; 7,0%), beta-2-microglobuline (B2M, 3 gevallen; 2,6%), hypoxanthinefosforibosyltransferase 1 (HPRT1; 2cases; 1,7%), TATA-bindend eiwit (TBP, 1 geval; 0,9 %) en bèta-tubuline (TUBB, 1 zaak; 0,9%). In vijf gevallen (4,3%), werd externe standaard curve wordt gebruikt voor absolute kwantificatie (AQ) in plaats van genormaliseerde waarde van referentie-gen. Ondernemingen De huidige studie is dan ook ontworpen om beste referentie genen voor de genexpressie studies in maagkanker vinden . In deze studie hebben we de vijf referentie genen die het meest frequent gebruikt genen in maagkanker studies (ACTB, GAPDH, B2M, 18S rRNA en HPRT1) en ter vergelijking, RPL29, een referentie-gen gebruikt in andere onderzoeken kanker, in "niet-maagkanker cellijnen ',' maagkanker cellijnen ',' normale maag weefsels" en "tumor maag weefsels (Tabel 1). Om het meest geschikte referentie-gen uit de bovenstaande lijst choose, vergeleken we de uitingen van glycoproteïne NMB (GPNMB), onze doelgen, met die in de bovengenoemde lijst van mogelijke "referentie" genes.Table 1 Potentiële referentie genen geëvalueerd deze studie.
Gene symbool Gids GenBank Accession No.
Gene naam
Genomic lokalisatie
Beschrijving
ACTB
NM_001101
Beta-actine
7p15-12
cytoskelet structureel eiwit
GAPDH
NM_002046
Glyceraldehyde-3- fosfaatdehydrogenase
12p13
Oxidoreductase in glycolyse en gluconeogenese
HPRT1
NM_000194
hypoxanthinefosforibosyltransferase 1
Xq26
Metabolic berging van purines
B2M
NM_004048
Beta-2-microglobuline
15q21.1
bèta-keten van major histocompatibility complex klasse I moleculen
18S rRNA
NR_003286
18S ribosomaal RNA
22p12
Ribosoom subunit
RPL29
NM_00992
ribosomale eiwit L29
3p21.3-p21.2
structurele bestanddeel van ribosoom
GPNMB
NM_001005340
glycoproteïne (transmembraan) NMB
7p15
DeNovix maakt winnaar bekend van Platinum DS11 FX+ Spectrofotometer / Fluorometer
Metformine kan een lekkende darm helpen
Huishoudelijke ontsmettingsmiddelen kunnen bijdragen aan het risico op obesitas bij kinderen
Darmimmuuncellen kunnen verantwoordelijk zijn voor veranderingen in het metabolisme, vindt onderzoek
Onderzoek toont aan dat probiotica angst en depressie kunnen helpen bestrijden
Hebben vrouwen meer kans om langdurig COVID te ontwikkelen?
Nieuwe strategie kan de darm-hersencommunicatie versterken
Het communicatiesysteem tussen de darm en de hersenen staat bekend als de darm-hersen-as en is goed ingeburgerd. Nutsvoorzieningen, wetenschappers hebben een strategie ontwikkeld die het volume van de
Ultraviolet B-licht is goed voor het darmmicrobioom
Een kleine studie gepubliceerd in het tijdschrift Grenzen in de immunologie op 24 oktober, 2019, laat zien dat blootstelling aan ultraviolet B (UVB) licht, die gewoonlijk wordt bereikt door blootste
Diagnose van virale infecties met behulp van technologieën op micro- en nanoschaal
De behoefte aan bevolkingsbrede, snel, gevoelig, en kosteneffectieve diagnostische tests zijn aanzienlijk toegenomen als gevolg van het ernstige acute respiratoire syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2),