Identifikacija važećih referentnih gena za ekspresiju gena studijama ljudskog raka želuca reverznom transkripcijom-qPCR

Identifikacija važećih referentnih gena za ekspresiju gena studijama ljudskog raka želuca reverznom transkripcijom-qPCR
apstraktne pregled pozadine
reverzne transkripcije kvantitativnog real-time lančane reakcije polimeraze (RT-qPCR) je snažan metoda za analizu ekspresije gena. Ciljni gen razine ekspresije obično se normalizira na jednu uporno referentnog gena također poznat kao interni standard, u istom uzorku. Međutim, mnogo truda nije potrošeno do sada u potrazi za referentne gene prikladne za proučavanje raka želuca pomoću RT-qPCR, iako izbor optimalnih referentnih gena je kritična za tumačenje rezultata.
Metode pregled smo procjenu prikladnosti šest mogućih referentnih gena, beta-aktin (ACTB) glyceraldehydes-3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH), hipoksantin fosforibozil transferaze 1 (HPRT1), beta-2-mikroglobulin (B2M), ribosomna podjedinica L29 (RPL29) i 18S ribosomske RNA (rRNA 18S) u 20 zdravih i tumorskih tkiva želuca para pacijenata oboljelih od raka želuca i 6 želucu staničnim linijama raka, pomoću RT-qPCR. . Koristeći stabilnost izraz analizira pomoću NormFinder i geNorm algoritme možemo odrediti redoslijed obavljanja tih referentnih gena i njihovih varijacija vrijednosti pregled Rezultati
ovaj RT-qPCR istraživanja pokazuju da postoje statistički značajne (p izvoznici < 0,05 ) razlike u razinama ekspresije HPRT1 i 18S rRNA u 'normalnih' u odnosu na 'tumor želuca tkiva. Stabilnost analize, geNorm sugeriraju B2M-GAPDH, kao najbolji referentna gena kombinacija za 'želučanih staničnim linijama karcinoma'; RPL29-HPRT1, za "sva želučanog tkiva '; i ACTB-18S rRNA, za "sva želudac staničnim linijama i tkiva". NormFinder također identificirali B2M kao najbolji referentnog gena za 'želučanih staničnim linijama karcinoma', RPL29-B2M za "sva tkiva u želucu ', i 18S rRNA-ACTB" Sve želudac staničnim linijama i tkiva ". Usporedba normalizirana ekspresije ciljnog gena, GPNMB, pokazali su različite interpretacije prepisivanja ciljnih gena ovisi o najboljem jednog referentnog gena ili kombinacija. Pregled Zaključak pregled ovoj studiji potvrđene RPL29 i RPL29-B2M kao najbolji pojedinačni referentnih gena i kombinacija, za RT-qPCR analize 'svih tkiva u želucu', a B2M i B2M-GAPDH kao najbolji singl referentnog gena i kombinaciji, za 'želučanih staničnim linijama karcinoma ". Korištenje tih validiranih referentnih gena treba osigurati točnije tumačenje diferencijalnih genska ekspresija na razini transkripcije kod raka želuca.
Pozadina reverzne transkripcije kvantitativnog real-time lančane reakcije polimeraze (RT-qPCR) je moćan alat za provjeru promatrane ekspresije gena razlike, zbog svoje veće osjetljivosti i specifičnosti. U tradicionalnim ekspresije gena studija, a 'referentna gena', koji se nazivaju i 'unutarnji standard' ili 'ponudi gen "se koristi za normalizaciju. Izraz beta-aktin (ACTB) i glyceraldehydes-3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH), a koristi se u većini studija [1], je izvijestila da se razlikuju s eksperimentalnim uvjetima [2] i kliničkom stanju tkiva studirao (npr
astma), što ti geni neprikladne kao interni standardi za uporabu u normalizaciji ekspresije gena. [3] . Dakle, valjanost referentnog gena izabran za statističku analizu je presudno za izbjegavanje opasnosti od pogrešnog tumačenja podataka i neispravne zaključke [4]
Predloženo je da su najmanje tri razmatranja treba uzeti u obzir prilikom odabira referentne gen: 1) konstantnost njegovu ekspresiju tijekom intervencije, 2) njegova pojačanje učinkovitost i 3) po bogatstvu, koja bi trebala biti slična onoj od gena od interesa [5]. Osim toga, kako bi se osigurala relevantnost, točnost i ispravnost tumačenja RT-qPCR, preporučljivo je da se precizne smjernice za RT-qPCR MIQE (minimum podataka za objavljivanje kvantitativnih real-time PCR eksperiment) treba se pridržavati [6] , Nekoliko alati za statističku analizu, kao što su NormFinder [7], geNorm [8], BestKeeper [9] razvijeni su kako bi pomogli u izboru odgovarajućih referentnih gena. Ovi alati procjenu varijacije u ekspresiji određenog broja potencijalnih referentnih gena i predložiti referencu gen (e) je prikladna za normalizaciju ekspresije gena podataka iz u danoj studiji. Rak pregled želuca je četvrti najčešći rak u svijetu, s prijavljeno 934,000 slučajeva u 2002. godini [10]. Preživljavanje od raka želuca je loša, jer pacijenti često se dijagnosticira tek nakon što je bolest već znatno [11] napredne, što čini rano otkrivanje vrlo važno. Screening s ciljem ranog otkrivanja uključuje endoskopski pregled. Da se potvrdi prisutnost raka, biopsije su uzeti iz sumnjivih tkiva i podvrgnut RT-qPCR za potvrdu abnormalne ekspresiju gena povezanim s karcinomom. No, odgovarajući referentni geni moraju biti identificirani za valjane usporedbe između izraza normalno u odnosu na gene raka. Referentni geni su opisana za RT-qPCR studija u različitim oblicima raka drugih tkiva [1, 12-21]. No čini se da postoji konsenzus o referentnim gena za ekspresiju gena studija raka želuca. Stoga tražili PubMed sa mrežnim uvjetima "rak želuca" "realnom vremenu", i "PCR". Pri procjeni 115 članaka objavljenih od svibnja 2007. do studenog 2009. godine, otkrili smo da GAPDH (53 slučaja; 46,1%) i ACTB (41 slučajeva, 35,7%) bili su najčešći referentni geni u želučanom studija raka; zatim 18S rRNA (8 slučajeva, 7.0%), beta-2-mikroglobulin (B2M, 3 slučaja, 2.6%), hipoksantin fosforibozil transferaze 1 (HPRT1, 2cases; 1,7%), TATA vezujući protein (THP-1 slučaj; 0,9 %), i beta-tubulina (Tubb 1 slučaj; 0,9%). U pet slučajeva (4,3%), vanjski Standardna krivulja je korišten za apsolutnu kvantifikaciju (aq) umjesto normalizirane vrijednosti po referentnog gena.
Ova studija je, dakle, dizajniran kako bi pronašli najbolje referentne gene za genske ekspresije studija u rak želuca , U ovoj studiji ispitivali smo pet referentnih gena koji su najčešće korištene gena u istraživanjima raka želuca (ACTB, GAPDH, B2M, 18S rRNA i HPRT1), a za usporedbu, RPL29, referentna gena koji se koristi u drugim studijama raka u 'non-želuca linije stanica raka', 'želudac staničnim linijama karcinoma', 'normalne želuca tkiva "i" želučanog tkiva tumora "(Tablica 1). Kako odabrati najprikladnije referentna gena iz gornjeg popisa, usporedili smo iskaza glikoproteina nmb (GPNMB), naša ciljanog gena, s onima u gornjoj nazivom popisa mogućih "referenca" genes.Table 1 Potencijalni referentni geni ocijenjeni u ova studija. pregled simbol Gene

GenBank pristupni broj
Gene ime
genomske lokalizaciju
pregled Opis
ACTB pregled NM_001101 pregled Beta-aktin pregled 7p15-12 pregled citoskeleta strukturni protein pregled GAPDH pregled NM_002046 pregled gliceraldehid-3- fosfat dehidrogenaze pregled 12p13 pregled oksidoreduktazna u glikoliza i glukoneogenezu pregled HPRT1 pregled NM_000194 pregled Hipoksantin fosforibozil transferaza 1 pregled Xq26 pregled Metabolički spašavanje purina pregled B2M pregled NM_004048
Beta-2-mikroglobulinje pregled 15q21.1 pregled beta-lanac molekule glavnog sustava tkivne kompatibilnosti klasa I pregled 18S rRNA pregled NR_003286 pregled 18S ribosomalni RNK pregled 22p12 pregled ribosoma podjedinica
RPL29 pregled NM_00992 pregled ribosomskog proteina L29
3p21.3-p21.2
strukturnu sastojak ribosom pregled GPNMB pregled NM_001005340 pregled glikoprotein (transmembranski) nmb pregled 7p15

• Kompjutora analizi karcinom želuca Serijski Analiza ekspresije gena knjižnica otkriva različite profile povezane s ethnicity
• Adjuvantna kemo-zračenja za želučane adenokarcinoma: institucionalni experience