Identifikácia platných referenčných génov pre štúdium génovej expresie ľudskej rakoviny žalúdka reverznej transkripcie-qPCR

identifikáciu platných referenčných génov pre štúdium génovej expresie ľudskej rakoviny žalúdka reverznej transkripcie-qPCR
abstraktné
pozadia
reverznej transkripcii kvantitatívne real-time PCR (RT-qPCR) je účinný spôsob na analýzu génovej expresie. hladiny expresie cieľového génu sú zvyčajne normalizované na trvalo vyjadrené referenčného génu, tiež známy ako vnútorný štandard, v rovnakom vzorke. Avšak, mnoho úsilia bolo vynaložené nebol doteraz v hľadaní vhodných referenčných génov pre štúdium rakoviny žalúdka za použitia RT-qPCR experimentu, aj keď voľba optimálnych referenčných génov je pre interpretáciu výsledkov.
Metódy
Hodnotili sme vhodnosť šiestich možných referenčných génov, beta-aktínu (ACTB), glyceraldehydes-3-fosfátdehydrogenázy (GAPDH), hypoxantín-fosforibosyl-transferázu 1 (HPRT1), beta-2-mikroglobulín (B2M), ribozomálne podjednotky L29 (RPL29) a 18S ribozomálnu RNA (18S rRNA) v 20 párov normálnych a nádorových tkanív žalúdka u pacientov s rakovinou žalúdka a 6 bunkových línií karcinómu žalúdka, pomocou RT-qPCR. . Zamestnáva výraz stability analyzuje pomocou NormFinder a GENOR algoritmov sme určili poradie plnenia týchto referenčných génov a ich premenlivosti hodnôt
Výsledky
tejto štúdii RT-qPCR ukázali, že existujú štatisticky významné (p Hotel < 0,05 ) rozdiely v expresných hladín HPRT1 a 18S rRNA v "zvyčajne zabezpečujú" proti "nádor žalúdka tkanív. Stabilita analyzuje pomocou GENOR naznačujú, B2M-GAPDH, ako najlepší referenčný gén kombinácia pre "bunkových línií karcinómu žalúdka '; RPL29-HPRT1, pre "všetky žalúdočné tkanív"; a ACTB-18S rRNA pre "všetky žalúdok bunkových líniách a tkanivách". NormFinder tiež spoznal B2M ako najlepší referenčného génu pre "bunkových línií karcinómu žalúdka ', RPL29-B2M pre" všetky žalúdočných tkanivách ", a 18S rRNA-ACTB pre" všetky žalúdok bunkových líniách a tkanivách ". Porovnávanie normalizovanej expresie cieľového génu, GPNMB, ukázala, odlišnú interpretáciu cieľovej génovej expresie závislé na najlepšej jednom referenčnom génom alebo kombinácia.
Záver
štúdie overená RPL29 a RPL29-B2M ako najlepší jednotlivých referenčných génov, a kombinácia pre RT-qPCR analýzy "všetky žalúdočných tkanivách" a B2M a B2M-GAPDH ako najlepší jediného referenčného génu a kombinácia pre "rakovinových bunkových línií žalúdka". Použitie týchto potvrdených referenčných génov by mali poskytnúť presnejšie interpretácii diferenciálnych výrazov génov na úrovni transkripcie v rakoviny žalúdka.
Pozadie
reverznej transkripcie kvantitatívnej real-time PCR (RT-qPCR) je výkonný nástroj pre validáciu pozorované rozdiely génovej expresie, pretože jeho väčšej citlivosti a presnosti. V tradičných génovej expresie štúdií, označovaného ako "referenčný gén", tiež nazývaný "vnútorný štandard" alebo "upratovanie gén" sa používa pre normalizáciu. Expresie beta-aktínu (ACTB) a glyceraldehydes-3-fosfátdehydrogenázy (GAPDH), ktorý sa používa vo väčšine štúdií [1], pohybovala sa experimentálne podmienky [2] a klinického stavu tkaniva študovaného (napr
astma), takže tieto gény nevhodné ako interné štandardy pre použitie v normalizáciu génovej expresie [3]. . To znamená, že doba platnosti referenčného génu vybrané pre účely štatistickej analýzy je rozhodujúce pre zamedzenie nebezpečenstva zlé interpretácie dát a neplatné závery [4]
Bolo navrhnuté, že aspoň tri úvahy by mali byť vzaté do úvahy pri výbere referenčnej gen: 1) stálosť jeho expresie v priebehu zákroku, 2) jej účinnosť zosilnenie a 3) jeho množstvo, ktoré by mali byť podobné ako u génov [5]. Okrem toho, s cieľom zabezpečiť relevantnosť, presnosť a správnosť interpretáciou RT-qPCR, je odporúčané, že presné pokyny pre RT-qPCR MIQE (minimálne informácie vydanie kvantitatívnej real-time PCR experimentu) by mali byť dodržiavané [6] , Niektoré nástroje pre štatistickú analýzu, ako je NormFinder [7], GENOR [8], BestKeeper [9], boli vyvinuté s cieľom pomôcť pri výbere vhodných referenčných génov. Tieto nástroje hodnotiť zmeny v expresii radu možných referenčných génov, a naznačujú, aký referenčný gén (y) je vhodná pre normalizáciu génovej expresie dát v danej štúdii. Karcinóm žalúdka
je štvrtou najčastejšou rakovinou na celom svete, pričom hlásenou 934,000 prípadov v roku 2002 [10]. Prežitie na rakovinu žalúdka je zlá, pretože pacienti sú často diagnostikovaná až po tom, čo táto choroba už významne [11] v pokročilom štádiu, čo činí včasné odhalenie veľmi dôležité. Screening zameraná na včasné odhalenie zahŕňa endoskopické vyšetrenie. Aby sa potvrdila prítomnosť rakoviny, biopsia sú prevzaté z podozrivých tkanív a podrobená RT-qPCR pre potvrdenie abnormálne expresie génov súvisiacich s rakovinou. Ale príslušná referenčná gény majú byť identifikované za platné porovnanie medzi výrazmi normálnou oproti génov s rakovinou. Referenčné gény boli popísané pre RT-qPCR štúdií v rôznych nádorov z iných tkanív [1, 12-21]. Zdá sa však, že neexistuje zhoda o referenčných génov pre expresiu génu štúdiách na rakovinu žalúdka. Preto sme hľadali PubMed s okami pojmy "rakovina žalúdka", "real-time" a "PCR". V hodnotení 115 článkov publikovaných od mája 2007 do novembra 2009 sme zistili, že GAPDH (53 prípadov, 46,1%) a ACTB (41 prípadov, 35,7%) boli najčastejšie používané referenčné gény v štúdiách s karcinómom žalúdka; a následne 18S rRNA (8 prípadov; 7,0%), beta-2-mikroglobulín (B2M, 3 prípady, 2,6%), hypoxantín-fosforibosyl-transferázu 1 (HPRT1, 2 prípadov, 1,7%), TATA viažuci proteín (TBP, 1 prípad, 0,9 %) a beta-tubulín (Tubb, 1 prípad, 0,9%). V piatich prípadoch (4,3%), externý štandardná krivka bola použitá pre absolútnu kvantifikácie (AQ) namiesto normalizovaná hodnota od referenčného génu.
Tejto štúdii bol preto navrhnutý tak, aby nájsť najlepšie referenčné gény pre expresiu génu štúdiách u karcinómu žalúdka , V tejto štúdii sme skúmali päť referenčných génov, ktoré boli najčastejšie používané gény v štúdiách rakoviny žalúdka (ACTB, GAPDH, B2M, 18S rRNA a HPRT1) a pre porovnanie, RPL29, referenčné gén použitý v iných štúdiách s rakovinou, v 'nádorových bunkových línií než žalúdok "," žalúdočné rakovinové bunkové línie "," normálny žalúdočné tkaniva "a" nádor žalúdka tkaniva "(tabuľka 1). Aby bolo možné zvoliť najvhodnejšie referenčné gén z vyššie uvedeného zoznamu, sme porovnali výrazy glykoproteín NMB (GPNMB), náš cieľový gén s tými vo vyššie uvedenom názvom zoznamu všetkých možných "referencie" genes.Table 1 Potenciálne referenčné gény hodnotená v táto štúdia.
Gene symbol
GenBank prístupové č
Gene názov
genómovej lokalizáciu
Popis
ACTB
NM_001101
beta-aktínu
7p15-12
cytoskeletálnych štrukturálne proteín
GAPDH
NM_002046
glyceraldehyd-3- fosfátdehydrogenázy
12p13
oxidoreduktázy v glykolýzy a glukoneogenézy
HPRT1
NM_000194
hypoxantín fosforibosyl transferáza 1
Xq26
Metabolický záchrana purínov
B2M
NM_004048
beta-2-mikroglobulín
15q21.1
beta-reťazca molekúl hlavného histokompatibilního komplexu I. triedy
18S rRNA
NR_003286
18S ribozomálnej RNA
22p12
podjednotku ribozómu
RPL29
NM_00992
ribozomálnu proteín L29
3p21.3-p21.2
štrukturálne zložka ribozómu
GPNMB
NM_001005340
glykoproteín (transmembránový) NMB
7p15 || C
podieľa sa oneskorením rastu a zníženie metastatických potenciálnych
metódy
bunkové línie a ľudské tkanivá
Získali sme bunkové línie od American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) alebo kórejské bunkové línie Bank (Soul, Kórea): Šesť žalúdočné nádorové bunkové línie (SNU-216, SNU-638, SNU-719, AGS, MKN-28 a KATOIII), päť non-žalúdočné rakovina bunkové línie (JIMT1, SK-BR-3, SNU-C5, A549, a U87), a dva normálne ľudské bunkové línie (HDF, HMEC). Všetky bunkové línie boli udržiavané v médiu určenom (Mediatech, Manassas, VA, USA), doplnenom 10% fetálnym bovinným sérom (Invitrogen, Calsbard, CA, USA). Dvadsať spárovaných normálnych a nádorových tkanivách žalúdka boli získané endoskopickou resekciou pri vyšetrení pacientov, ktorí dali informovaný súhlas (tabuľka 2). Všetky postupy boli vykonávané v súlade s protokolmi schválenej ústavnej etickou komisiou National Cancer Center a nasledovať vyhlásenie o Helsinki.Table 2 Vlastnosti pacientov, ktorí poskytli žalúdočné rakovinové tkanivá.


počet pacientov
počet pacientov
Celkom
20
Muž
14
Žena
6
Age v čase stanovenia diagnózy (roky)
Rozsah
34-77
Stredná ± SD
60,8 ± 12,1
štádiu ochorenia †
štádiu nádoru
T1
8
T2
8
T3
4
etapa uzol
N0
8
N1
6
N2
2
N3
4
† fáze klasifikácia vychádza zo systému klasifikácie TNM Medzinárodná únia proti rakovine (UICC) [27]. extrakcie
RNA a syntéza cDNA
vzorky tkaniva rakovina žalúdka boli zachované v RNAlater roztoku (Qiagen, Hilden, Nemecko), kým použiť na extrakciu RNA. Celková RNA bola extrahovaná TRIzolu regent podľa protokolu výrobcu (Invitrogen), a pôsobí sa na DNaseI RNeasy Mini kolóny (Qiagen), aby sa odstránil zvyškový genómovej DNA. Koncentrácia a A 260/280 pomer vyčistenej RNA boli merané Nanodrop ND-1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA), a kvalita bola hodnotená na Agilent 2100 Bioanalyzer pomocou RNA 6000 Nano Kit (Agilent Technologies, Santa Clara , CA, USA). Dva ug poly-dT ošetrený celkovej RNA (random hexamérov náterom celkovej RNA k amplifikácii 18S rRNA) boli reverznej transkripcii s Transcriptor reverznej transkriptázy podľa protokolu výrobcu (Roche Applied Science, Mannheim, Nemecko).
Reverzný transkripcie kvantitatívne real -time PCR (RT-qPCR)
v predchádzajúcich správach, sme prijala priméry s dĺžkou amplikónu 200 bp nižšie, okrem ACTB, k zachovaniu konzistencie v účinnosti amplifikácie (tabuľka 3). Primery pre zosilnenie GPNMB boli navrhnuté Primer 3 Software http: //Frodo wi mit edu /primer3 /.... kvantifikované sme mRNA expresie 6 referenčných génov a jedného cieľového génu, pomocou RT-qPCR na svetlo-Cycler 480 II (Roche Applied Science). RT-qPCR reakcia bola vykonaná za použitia 5 ng zriedenej cDNA, 5 pmol každého priméru (tabuľka 3), 5 ul 2 x Light Cycler Fast-DNA MasterPlus SYBR Green Aj v konečnom objeme 10 ul. Podmienky PCR cyklu je stanovená nasledovne: pre-inkubácie po dobu 5 minút pri teplote 95 ° C, a potom 45 cyklov, pričom v každom cykle, vrátane 15 sekúnd pri teplote 95 ° C, 30 sekúnd pri 58 ° C a 30 sekúnd pri 72 ° C. Relatívna kvantifikácia bola vykonaná Light Cycler Software 1.5.0 (Roche Applied Science) na báze "prechodom" hodnoty (KP), ktorý definuje číslo cyklu, pri ktorom fluorescencie signál vzorky prekročí pozadie fluorescencie value.Table 3 Primery pre šesť referenčné gény a cieľový gén.
Gene
Forward primer [5 '→ 3']
obrátenom poradí [5 '→ 3']
kotvenie
exónov
Amplicon
veľkosť
Spanning on
genome

Amplification
efficiency

Reference

ACTB
CATCGAGCACGGCATCGTCA
TAGCACAGCCTGGATAGCAAC
Exon 3
Exon 4
211 bp
652 bp
1,971
[28]
GAPDH
TGCACCACCAACTGCTTA
GGATGCAGGGATGATGTTC
Exon 7
Exon 8
177 bp
370 bp
1.999
[29]
HPRT1
AGACTTTGCTTTCCTTGGTCAG
TCAAGGGCATATCCTACAACAA
Exon 6
Exon 8
151 bp
5120 bp
1,949
[30]
B2M
ACTGAATTCACCCCCACTGA
CCTCCATGATGCTGCTTACA
Exon 2
Exon 4
114 bp
741 bp
1,924
[ ,,,0],28]
18S rRNA
GTAACCCGTTGAACCCCATT
CCATCCAATCGGTAGTAGCG
NA1
151 bp
151 bp
2.000
[31]
RPL29
GGCGTTGTTGACCCTATTTC
GTGTGTGGTGTGGTTCTTGG
Exon 1
Exon 2
120 bp
507 bp
1,937
[16]
GPNMB
TGCGTCCGTGAGAATTCA
TGTGCTCCCTCATGTAAGCA
Exon 1
Exon 2
144 bp
6522 bp
1,945
V dome design2
1. nie je k dispozícii
2. priméry boli navrhnuté Primer 3 s možnosťami ľudského mispriming knižnica skríningu.
Dátové analýzy
štatistické analýzy boli vykonané pomocou GraphPad Prism V4.03 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Normalita bola hodnotená podľa Kolmogorov-Smirnov (KS), D'Agostino-Pearson (DAP) a Shapiro-Wilk (SW) testy. Pre distribúciu nenormálnych distribuovaných skupín, neparametrické Mann-Whitney U-test a Wilcoxonův párový test boli vykonané. P-hodnoty s p Hotel < 0,05 boli považované za štatisticky významné. Použili sme NormFinder V12 [7] a GENOR ™ V3.44 [8] Softvér pre stanovenie expresie hodnoty referenčných génov šiestich kandidátskych.
Výsledky
posúdenia kvality RNA
Hodnotili sme kvality RNA, použitý ako východiskový materiál v niekoľkými spôsobmi. A 260/280 pomer meraný Nanodrop bola 2,08 ± 0,09 (stredná hodnota ± SD), čo potvrdzuje, že RNA bola čistá a bez proteínov. Kvalita RNA označená ako číslo integrity RNA (RIN) od RNA 6000 Nano Labchip pre kultivované bunkové línie bola 9,7 ± 0,2 (priemer ± SD) a 7,4 ± 1,0 pre vzorky pacientov tkaniva. Pre spárovaných vzoriek tkanív žalúdka, sme nezistili žiadny štatisticky významný rozdiel v oboch A 260/280 pomer medzi normálnou (2,05 ± 0,03) a nádoru (2,04 ± 0,05) tkaniva (spárovaná Student t
- test p
-hodnota = 0,214), alebo RIN hodnoty medzi normálnym (7,2 ± 0,5) a nádoru (7,5 ± 1,4) vzorka tkaniva skupiny (spárovaná Student t-test p
-hodnota = 0,340).
Expresná rozsahy referenčných génov kandidátskych a cieľový gén
sme vykonali RT-qPCR experimentu a určili účinnosti amplifikácie každej sady primérov (tabuľka 3). Expresie referenčných génov šiestich kandidátskych, pokiaľ ide o hodnoty Cp vytvorených z RT-qPCR, sú zobrazené na obrázku 1 ako bodovom diagrame. Bunkové línie vykazovali spektrum hodnôt Cp, čo predstavuje výrazný rozdiel v expresii v rozmedzí od 14,56 a 34,89, v závislosti na referenčnej gén použitý. ACTB a GAPDH ukázal najhojnejšia expresiu v oboch "bunkových línií karcinómu žalúdka" a "nádorových bunkových línií ako žalúdočné", ale na rozdiel od HPRT1 ukázal najnižšiu hladinu expresie. Expresia cieľového génu GPNMB hodnôt Cp v rozmedzí od 27,7 do 32,1 v bunkových líniách. Posúdenie normalita ukázalo HPRT1 v "bunkových línií karcinómu žalúdka" a 18S rRNA v "non-žalúdku bunkové línie", nie sú zvyčajne distribuované KS-testu. Preto sme aplikovali neparametrického Mann-Whitneyho U-test pre porovnanie nenormálneho distribuované bezkonkurenčné skupín, a to ukázala výrazné rozdiely vo vyjadrení GAPDH (p
= 0,014) a B2M (p = 0,035
) medzi "bunkových línií karcinómu žalúdka" a "nádorových bunkových línií ako žalúdočné". Obrázok 1 Hladiny expresie referenčných génov šesť kandidátnych zistených pomocou RT-qPCR. Hraničný prechod (KP) hodnoty v "bunkových línií karcinómu žalúdka" a "nádorových bunkových línií non-žalúdočných", "normálny žalúdočné tkanív" a "nádorového tkaniva žalúdka", sú reprezentované ako úrovne expresie. Horizontálne pruh v strede rozptýlených škvŕn naznačuje priemernú hladinu expresie. Čím nižšia je hodnota Cp, tým vyššia je expresie génov.
Ľudskom žalúdka tkaniva tiež ukázala veľké rozdiely v hodnotách Cp v rozmedzí od 13,3 do 29,4 (obrázok 1), s najvyššou expresiu B2M a 18S rRNA a najnižšie expresiou HPRT1 , Expresia cieľového génu GPNMB v Cp v rozmedzí od 28,5 do 34,7 v žalúdočnej tkanive. V test normality, ACTB, HPRT1 a 18S rRNA v skupine "normálne žalúdka tkanív" a všetky gény okrem GAPDH v "nádoru žalúdku tkanív" nasleduje normálne rozdelenie KS-testu. HPRT1, B2M a RPL29 v nádorových tkanivách žalúdku prešiel normality v DAP- a SW-testov. Tak, pre porovnanie nenormálneho distribuované spárované skupiny, vykonali sme neparametrické Wilcoxonův párový test. Výrazné zvýšenie expresie z normálnej na nádor žalúdka tkanív (p Hotel &0,05) boli pozorované v HPRT1 (p = 0,011
) a 18S rRNA (p = 0,021)
, ale nie v ACTB (p
= 0,058), GAPDH (p
= 0,918), B2M (p
= 0,740), alebo RPL29 (p
= 0,208).
Expression stabilita referenčných génov kandidátskych
Aby identifikovať najstabilnejší referenčné gény, sme analyzovali dáta výraz s GENOR a NormFinder. kategorizované sme bunkových línií a tkanív do nasledujúcich skupín - "non-žalúdočné rakovinové bunkové línie", "bunkových línií karcinómu žalúdka ',' normálne žalúdočné tkaniva", "nádor žalúdka tkaniva ',' všetky žalúdočné tkaniva (normálna + nádor žalúdka tkaniva ) "a" všetko rakovina žalúdka bunkové línie a tkanív ". Aplikácia GENOR s východiskovej limit (M) 1,5 vylúčiť nestabilné referenčných génov a nechal minimálny počet vhodných referenčných génov pre každú skupinu na konci (obrázok 2). Ak chcete určiť optimálny počet génov potrebných pre geometrické stredné normalizáciu, porovnali sme variáciu párová (V n /V n + 1) vypočítané GENOR medzi každú kombináciu sekvenčné normalizačných faktorov (NF n a NF n + 1) pre všetky vzorky v skupine. Použili sme predvolenú hodnotu (0,15) pre cut-off [8], pod ktorou zahrnutie ďalších referenčných génov nie je nutné. Vo všetkých skupinách boli hodnotené v tejto štúdii, párové variácie sú už pod hranicou (obrázok 3), čím sa interpretovať tak, že použitie viac ako dvoch optimálne gény nie sú prospešné pre zvýšenie presnosti. Na druhej strane sme zistili koreláciu medzi rozptylu a sklon krivky M-hodnota. V prípade, že "nádorových bunkových línií ako žalúdočné", pridanie GAPDH ako tretí gén do dvoch optimálne predpokladaných génov zvyšuje B2M-RPL29 od 0,0218 hodnotového stability M, s jeho párového rozptylu V 2 /3 0,032. Týmto spôsobom, je koeficient korelácie medzi párového variácie a prírastku M-hodnoty v každom intervale v tejto skupine bol stanovený ako r
2 = 0,956. Pre 'rakovinových bunkových línií žalúdka, "čím vyššia V 4/5 (0,018) a V 5/6 (0,028) hodnoty než V. 2/3 alebo V 3/4 vysvetliť, prečo high-scoring HPRT1 a gény ACTB by mali byť vylúčené. Korelačný koeficient bol r
2 = 0,895. Korelačné koeficienty v "normálnych tkanivách žalúdka", "nádor žalúdka tkanív" a "všetky žalúdočné tkanive" spadal r
2 = 0,971, 0,996 a 0,960, resp. V oddiele všetkých bunkových líniách a tkanivách s rakovinou žalúdka ", sa ukázalo, menej korelácie (R
2 = 0,718). Obrázok 2 Priemerná stability expresie (M) zo šiestich kandidát referenčných génov GENOR analýzy. stability expresie boli vynesené v "nádorových bunkových línií ako žalúdočné" (A), 'bunkových línií karcinómu žalúdka' (B), "normálne žalúdočné tkaniva" (C), "nádorové žalúdočné tkaniva" (D), "všetky žalúdočné tkaniva ' (E) a všetky rakovina žalúdka bunkové línie a tkanivá "(F). Najmenej stabilný referenčný gén (vyššia hodnota M) je na ľavej strane a najstabilnejšie kombináciu (dolná M hodnota) sa nachádza na pravej strane pozemku. Najstabilnejší referenčné gény boli odvodiť postupným vylúčením najmenej stabilné gény.
Obrázok 3 párová analýza variačné šiestich kandidát referenčných génov. Párové variácie hodnoty (Vn /n + 1) bol vytvorený GENOR analýzou. Optimálny počet génov bola stanovená porovnaním Vn /n + 1. Všetky varianty boli pod východiskovú hranicu 0,15.
Tiež aplikovaný program, NormFinder na rovnaké súbory dát a vypočítanými hodnotami stability. Ako je uvedené v tabuľke 4, čo je najnižšia hodnota stability označuje najstabilnejší výraz a my podľa toho zaradil gény. Najlepšie jediný referenčný gén pre každú skupinu je nasledujúci; "Rakovina bunkové línie non-žalúdku" - GAPDH (0,036), "žalúdočné nádorových bunkových línií" - B2M (0,014), "normálne žalúdočné tkaniva '- RPL29 (0,028)," nádor žalúdka tkaniva' - RPL29 (0,028), "všetky žalúdočné tkaniva "- RPL29 (0,032) a všetky žalúdok bunkové línie a tkanivá" - ACTB (0,029). Hodnosť referenčných génov pre "bunkových línií karcinómu žalúdka" bol identický s tým z analýzy GENOR, ale mierne líšia v iných kategóriách. NormFinder tiež odhaduje, že najlepšiu kombináciu referenčných génov sub-zoskupovania v "všetkých žalúdočných tkanivách" - RPL29-B2M (0,005) a "všetky žalúdok bunkových líniách a tkanivách '- 18S rRNA-B2M (0,013) .Table 4 Poradie kandidát jediný referenčný gény na základe ich hodnoty stability vypočítaných z NormFinder.
rakovina žalúdka Non-bunkové línie
rakovina žalúdka bunkových línií
Normálny žalúdočnej tkaniva
nádor žalúdka tkaniva
Všetky žalúdočné tkaniva

Všetky žalúdok bunkové línie + tkaniva
génu v poradí,
hodnota stability
génu v poradí,
hodnota stability
Gene v zostupnom poradí
hodnota stability
génu v zostupnom poradí
hodnotu stability
génu v zostupnom poradí
hodnotu stability

Gene v zostupnom poradí
stability value

GAPDH
0.036
B2M
0.014
RPL29
0.028
RPL29
0.028
RPL29
0.032
ACTB
0.029
RPL29
0.052
GAPDH
0.021
B2M
0.035
B2M
0.039
B2M
0.041
HPRT1
0.038
B2M
0.053
RPL29
0.029
HPRT1
0.038
HPRT1
0.042
HPRT1
0.044
RPL29
0.068
HPRT1
0.110
18S rRNA
0,036
ACTB
0,043
ACTB
0,065
ACTB
0,052
18S rRNA
0,071
18S rRNA
0,112
ACTB
0,060
18S rRNA
0,062
18S rRNA
0,067
18S rRNA
0.055
GAPDH
0.082
ACTB
0.143
HPRT1
0.115
GAPDH
0.140
GAPDH
0.147
GAPDH
0.140
B2M
0.084
Cieľová profilov génovej expresie sú ovplyvnené referenčné gény použité pre normalizáciu
Na vyhodnotenie referenčných génov v reálnej situácii, sme sa rozhodli "žalúdočné rakovina bunkové línie", "všetky žalúdočné tkaniva" a "všetky žalúdka bunkových líniách a tkanivách ', pretože zameranie rakovinou výskumníkov na porovnanie génovej expresie v normálnych a nádorových tkanivách, ako aj žalúdok vznikol rakovinových bunkových línií pre štúdiu in vitro. Použili sme jediné referenčné gény a kombinácie v relatívnej kvantifikácie (RQ) z GPNMB
ako cieľový gén. GPNMB je transmembránový glykoproteín a hrá úlohu kooperatívne s p53 a cytokíny sprostredkované transkripčné faktory v diferencovaných buniek imunitného systému [22] a rakoviny prsníka [23]. RQ z GPNMB expresie po šiestich jednotlivých referenčných génov a B2M-GAPDH kombinácii v "bunkových línií karcinómu žalúdka v porovnaní so" (obrázok 4). RQS podľa B2M, GAPDH, ako jediné referenčné gén a B2M-GAPDH, ktorý sa predpokladá, že najoptimálnejšie kombinácia referenčných génov pre "bunkových línií karcinómu žalúdka a to o GENOR ukázala podobné high-low vzory (obrázok 4A, B a 4G). V porovnaní s tým RQ od RPL29 následok zdanlivo zvýšenej expresie v SNU-216, ale znižuje expresiu v SNU-719 bunkových línií (obr 4C). RQ by 18S rRNA tiež ukázal zvýšenú expresiu v SNU-216, ale znižuje expresiu v MKN-28 (obrázok 4D). RQ podľa ACTB a HPRT1 vykazovali extrémne znížená expresie v SNU-719 a KATOIII (Obrázok 4E a 4F). Obrázok 4 Relatívna kvantifikácia GPNMB expresie v bunkových líniách karcinómu žalúdka, závisí od rôznych referenčných génov. GPNMB expresie v nádorových bunkových línií šesť žalúdočných boli normalizované šiestich jednotlivých referenčných génov a najlepšiu kombináciu odvodenú GENOR (priemer ± SD); normalizované B2M (A), ktoré GAPDH (B), ktoré RPL29 (C), zo strany 18S rRNA (D), ktoré ACTB (E), HPRT1 (F) a geometrický priemer B2M-GAPDH kombinácii (G).
rozdiel GPNMB RQ medzi normálnymi a nádorovými žalúdočných tkanivách bol pacient závislý. RQ je vyššia u niektorých nádorov, ale s opačným ostatných. RQ normalizované každým šesť jediného referenčného génu nepreukázalo presne rovnaký vzor. V prípade normalizáciou RPL29, ktorý bol predpovedal ako najstabilnejší jediného referenčného génu v NormFinder a najstabilnejší kombinácii s HPRT1 v GENOR, high-low vzor RQ rozdiel medzi normálnou a nádoru (Obrázok 5A) bola podobná ako RQ podľa HPRT1 hoci boli rozdiely u troch pacientov (obrázok 5B). RQ podľa B2M (obrázok 5c) a 18S rRNA (obrázok 5d) ukázal iný vzor z vysoko hodnotené jednotlivé referenčných génov u viac pacientov. S ACTB (Obrázok 5E) GAPDH (obrázok 5F), rozdiel sa stal väčší; existovali rozdiely v 35% z celkového počtu pacientov. RQ normalizované geometrickými pomocou kombinácie RPL29-HPRT1 z GENOR (obrázok 5G) a RPL29-B2M z NormFinder (obrázok 5H) vykazovala podobnú štruktúru. Ak je celková zmena fold (Tumor /Normal) bol porovnávaný, RQ z GPNMB podľa B2M (T /N = 2,46 ×, párový t-test p
= 0,017) a RPL29-B2M (T /N = 2.08 x, p
= 0,025) vykázali významný nárast od normálu pre nádor žalúdka tkanív. RQ podľa RPL29 (T /N = 2,23 x, p
= 0,071), HPRT1 (T /N = 1,34 x, p
= 0,258), ACTB (T /N = 1,60 x, p =
0,395), 18S rRNA (T /N = 1,36 x, p
= 0,527) a RPL29-HPRT1 (T /N = 1,76 x, p
= 0,086) tiež ukázala zvýšenie GPNMB expresie v nádorových tkanivách, ale žalúdku nebol štatisticky významný. V porovnaní s tým sa ukázalo, proti smeru expresie rozdielu (T /N = 0,75 x, p
= 0,637), ktoré GAPDH. To naznačuje, že expresia GAPDH v nádorových tkanivách žalúdku sú veľmi zvýšené v porovnaní s ostatnými referenčných génov. Tieto výsledky tiež naznačujú, že RQ údaje cieľový gén by mohli byť interpretované rôzne v závislosti na referenčných génoch používaných pre normalizáciu. Obrázok 5 Relatívna kvantifikácia GPNMB expresie v normálnych a nádorových tkanív žalúdka závisí na rôznych referenčných génov. GPNMB expresie v nádorových tkanivách žalúdku (pevná látka bar: normálny, otvorený bar: tumor) boli normalizované šiestich jednotlivých referenčných génov a dvoch kombinácií odvodených od GENOR a NormFinder (priemer ± SD); normalizovaná podľa RPL29 (A), podľa HPRT1 (B) tým, že B2M (C), podľa 18S rRNA (d), podľa ACTB (E), GAPDH (F) geometrický priemer RPL29-HPRT1 (G) a RPL29-B2M (H).
pre "všetky bunkových líniách a tkanivách s rakovinou žalúdka", NormFinder a GENOR predpovedal 18S rRNA-B2M a 18S rRNA-ACTB ako najlepšia kombinácia. Vzor GPNMB RQ o geometrický priemer týchto kombinácií bola podobná medzi nimi. GPNMB RQS medzi "bunkových línií karcinómu žalúdka" a "všetkých žalúdočných tkanivách by mohli byť porovnané v rámci rovnakého rozsahu s 18S rRNA-ACTB, ale tam bol jeden log objednávky rozdielu kombináciou 18S rRNA-B2M. Vzorce RQ in 'rakovinových bunkových línií žalúdočných "(obr 6a, 6b) boli podobné RQ podľa B2M-GAPDH (obr 4G), ale RQ o" všetkých žalúdočných tkanivách "by 18S rRNA-ACTB (obrázok 6B) boli odlišné od ( obrázok 5G, 5H). Zdá sa, že výrazne zvýšila 18S rRNA expresiu v nádorových tkanivách žalúdku (obrázok 1), by mohli prispieť k tomuto výsledku. Takto, aj keď tieto kombinácie sa predpovedať, ako najlepšie, ale nie sú vhodné pre interpretáciu dát. Obrázok 6 Relatívna kvantifikácia GPNMB expresie v bazéne všetkých bunkových línií a tkanivách karcinómu žalúdka, závisí na rôznych kombinácií referenčných génov. GPNMB expresie v bunkových líniách karcinómu žalúdka a žalúdočné tkaniva (pevná látka bar: normálny, otvorený bar: tumor) boli normalizované pomocou dvoch kombinácií odvodených od GENOR a NormFinder (priemer ± SD); normalizované 18S rRNA-ACTB vo rakovina žalúdka bunkových línií (A) a žalúdočných tkanivách (C) a normalizovať 18S rRNA-B2M v žalúdku rakovina bunkové línie (B) a žalúdočných tkanivách (D).
Diskusia
diferenciálu génu v rakoviny, u ktorých z transkriptomu štúdia naznačuje, že niektoré špecifické gény môžu byť zapojené do vzniku nádorov a metastázovaniu rakoviny. RT-qPCR je robustný a špecifická metóda pre overenie totožnosti kandidátnych génov rakoviny žalúdka, pretože detekuje aj veľmi slabé signály z veľmi malého množstva biopsiou vzoriek v prípade, že pacient je v ranom štádiu rakoviny. Avšak, v prípade neexistencie príslušných referenčných génov, získané dáta sú možné sa pýtať, čo vedie k nesprávnej interpretácii. Pred touto štúdiou, žiadna platná referenčné gén bol identifikovaný pre "bunková línia karcinómu žalúdka" alebo "tkaniva karcinómu žalúdka ', ale ACTB a GAPDH boli použité najčastejšie až doteraz bez ohľadu na ich nekonzistentných výrazov v rôznych experimentálnych prostredia a zdravotný stav , Skúmali sme, okrem ACTB a GAPDH, štyri ďalšie referenčné gény, HPRT1, RPL29 18S rRNA a B2M, ktoré boli hodnotené ako referenčné gény v nedávnych štúdiách pre iné ľudské rakoviny.
, Je zrejmé, že voľba vhodného súboru primérov je dôležitým východiskom pre získanie presných výsledkov. Zvažovali sme nasledujúce body pri výbere primery. Po prvé, sme prijali sady primérov, ktoré boli predtým hlásené majú alebo navrhnuté tak, aby vlastniť dĺžku amplikónu okolo 200 bp. Po druhé, všetky sady primérov boli potrebné na rozpätie aspoň dva susedné exóny s výnimkou 18S rRNA gén, ktorý nie je mRNA. Vyššie uvedené dva body sú spojené s účinnosťou amplifikácie. Je nutné, aby referenčné gén a cieľový gén sa udržala podobná amplifikačnej účinnosti [13]. Dĺžka amplikón je úzko súvisí s účinnosťou amplifikácie [24]. Tak by sa dalo očakávať podobnú účinnosť od amplikónu rovnakej dĺžky a vyššiu účinnosť z kratšej amplikónu. Prínosom kratšie amplikónu, 70-250 bp, v RT-qPCR je, že zosilnenie je "nezávislé" kvality RNA [25]. Účinnosť amplifikácie je tiež ovplyvnená znečistením gDNA, pretože kompetitívne väzby primérov pôsobí ako limitujúci faktor spôsobujúci pokles účinnosti amplifikácie [13]. V tejto súvislosti je liečba DNaseI počas čistenia RNA je veľmi dôležité, aby sa zabránilo zosilnenie zvyškového gDNA, ale to nemusí byť úplne účinná. Preto sa naša druhá úvaha pomáha odhaliť prípadné kontaminácii gDNA s rôznou veľkosťou amplikónu. Potvrdilo sa, že každý dopredný a spätný primer je ukotvený na inom exóne podľa Blat vyhľadávanie na ľudskom genóme sekvencie, a tiež to, že neexistuje žiadny amplifikovanej produkt kontaminácii gDNA s predĺženou dĺžkou amplikónu (tabuľka 2). Okrem toho sme tiež zabezpečiť vysokú kvalitu RNA, východiskové látky, v niekoľkými spôsobmi. Tiež sme vykonali experimenty trojmo pre každý gén a každú vzorku.
Od vývoja qPCR niekoľko štatistické programy boli vyvinuté pre identifikáciu optimálnych referenčných génov. Vybrali sme GENOR a NormFinder pre analýzu stability šiestich referenčných génov sme študovali. GENOR Program počíta M-hodnôt na základe priemerného párového variácie určitého génu v porovnaní so všetkými ostatnými študovaných referenčných génov kandidátskych a patrí im [8]. V porovnaní s NormFinder prijíma stratégiu s názvom "Model založený na prístup k odhadu výrazu variácie" [7].

• In silico analýzy karcinóm žalúdka Sériová analýza génovej expresie knižníc odhaľuje rôzne profily spojené s etnickou príslušnosť
• Adjuvantná chemo-žiarenia pre adenokarcinóm žalúdka: inštitucionálne experience