Identifikation af gyldig reference gener for genekspression studier af menneskelig mavekræft ved revers transkription-qPCR

Identifikation af gyldig reference gener for genekspression studier af menneskelige mave kræft ved revers transkription-qPCR
Abstract
Baggrund
Reverse transskription kvantitativ realtid polymerasekædereaktion (RT-qPCR) er en kraftfuld metode til analyse af genekspression. Målgenekspression niveauer er sædvanligvis normaliseret til en konsekvent udtrykt henvisning gen også kendt som intern standard, i den samme prøve. Imidlertid har mange kræfter ikke brugt hidtil i søgningen efter reference- gener egnede til studiet af mavekræft hjælp RT-qPCR, selv om udvælgelse af optimale referencepunkter gener er afgørende for fortolkningen af ​​resultaterne.
Metoder
Vi vurderede egnetheden af ​​seks mulige referencepunkter gener, beta-actin (ACTB), glyceraldehyder-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH), hypoxanthin-phosphoribosyl transferase 1 (HPRT1), beta-2-mikroglobulin (B2M), ribosomale subunit L29 (RPL29) og 18S ribosomalt RNA (18S rRNA) i 20 normale og tumor mavevæv par af mavekræft patienter og 6 mavekræft cellelinjer, ved RT-qPCR. . Anvender udtryk stabilitet analyser bruger NormFinder og geNorm algoritmer vi bestemt rækkefølgen af ​​udførelsen af ​​disse referencepunkter gener og deres variation værdier
Resultater
Dette RT-qPCR undersøgelse viste, at der er statistisk signifikant (p
< 0,05 ) forskelle i ekspressionsniveauerne af HPRT1 og 18S rRNA i 'normal-' versus 'tumor mave væv ". Stabiliteten analyser af geNorm tyder B2M-GAPDH, som bedste reference gen kombination for 'mavekræft cellelinjer «; RPL29-HPRT1, for 'alle mave væv "; og ACTB-18S rRNA, for 'alle maven cellelinjer og væv «. NormFinder identificerede også B2M som rettesnor genet for 'mavekræft cellelinjer ", RPL29-B2M for» alle mave væv «, og 18S rRNA-ACTB for» alle mave cellelinjer og væv'. Sammenligningerne af normaliseret udtryk af målgenet, GPNMB viste anden fortolkning af target genekspression afhænger bedste enkelt henvisning gen eller kombination.
Konklusion
Denne undersøgelse valideret RPL29 og RPL29-B2M som den bedste single reference- gener og kombination, for RT-qPCR-analyse af 'alle mave væv ", og B2M og B2M-GAPDH som den bedste fælles reference gen og kombinationen, for' mavekræft cellelinjer '. Anvendelse af disse validerede reference- gener bør give mere præcis fortolkning af differentierede gen udtryk på transskription niveau i mavekræft.
Baggrund
Reverse transskription kvantitativ real-time polymerasekædereaktion (RT-qPCR) er et kraftfuldt værktøj til validering af observerede genekspression forskelle, på grund af dets større følsomhed og specificitet. I traditionelle genekspressionsstudier, er en 'henvisning gen «, også kaldet' intern standard" eller "husholdning gen«, der anvendes til normalisering. Ekspressionen af ​​beta-actin (ACTB) og glyceraldehyder-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH), der anvendes i de fleste undersøgelser [1], blev rapporteret at variere med forsøgsbetingelser [2] og klinisk status af det undersøgte væv (f.eks
astma), hvilket gør disse gener uegnede som interne standarder til brug i normalisering af genekspression [3]. . Således gyldigheden af ​​referencen gen valgt til statistisk analyse er afgørende for at undgå faren for fejlfortolke data og ugyldige konklusioner [4]
Det blev foreslået, at der skal tages hensyn til mindst tre overvejelser i at vælge en reference gen: 1) konstans dets ekspression i hele indgriben, 2) dens amplifikationseffektivitet og 3) sin overflod, som bør være den samme som af generne af interesse [5]. Ud over at sikre relevans, nøjagtighed og korrekt fortolkninger af RT-qPCR, anbefales det, at de præcise retningslinjer for RT-qPCR MIQE (Minimum Information til Offentliggørelse af Quantitative Real-Time PCR Experiment) bør overholdes [6] . Flere værktøjer til statistisk analyse, såsom NormFinder [7], geNorm [8], BestKeeper [9] er blevet udviklet til at hjælpe i valget af egnede reference- gener. Disse værktøjer vurdere variationer i ekspressionen af ​​en række potentielle reference- gener og foreslå som der henvises gen (er) er passende for normalisering af genekspression data i en given undersøgelse.
Mavekræft er den fjerde mest almindelige cancer verdensplan med en rapporteret 934,000 tilfælde i 2002 [10]. Overlevelse af mavekræft er dårlig, eftersom patienter ofte diagnosticeres kun efter, at sygdommen allerede har gjort betydelige fremskridt [11], hvilket gør tidlig påvisning meget vigtigt. Screening sigter mod tidlig påvisning involverer endoskopisk undersøgelse. At bekræfte tilstedeværelsen af ​​cancer, er biopsier taget fra mistænkte væv og underkastet RT-qPCR at bekræfte unormal ekspression af kræftrelaterede gener. Men passende reference- gener skal identificeres for gyldige sammenligninger mellem udtryk for normal versus cancer gener. Reference- gener er blevet beskrevet for RT-qPCR undersøgelser i forskellige cancertyper i andre væv [1, 12-21]. Der synes imidlertid ikke at være nogen konsensus om reference- gener for genekspressionsstudier i mavekræft. Vi søgte derfor PubMed med mesh vilkår "gastrisk kræft", "real-time", og "PCR". I en evaluering af 115 artikler offentliggjort fra maj 2007 til november 2009 fandt vi, at GAPDH (53 sager, 46,1%) og ACTB (41 tilfælde; 35,7%) var de mest brugte reference- gener i gastrisk undersøgelser kræft; efterfulgt af 18S rRNA (8 tilfælde; 7,0%), beta-2-mikroglobulin (B2M, 3 tilfælde, 2,6%), hypoxanthin-transferase 1 (HPRT1, 2cases, 1,7%), TATA bindende protein (TBP, 1 tilfælde; 0,9 %), og beta-tubulin (tubb, 1 tilfælde; 0,9%). I fem tilfælde (4,3%), var ekstern standardkurve bruges til absolut kvantificering (AQ) i stedet for normaliserede værdi ved henvisning gen.
Den foreliggende undersøgelse er derfor designet til at finde bedste reference gener for de genekspressionsstudier i mavekræft . I denne undersøgelse undersøgte vi de fem reference- gener, der har været mest brugte gener hos mavekræft undersøgelser (ACTB, GAPDH, B2M, 18S rRNA, og HPRT1) og til sammenligning, RPL29, en reference gen anvendt i andre undersøgelser kræft i »ikke-mavekræft cellelinjer ',' mave kræft cellelinier ',' normale mave væv 'og' tumor mave væv '(tabel 1). For at vælge den mest hensigtsmæssige henvisning gen fra ovenstående liste, vi sammenlignede udtryk for glycoprotein NMB (GPNMB), vores mål gen, med dem i ovenstående navngivet liste over muligt "reference" genes.Table 1 Potentielle reference- gener evalueret i denne undersøgelse.
Gene symbol
GenBank No.
Gene navn
Genomisk lokalisering

beskrivelse
ACTB
NM_001101
Beta-actin
7p15-12
cytoskeletale strukturelle protein
GAPDH
NM_002046
Glyceraldehyd-3- fosfatdehydrogenase
12p13
oxidoreductase i glykolyse og glukoneogenese
HPRT1
NM_000194
Hypoxanthin phosphoribosyltransferase 1
Xq26
Metabolisk bjærgning af puriner
B2M
NM_004048
Beta-2-mikroglobulin
15q21.1
Beta-kæde af større histokompatibilitetskompleks klasse i-molekyler
18S rRNA
NR_003286
18S ribosomale RNA
22p12
ribosom underenhed
RPL29
NM_00992
ribosomprotein L29
3p21.3-p21.2
Strukturel bestanddel af ribosomet
GPNMB
NM_001005340
glykoprotein (transmembrane) NMB
7p15 || C
involveret i vækst forsinkelse og reduktion af metastatisk potentiale
Metoder
cellelinjer og humane væv
Vi opnåede cellelinier fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) eller koreansk cellelinje Bank (Seoul, Korea): Seks mave tumorcellelinier (SNU-216, SNU-638, SNU-719, AGS, MKN-28 og KATOIII), fem ikke-mavekræft cellelinjer (JIMT1, SK-BR-3, SNU-C5, A549, og U87), og to normale humane cellelinjer (HDF, HMEC). Alle cellelinier blev opretholdt i udpegede medier (Mediatech, Manassas, VA, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen, Calsbard, CA, USA). Tyve matchede par af normale og tumor mave væv blev opnået ved endoskopisk resektion under behandlingen af ​​de patienter, der gav informeret samtykke (tabel 2). Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med protokoller, der er godkendt af den institutionelle gennemgang bestyrelsen for National Cancer Center og efter angivelsen af ​​Helsinki.Table 2 Funktioner i patienter, der har givet mavekræft væv.


Antal patienter
Antal patienter
Total
20
Mand
14
Female
6
Alder ved diagnose (år)
Range
34-77
Mean ± SD
60,8 ± 12,1
Disease Stage †
Tumor etape
T1
8
T2
8
T3
4
Node fase
n0
8
N1
6
N2
2
N3
4
† Stage klassifikation følger TNM klassificeringssystem af International Union Against Cancer (UICC) [27].
RNA ekstraktion og cDNA syntese
mavekræft vævsprøver blev bevaret i RNAlater opløsning (Qiagen, Hilden, Tyskland), indtil bruge til RNA-ekstraktion. Totalt RNA blev ekstraheret med TRIzol Regent ifølge fabrikantens protokol (Invitrogen), og behandles med DNasel på RNeasy Mini-søjle (Qiagen) til fjernelse af resterende genomisk DNA. Koncentration og A 260/280 forhold af renset RNA blev målt med NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA), og kvaliteten blev vurderet på Agilent 2100 Bioanalyzer hjælp RNA 6000 Nano kit (Agilent Technologies, Santa Clara , CA, USA). To ug poly-dT primet total RNA (tilfældig hexamer primede total RNA for 18S rRNA-amplifikation) blev revers-transkriberet med Transcriptor revers transkriptase ifølge fabrikantens protokol (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland).
Revers transkription kvantitativ real -tid PCR (RT-qPCR)
Baseret på tidligere rapporter, vi vedtog primere med amplicon længde under 200 bp, bortset ACTB, at bevare sammenhængen i forstærkning effektivitet (tabel 3). De primere til forstærkning af GPNMB designet af Primer 3 software http: //frodo wi mit edu /primer3 /.... Vi kvantificeret mRNA ekspressionen af ​​6 referencepunkter gener og en target-gen ved RT-qPCR på en lys-Cycler 480 II (Roche Applied Science). RT-qPCR reaktionen blev udført under anvendelse af 5 ng fortyndet cDNA, 5 pmol af hver primer (tabel 3), 5 pi 2 × Lys-Cycler Fast DNA MasterPlus SYBR Green I i slutvolumen på 10 pi. PCR cyklusbetingelser blev fastsat som følger: forinkubering i 5 minutter ved 95 ° C efterfulgt af 45 cykler, med hver cyklus med 15 sekunder ved 95 ° C, 30 sekunder ved 58 ° C og 30 sekunder ved 72 ° C. Relativ kvantificering blev udført af Light Cycler Software 1.5.0 (Roche Applied Science) baseret på 'Crossing Punkt «(Cp) værdi, der definerer cyklus nummer, hvor fluorescens-signalet af prøven er mere end en baggrund fluorescens value.Table 3 Primere til seks reference- gener og en target-gen.
Gene
Forward primer [5 '→ 3']
Omvendt sekvens [5 '→ 3']
Forankring
Exon
Amplikon
størrelse
Spanning on
genome

Amplification
efficiency

Reference

ACTB
CATCGAGCACGGCATCGTCA
TAGCACAGCCTGGATAGCAAC
Exon 3
Exon 4
211 bp
652 bp
1,971
[28]
GAPDH
TGCACCACCAACTGCTTA
GGATGCAGGGATGATGTTC
Exon 7
Exon 8
177 bp
370 bp
1,999
[29]
HPRT1
AGACTTTGCTTTCCTTGGTCAG
TCAAGGGCATATCCTACAACAA
Exon 6
Exon 8
151 bp
5120 bp
1,949
[30]
B2M
ACTGAATTCACCCCCACTGA
CCTCCATGATGCTGCTTACA
Exon 2
Exon 4
114 bp
741 bp
1,924
[ ,,,0],28]
18S rRNA
GTAACCCGTTGAACCCCATT
CCATCCAATCGGTAGTAGCG
NA1
151 bp
151 bp
2.000
[31]
RPL29
GGCGTTGTTGACCCTATTTC
GTGTGTGGTGTGGTTCTTGG
Exon 1
Exon 2
120 bp
507 bp
1,937
[16]
GPNMB
TGCGTCCGTGAGAATTCA
TGTGCTCCCTCATGTAAGCA
Exon 1
Exon 2
144 bp
6522 bp
1,945
I hus design2
1. Ikke tilgængelig
2. Primere blev designet af Primer 3 med human mispriming bibliotek screening muligheder.
data analyser
statistiske analyser blev udført med GraphPad Prism V4.03 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Normalitet blev vurderet i henhold til Kolmogorov-Smirnov (KS), D'Agostino-Pearson (DAP), og Shapiro-Wilk (SV) tests. Til distribution af ikke-normale distribuerede grupper, ikke-parametrisk Mann-Whitney U-test og Wilcoxon-test blev udført. P-værdier med p
< 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Vi anvendte NormFinder V12 [7] og geNorm ™ V3.44 [8] software til at bestemme udtrykket værdier på seks kandidat reference- gener.
Resultater
RNA kvalitetsvurdering
Vi vurderet kvaliteten af ​​RNA anvendt som udgangspunkt materiale på flere måder. A 260/280 forholdet målt ved NanoDrop var 2,08 ± 0,09 (gennemsnit ± SD) bekræfter, at RNA var rent og protein-fri. RNA kvalitet rapporteret som RNA integritet nummer (RIN) ved RNA 6000 Nano Labchip for dyrket cellelinje var 9,7 ± 0,2 (middelværdi ± SD), og 7,4 ± 1,0 for vævsprøver fra patienter. For de matchede par af maven vævsprøver, vi fandt ikke nogen statistisk signifikant forskel i enten A 260/280 forholdet mellem normal (2,05 ± 0,03) og tumor (2,04 ± 0,05) væv (parret Students t
- test p
-værdi = 0,214) eller RIN værdier mellem normal (7,2 ± 0,5) og tumor (7,5 ± 1,4) vævsprøve grupper (parret Students t
-test p
-værdi = 0,340).
Expression intervaller af kandidat reference- gener og målgen
Vi udførte RT-qPCR og bestemmes amplificeringseffektiviteten af ​​hver primer sæt (tabel 3). Ekspressionen af ​​seks kandidat reference- gener i form af Cp-værdier genereret fra RT-qPCR, vises i figur 1 som scatter plot. Cellelinjerne udviste et spektrum af Cp-værdier, der repræsenterer en bred forskel i ekspression på mellem 14,56 og 34,89, afhængigt af reference-genet anvendes. ACTB og GAPDH viste mest rigelige udtryk i både 'mavekræft cellelinjer «og» ikke-mavekræft cellelinjer ", men i modsætning HPRT1 viste laveste udtryk niveau. Udtrykket af target gen GPNMB i Cp-værdier varierede fra 27,7 til 32,1 i cellelinjer. Den normalitet vurdering viste, HPRT1 i 'mavekræft cellelinjer' og 18S rRNA i »ikke-mave cellelinjer 'normalt ikke distribueres af KS-test. Således anvendte vi ikke-parametrisk Mann-Whitney U-test til sammenligning af ikke-normale distribuerede uovertruffen grupper, og det viste signifikante forskelle i udtryk for GAPDH (p
= 0,014) og B2M (p
= 0,035) mellem 'mave kræft cellelinjer «og» ikke-mavekræft cellelinjer'. Figur 1 Expression niveauer for seks kandidat referencepunkter gener detekteret ved RT-qPCR. Overgangssted (Cp) værdier i 'mavekræft cellelinjer «og» ikke-mavekræft cellelinjer', 'normale mave væv' og 'tumor mave væv' er repræsenteret som udtryk niveau. Vandret bar i midten af ​​spredte pletter indikerer gennemsnitlige udtryk niveau. Jo lavere Cp-værdi, desto højere er ekspressionen af ​​gener. Salg menneskelige mave væv viste også store variationer i Cp-værdier fra 13.3 til 29,4 (figur 1), med højeste ekspression af B2M og 18S rRNA og laveste ekspression af HPRT1 . Udtrykket af target gen GPNMB i Cp varierede fra 28,5 til 34,7 i mave væv. I normalitet test, ACTB, HPRT1, og 18S rRNA i "normale mave væv 'gruppe, og alle gener bortset GAPDH i" tumor mave væv' efterfulgt normalfordeling af KS-test. HPRT1, B2M, og RPL29 i tumor mave væv bestået normalitet i DAP- og SW-tests. Således til sammenligning ikke-normalfordelte parrede grupper, udførte vi ikke-parametrisk Wilcoxon signed rank test. Signifikant udtryk stigning fra normal til tumor mave væv (p
< 0,05) blev observeret i HPRT1 (p
= 0,011) og 18S rRNA (p
= 0,021), men ikke i ACTB (p
= 0,058), GAPDH (p
= 0,918), B2M (p
= 0.740), eller RPL29 (p
= 0,208).
Expression stabilitet af kandidat reference- gener
for at identificere de mest stabile referencepunkter gener, analyserede vi udtrykket data med geNorm og NormFinder. Vi kategoriseret de cellelinjer og væv i følgende grupper - »ikke-mavekræft cellelinjer ',' mave kræft cellelinjer ',' normale mave væv ',' tumor mave væv ',' alle mave væv (normal + tumor mave væv ) "og" alle mavekræft cellelinjer og væv «. Anvendelsen af ​​geNorm med standard grænse (M < 1,5) udelukket ustabile referencepunkter gener og venstre minimalt antal egnede referenceprodukter gener for hver gruppe i enden (figur 2). For at bestemme det optimale antal af gener, der er nødvendige for geometrisk gennemsnit normalisering, vi sammenlignet parvis variation (V n /V n + 1) beregnes som geNorm mellem hver kombination af sekventielle normaliseringsfaktorer (NF n og NF n + 1) for alle prøver i gruppen. Vi anvendte standard tærskel (0,15) for cut-off [8], under hvilken ikke er nødvendigt inddragelse af yderligere reference- gener. I alle grupper blev evalueret i denne undersøgelse, parvise variationer er allerede under tærsklen (figur 3), blev det således fortolket anvender mere end to optimale gener ikke gavnligt at forbedre nøjagtigheden. På den anden side, fandt vi en korrelation mellem varians og hældningen af ​​M-værdi kurve. I tilfælde af ikke-mave cancercellelinier ', tilsætning af GAPDH som det tredje gen til de to optimalt forventede gener B2M-RPL29 stiger med 0,0218 af stabiliteten værdi M, med sit par-wise varians V 2 /3 af 0.032. På denne måde er koefficienten af ​​korrelationen mellem parvis variation og tilvæksten af ​​M-værdi ved hvert interval i denne gruppe var bestemt til at være r
2 = 0,956. For 'mavekræft cellelinjer,' den højere V 4/5 (0,018) og V 5/6 (0,028) værdier end V 2/3 eller V 3/4 forklare, hvorfor high-scoring HPRT1 og ACTB gener bør udelukkes. Korrelationskoefficienten var r
2 = 0,895. Korrelationskoefficienterne i 'normale mave væv', 'tumor mave væv' og 'alle mave væv' var r
2 = 0,971, 0,996 og 0,960 henholdsvis. I 'alle mavekræft cellelinjer og væv ", det viste mindre korrelation (r
2 = 0,718). Figur 2 Gennemsnitlig udtryk stabilitet (M) af seks kandidat referencepunkter gener ved geNorm analyser. Expression stabilitet blev plottet i »ikke-mavekræft cellelinjer '(A),' mave kræft cellelinjer '(B),' normale mave væv« (C), 'tumor mave væv "(D)," alle mave væv' (E) og 'all mavekræft cellelinje og væv (F). Den mindste stabile henvisning gen (højere M værdi) er til venstre, og den mest stabile kombination (lavere M værdi) er på højre af plottet. Mest stabile referencepunkter gener udledt ved trinvis udelukkelse af de mindst stabile gener.
Figur 3 Pair-wise variation analyse af seks kandidat reference- gener. Parvise variation værdi (Vn /n + 1) blev genereret ved geNorm analyse. Optimale antal gener blev estimeret ved at sammenligne Vn /n + 1. Alle variationer var under standard grænse på 0,15.
Vi anvendte også NormFinder program til de samme datasæt og beregnede stabilitet værdier. Som vist i tabel 4, den laveste stabilitet værdi indikerer mest stabil ekspression og vi rangeret gener i overensstemmelse hermed. Den bedste enkelte henvisning genet for hver gruppe er som følger; »ikke-mavekræft cellelinjer '- GAPDH (0,036),' mave kræft cellelinjer '- B2M (0,014),' normale mave væv '- RPL29 (0,028),' tumor mave væv '- RPL29 (0,028),» alle mave væv '- RPL29 (0,032) og »alle mave cellelinjer og væv' - ACTB (0,029). Rang af reference- gener for 'mave cancercellelinier «var identisk med det fra den geNorm analyse, men var lidt anderledes i andre kategorier. NormFinder vurderer også den bedste kombination af reference- gener ved sub-gruppering i 'alle mave væv' - RPL29-B2M (0,005) og i 'alle maven cellelinjer og væv' - 18S rRNA-B2M (0,013) .table 4 Ranking af kandidat enkelt referencepunkter gener baseret på deres stabilitet beregnet ud fra NormFinder.
Ikke-mavekræft cellelinjer

mavekræft cellelinjer
Normale mave væv

Tumor mave væv
Alle mave væv

Alle maven cellelinjer + væv
Gene i faldende orden
Stabilitet værdi
Gene i faldende orden
Stabilitet værdi
Gene i faldende orden
Stabilitet værdi
Gene i ranking rækkefølge
Stabilitet værdi
Gene i ranking rækkefølge
Stabilitet værdi

Gene i faldende orden
Stabilitet value

GAPDH
0.036
B2M
0.014
RPL29
0.028
RPL29
0.028
RPL29
0.032
ACTB
0.029
RPL29
0.052
GAPDH
0.021
B2M
0.035
B2M
0.039
B2M
0.041
HPRT1
0.038
B2M
0.053
RPL29
0.029
HPRT1
0.038
HPRT1
0.042
HPRT1
0.044
RPL29
0.068
HPRT1
0.110
18S rRNA
0,036
ACTB
0,043
ACTB
0,065
ACTB
0,052
18S rRNA
0,071
18S rRNA
0,112
ACTB
0.060
18S rRNA
0,062
18S rRNA
0,067
18S rRNA
0.055
GAPDH
0.082
ACTB
0.143
HPRT1
0.115
GAPDH
0.140
GAPDH
0.147
GAPDH
0.140
B2M
0.084
Target genekspression profiler er påvirket af reference- gener ansat til normalisering
Til vurdering af reference- gener i virkelige situation, vi valgte 'mavekræft cellelinjer', 'alle mave væv' og 'alle mave cellelinjer og væv ", fordi kræftforskere fokus på sammenligning af genekspression i normale væv og tumorvæv samt mave stammer cancercellelinier for in vitro-undersøgelse. Vi anvendte enkelt reference- gener og kombinationer i den relative kvantificering (RQ) af GPNMB
som mål gen. GPNMB er et transmembrant glycoprotein og spiller en kooperativ rolle med p53 og cytokin-medieret transkriptionsfaktorer i differentierede immunceller [22] og brystcancer [23]. Den RQ af GPNMB udtryk ved hver seks enkelt reference- gener og B2M-GAPDH kombination i 'mavekræft cellelinjer' blev sammenlignet (figur 4). Den RQS ved B2M, GAPDH som fælles reference gen og B2M-GAPDH som blev forudsagt til at være den mest optimale kombination af reference- gener for 'mavekræft cellelinjer' af geNorm viste lignende høj-lav-mønstre (figur 4A, B og 4G). Til sammenligning RQ ved RPL29 resulterede i en tilsyneladende forhøjet ekspression i SNU-216, men reducerede ekspression i SNU-719 cellelinjer (figur 4C). RQ af 18S rRNA viste også forhøjede ekspression i SNU-216, men sænkede ekspression i MKN-28 (figur 4D). Den RQ ved ACTB og HPRT1 viste ekstremt reduceret ekspression i SNU-719 og KATOIII (figur 4E og 4F). Figur 4 Relativ kvantificering af GPNMB ekspression i maven cancercellelinier afhænger forskellige referencepunkter gener. Den GPNMB udtryk i seks mavekræft cellelinjer blev normaliseret ved seks enkelt reference- gener og bedste kombination afledt ved geNorm (gennemsnit ± SD); normaliseret ved B2M (A), ved GAPDH (B), ved RPL29 (C), ved 18S rRNA (D), ved ACTB (E), HPRT1 (F) og geometriske gennemsnit af B2M-GAPDH kombination (G).
forskellen på GPNMB RQ mellem normale og tumor mave væv var patient afhængig. RQ er højere i nogle tumorer, men modsat i andre. Den RQ normaliseret ved hver seks enkelt henvisning gen viste ikke nøjagtig den samme mønster. I tilfælde af en normalisering af RPL29 der blev forudsagt som mest stabile enkelt henvisning gen i NormFinder og mest stabile kombination med HPRT1 i geNorm, high-low mønster af RQ forskellen mellem normal og tumor (figur 5A) var ligner RQ af HPRT1 selvom der var forskel i tre patienter (figur 5B). Den RQ af B2M (figur 5c) og 18S rRNA (figur 5d) viste andet mønster fra højt klassificeret enkelt reference- gener i flere patienter. Med ACTB (figur 5E) GAPDH (figur 5F), forskellen blev større; der var forskelle i 35% af de samlede patienter. Den RQ normaliseret ved geometriske hjælp af RPL29-HPRT1 kombination fra geNorm (figur 5G) og RPL29-B2M fra NormFinder (figur 5H) viste lignende mønster. Når den samlede fold ændring (Tumor /Normal) blev sammenlignet, RQ af GPNMB ved B2M (T /N = 2,46 ×, parret t
-test p
= 0,017) og RPL29-B2M (T /N = 2,08 ×, s
= 0,025) viste signifikant stigning fra normal til tumor mave væv. RQ ved RPL29 (T /N = 2,23 ×, s
= 0,071), HPRT1 (T /N = 1,34 ×, s
= 0,258), ACTB (T /N = 1,60 ×, s
= 0,395), 18S rRNA (T /N = 1,36 ×, s
= 0,527) og RPL29-HPRT1 (T /N = 1,76 ×, s
= 0,086) viste også stigende GPNMB udtryk i tumor mave væv, men det var ikke statistisk signifikant. Til sammenligning, det viste modsat retning af udtryk forskel (T /N = 0,75 ×, s
= 0,637) ved GAPDH. Dette antyder, at GAPDH-ekspression i tumor mave væv er stærkt forhøjet sammenlignet med de andre reference- gener. Disse resultater tyder også på, at RQ data målgenet kan fortolkes på forskellige måder afhængig af de reference- gener anvendes til normalisering. Figur 5 Relativ kvantificering af GPNMB ekspression i normale og tumor mave væv afhænger af forskellige referenceværdier gener. Den GPNMB udtryk i mavekræft væv (fast bar: Normal, åben bar: Tumor) blev normaliseret ved seks enkelt reference- gener og to kombinationer afledt geNorm og NormFinder (gennemsnit ± SD); normaliseret ved RPL29 (A), ved HPRT1 (B), ved B2M (C), ved 18S rRNA (D), ved ACTB (E), GAPDH (F), geometriske gennemsnit af RPL29-HPRT1 (G) og RPL29-B2M (H).
For »alle mavekræft cellelinjer og væv", NormFinder og geNorm forudsagde 18S rRNA-B2M og 18S rRNA-ACTB som de bedste kombinationer. Mønsteret af GPNMB RQ ved geometriske gennemsnit af disse kombinationer var ens mellem dem. GPNMB RQS mellem 'mavekræft cellelinjer' og 'alle mave væv' kunne sammenlignes inden for samme område med 18S rRNA-ACTB, men der var en log af orden forskel ved 18S rRNA-B2M kombination. Mønstre af RQ i 'mavekræft cellelinjer "(Figur 6A, 6B) var magen til RQ af B2M-GAPDH (Figur 4G), men RQ af' alle mave væv 'af 18S rRNA-ACTB (figur 6B) var forskellig fra ( Figur 5G, 5H). Det fremgår, at signifikant forøget 18S rRNA ekspression i tumor mave væv (figur 1) kunne bidrage til dette resultat. Således, selv om disse kombinationer blev forudsagt som bedst, er de ikke egnede til fortolkning af data. Figur 6 Relativ kvantificering af GPNMB udtryk i puljen af ​​alle mavekræft cellelinjer og væv afhænger af forskellige kombinationer af reference- gener. Den GPNMB udtryk i mavekræft cellelinjer og mave væv (fast bar: Normal, åben bar: Tumor) blev normaliseret ved to kombinationer afledt geNorm og NormFinder (gennemsnit ± SD); normaliseret ved 18S rRNA-ACTB i mavekræft cellelinjer (A) og mave væv (C) og normaliseret ved 18S rRNA-B2M i mavekræft cellelinje (B) og mave væv (D).
Diskussion
Differential genekspression i kræft identificeret fra transkriptom undersøgelse tyder på, at nogle specifikke gener kan være involveret i tumorgenese og metastase af kræft. RT-qPCR er en robust og specifik metode til validering af identiteten af ​​kandidatgener af mavekræft, fordi den registrerer selv meget svage signaler fra ekstremt små mængder af biopsi prøver, hvis patienten er i den tidlige fase af kræft. Men i mangel af passende reference- gener, data opnået er et åbent spørgsmål, der fører til fejlfortolkninger. Forud for denne undersøgelse, er der ikke valideret henvisning gen blevet identificeret for 'mavekræft cellelinje "eller" mavekræft væv', men ACTB og GAPDH er blevet anvendt hyppigst indtil nu uden hensyntagen til deres inkonsistente udtryk i forskellige eksperimentelle indstillinger og kliniske tilstande . Vi undersøgte, foruden ACTB og GAPDH, fire andre referencepunkter gener, HPRT1, RPL29, 18S rRNA og B2M der er blevet vurderet som reference- gener i de seneste undersøgelser for andre menneskelige kræftformer.
Det er klart, at valget af passende primer sæt er et vigtigt udgangspunkt for at opnå nøjagtige resultater. Vi overvejede følgende punkter i udvælgelsen primere. Først, vi vedtog primersæt, der tidligere blev rapporteret til at have eller beregnet til at besidde en amplicon længde omkring 200 bp. For det andet blev alle de primersæt skal være på mindst to tilstødende exoner bortset 18S rRNA-genet, som ikke er et mRNA. De to ovenstående punkter er relateret til amplificeringseffektiviteten. Det er nødvendigt, at henvisningen gen og målgenet opretholde lignende forstærkning effektivitet [13]. Amplicon længde er nært beslægtet med forstærkning effektivitet [24]. Så man kunne forvente lignende effektivitet fra amplikon af tilsvarende længde, og højere effektivitet fra en kortere amplikon. Fordelen ved kortere amplicon, 70-250 bp, i RT-qPCR er, at amplifikation er "uafhængig" af RNA kvalitet [25]. Amplificeringseffektiviteten påvirkes også af gDNA kontaminering, fordi kompetitiv binding af primere virker som en begrænsende faktor, der forårsager formindskelse af amplifikationseffektivitet [13]. I denne sammenhæng DNasel behandling under RNA oprensning er afgørende at undgå amplifikation fra tilbageværende gDNA, men det kan ikke være fuldstændig effektiv. Derfor er vores anden overvejelse er med til at opdage eventuel forurening med gDNA med forskellige amplicon størrelser. Vi bekræftede, at hver forward og reverse primer er forankret på forskellig exon af Blat søgninger på humane genom-sekvenser, og også at der ikke var amplificeret produkt i at forurene gDNA med udvidet amplicon længde (tabel 2). Desuden har vi også sikret den høje kvalitet af RNA, udgangsmaterialet, på flere måder. Vi udførte også eksperimenterne i triplikat for hvert gen og hver prøve.
Da udviklingen af ​​qPCR blev flere statistiske programmer udviklet til at identificere optimale referencepunkter gener. Vi valgte geNorm og NormFinder at analysere stabiliteten af ​​de seks referencepunkter gener, vi studerede. Det geNorm Programmet beregner M-værdier baseret på den gennemsnitlige parvise variation af et særligt gen sammenlignet med alle andre undersøgte kandidatlande reference- gener og rangerer dem [8]. Til sammenligning NormFinder vedtager en strategi, kaldet 'model tilgang til estimering af udtryk variation "[7].

• I Silico analyse af gastrisk karcinom Serial Analyse af genekspression biblioteker afslører forskellige profiler, der er forbundet med etnicitet
• Adjuverende kemo-strålebehandling for gastrisk adenocarcinom: et institutionelt oplevelse