Identifisering av gyldige referanse gener for genuttrykk studier av menneskelig magekreft ved revers transkripsjon-qPCR

Identifisering av gyldige referanse gener for genuttrykk studier av menneskelig magekreft ved revers transkripsjon-qPCR
Abstract
Bakgrunn
Revers transkripsjon kvantitativ real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR) er en kraftig metode for analyse av genuttrykk. Målet genekspresjon nivåer er vanligvis normalisert til en gjennomgående uttrykt referanse-genet også kjent som intern standard, i den samme prøven. Imidlertid har mye arbeid ikke blitt brukt så langt i jakten på referanse gener som passer for studiet av magekreft ved hjelp av RT-qPCR, selv om valg av optimale referanse gener er avgjørende for tolkningen av resultatene.
Metoder
Vi vurderte egnetheten av seks mulige referansegener, beta-aktin (ACTB), glyceraldehydes-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH), hypoxantin fosforibosyl transferase 1 (HPRT1), beta-2-mikroglobulin (B2M), ribosomale subenhet L29 (RPL29) og 18S ribosomalt RNA (18S rRNA) i 20 normale og tumor mage vev par av magekreftpasienter og 6 magekreft cellelinjer, med RT-qPCR. . Ansette uttrykk stabilitetsanalyser ved hjelp NormFinder og geNorm algoritmer vi bestemt rekkefølgen på resultatene av disse referanse gener og deres variantverdier
Resultater
Dette RT-qPCR studie viste at det er statistisk signifikant (p
< 0,05 ) forskjeller i uttrykket nivåer av HPRT1 og 18S rRNA i "normal 'versus' svulst mage vev '. Den stabilitetsanalyser av geNorm foreslår B2M-GAPDH, som beste referanse genet kombinasjon for 'magekreft cellelinjer'; RPL29-HPRT1, for "alle mage vev '; og ACTB-18S rRNA, for "alle mage cellelinjer og vev". NormFinder også identifisert B2M som den beste referansen genet for 'magekreft cellelinjer', RPL29-B2M for 'alle mage vev ", og 18S rRNA-ACTB for' alle mage cellelinjer og vev '. Sammenligningene av normalisert uttrykk av målet genet, GPNMB, viste annen tolkning av målet genuttrykk avhenge beste eneste referanse genet eller kombinasjon.
Konklusjon
Denne studien validert RPL29 og RPL29-B2M som den beste enkelt referanse gener og kombinasjon, for RT-qPCR analyse av 'alle mage vev', og B2M og B2M-GAPDH som den beste eneste referanse genet og kombinasjon, for 'magekreft cellelinjer'. Bruk av disse validerte referanse gener skal gi mer presis tolkning av differensial genekspresjon ved transkripsjon nivå i magekreft.
Bakgrunn
Revers transkripsjon kvantitativ real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR) er et kraftig verktøy for å validere observerte genuttrykk forskjeller, på grunn av sin større sensitivitet og spesifisitet. I tradisjonelle genuttrykkstudier, er en referanse genet ", også kalt" intern standard "eller" husholdningsgenet "som brukes for normalisering. Ekspresjon av beta-aktin (ACTB) og glyceraldehydes-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH), som brukes i et flertall av studier [1], ble rapportert å variere med eksperimentelle betingelser [2] og klinisk status av vevet undersøkt (for eksempel
astma), noe som gjør disse genene uegnet som interne standarder for bruk i normalisering av genekspresjon [3]. . Dermed er avgjørende for å unngå faren for feiltolking data og ugyldige konklusjoner gyldigheten av referanse genet er valgt for statistisk analyse [4]
Det ble foreslått at minst tre hensyn bør tas i betraktning ved valg av et referanse-gen: 1) konstant dets ekspresjon i hele intervensjon, 2) dens forsterkningsvirkningsgrad og 3) dens overflod, som bør være lik den som er av genene av interesse [5]. I tillegg, for å sikre relevans, nøyaktighet og korrekthet av tolkninger av RT-qPCR, anbefales det at de presise retningslinjer for RT-qPCR MIQE (Minimum Informasjon til offentliggjøring av kvantitativ real-time PCR Experiment) må overholdes [6] . Flere verktøy for statistisk analyse som NormFinder [7], geNorm [8], BestKeeper [9] har blitt utviklet for å hjelpe i valg av hensiktsmessige referanse gener. Disse verktøyene vurdere variasjoner i uttrykket av en rekke potensielle referanse gener og foreslå hvilke referanse genet (e) er passende for normalisering av genuttrykk data i en gitt studie.
Magekreft er den fjerde vanligste kreft hele verden, med en rapportert 934,000 tilfeller i 2002 [10]. Overlevelse fra magekreft er dårlig siden pasientene er ofte diagnostisert etter at sykdommen allerede har avansert betydelig [11], noe som gjør tidlig diagnose svært viktig. Screening med sikte på tidlig identifisering innebærer endoskopisk undersøkelse. For å bekrefte tilstedeværelse av kreft, blir biopsier tatt fra mistanke vev og underkastet RT-qPCR for å bekrefte unormal ekspresjon av kreftrelaterte gener. Men passende referanse gener må identifiseres for gyldige sammenligninger mellom uttrykk for normal versus kreftgener. Referanse gener er blitt beskrevet for RT-qPCR undersøkelser i forskjellige krefttyper av andre vev [1, 12-21]. Men det synes å være noen konsensus om referanse gener for genuttrykkstudier i magekreft. Vi søkte derfor PubMed med MeSH termer "magekreft", "real-time", og "PCR". I en evaluering av 115 artikler publisert fra mai 2007 til november 2009, fant vi at GAPDH (53 tilfeller; 46,1%) og ACTB (41 tilfeller, 35,7%) var de mest brukte referanse gener i magekreft studier; etterfulgt av 18S rRNA (8 tilfeller, 7,0%), beta-2-mikroglobulin (B2M; 3 tilfeller; 2,6%), hypoxantin fosforibosyltransferase 1 (HPRT1, 2cases; 1,7%), TATA bindende protein (TBP, en sak, 0.9 %) og beta-tubulin (tubb, 1 tilfelle; 0,9%). I fem tilfeller (4,3%), ble ekstern standard kurve brukes for absolutt kvantifisering (AQ) i stedet for normalisert verdi som referanse genet.
Denne studien har derfor blitt utviklet for å finne beste referanse gener for genuttrykkstudier i magekreft . I denne studien undersøkte vi de fem referanse gener som har blitt mest brukte gener i magen kreft studier (ACTB, GAPDH, B2M, 18S rRNA, og HPRT1) og for sammenligning, RPL29, en referanse gen brukes i andre studier av kreft i 'non-magekreft cellelinjer', 'magekreft cellelinjer', 'normal mage vev "og" tumor magen vev "(tabell 1). For å velge den mest hensiktsmessige referansen genet fra listen ovenfor, sammenlignet vi uttrykk for glykoprotein NMB (GPNMB), vår target gen, med de i navngitt ovenfor, listen over mulige "referanse" genes.Table 1 Potensielle referanse gener evaluert i denne studien.
Gene symbol

GenBank aksesjonsnr
Gene navn
Genomisk lokalisering <.no> Beskrivelse
ACTB
NM_001101
Beta-aktin
7p15-12
cytoskeletal strukturelle proteiner
GAPDH
NM_002046
glyseraldehyd-3- fosfat dehydrogenase
12p13
oksidoreduktase i glykolysen og glukoneogenesen
HPRT1
NM_000194
hypoxantin fosforibosyltransferase en
Xq26
Metabolsk berging av puriner
B2M
NM_004048
Beta-2-mikroglobulin
15q21.1
Beta-kjede av store histocompatibility komplekse klasse i molekyler
18S rRNA
NR_003286
18S ribosomalt RNA
22p12
ribosom subenheten
RPL29
NM_00992
Ribosomalt protein L29
3p21.3-p21.2
Strukturelle bestanddel av ribosom
GPNMB
NM_001005340
glykoprotein (trans) NMB
7p15

• I Silico analyse av mage karsinom Serial analyse av genuttrykk biblioteker avslører ulike profiler tilknyttet ethnicity
• Adjuvant kjemoterapi-stråling ved adenokarsinom: en institusjonell experience