Identifikatioun vun valabel Referenzmaterial Genen fir Gentherapie Ausdrock Studien vum Mënsch Mo. Kriibs vum Géigendeel Transkriptiouns-qPCR

Identifikatioun vun valabel Referenzmaterial Genen fir Gentherapie Ausdrock Studien vum Mënsch Mo. Kriibs vum Géigendeel Transkriptiouns-qPCR VerfÜgung méiglech VerfÜgung Background VerfÜgung Transkriptiouns grouss Réckproduktioun real-Zäit polymerase Kette Reaktioun (RT-qPCR) ass eng staark Method fir d'Analyse vun der Gentherapie Ausdrock. Target Gentherapie Ausdrock Niveau sinn normalerweis normalized fir eng konsequent ausgedréckt Referenzmaterial Gentherapie och intern schëlleg bekannt, an der selwechter Prouf. Allerdéngs huet vill Effort net esou wäit an der Sich no Referenzmaterial Genen gëeegent fir d'Etude vun Mo. Kriibs benotzt RT-qPCR är, obwuel Auswiel vun optimal Referenzmaterial Genen fir Interpretatioun vun Resultater kritesch ass. VerfÜgung Method VerfÜgung Mir évaluéieren der suitability vu sechs méiglech Referenzmaterial Genen, Beta-actin (ACTB), glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), hypoxanthine phosphoribosyl transferase 1 (HPRT1), Beta-2-microglobulin (B2M), ribosomal subunit L29 (RPL29) an 18S ribosomal RNS (18S rRNA) zu 20 normal an entholl Mo. Otemschwieregkeeten Puer Mo. Kriibs Patienten a 6 Mo. Kriibs Zell Linnen, déi vun RT-qPCR. . Ausdrock Stabilitéit astellen Analysë NormFinder an geNorm algorithms benotzen mir den Optrag vun Leeschtungsfähegkeet vun dësen Referenzmaterial Genen an hir Variant Wäerter sech VerfÜgung Resultater VerfÜgung Dëst RT-qPCR Etude gewisen, dass et statistesch relevant sin (p VerfÜgung &Si besteet; 0,05 ) Differenzen an der Ausdrock Niveau vun HPRT1 an 18S rRNA am "normal- 'versus' entholl Mo. Stoffer". D'Stabilitéit Analysë vun geNorm proposéiere B2M-GAPDH, als beschte Kombinatioun Referenzmaterial Gentherapie fir "Mo. Kriibs Zell Linnen"; RPL29-HPRT1, fir all Mo. Stoffer '; an ACTB-18S rRNA, fir all Mo. Zell Linnen an Stoffer ". NormFinder och B2M als déi bescht Referenz Gentherapie identifizéiert fir "Mo. Kriibs Zell Linnen", RPL29-B2M fir all Mo. Stoffer ", an 18S rRNA-ACTB fir all Mo. Zell Linnen an Stoffer". Déi Vergläicher vun normalized Ausdrock vun der Zil- Gentherapie, GPNMB, zougedréckt verschidden Interpretatioun vun Zil- Gentherapie Ausdrock hänkt op beschten eenzeg Referenz Gentherapie oder geschéckt. VerfÜgung Conclusioun VerfÜgung Dës Etude validéiert RPL29 an RPL29-B2M als déi bescht eenzeg Referenz Genen an geschéckt, fir RT-qPCR Analyse vun all Mo. Stoffer ", an B2M an B2M-GAPDH als déi bescht eenzeg Referenz Gentherapie a geschéckt, fir" Mo. Kriibs Zell Linnen ". Notzung vun dësen validéiert Referenzmaterial Genen soll méi genau Interpretatioun vun Ënnerscheed Gentherapie Ausstralung op Transkriptiouns Niveau am Mo. Kriibs gëtt. VerfÜgung Background Transkriptiouns Réckproduktioun VerfÜgung grouss real-Zäit polymerase Kette Reaktioun (RT-qPCR) ass eng staark Stäip fir d'Validatioun observéiert Gentherapie Ausdrock Differenzen, wéinst hirer grousser Empfindlechkeet a Spezifizitéit. An traditionell Gentherapie Ausdrock Studien, eng "Referenz Gentherapie", och "intern Standard 'oder' housekeeping Gentherapie" genannt ass fir d'normalization benotzt. Den Ausdrock vun Beta-actin (ACTB) an glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), an eng Majoritéit vun de Studien benotzt [1], gemellt huet mat experimentell Konditiounen variéieren [2] a Krankheete Status vun der Otemschwieregkeeten studéiert (zB
Asthma), dës Genen zweifelhaftem wéi intern Standarden fir Benotzung vun normalization vun der Gentherapie Ausdrock [3]. . Sou, entscheedende d 'Validitéit vun der Referenz Gentherapie, fir statistesch Analyse an dëse Match gaangen ass fir laanscht de iwwerschloen vun Daten an invalid Conclusioune misinterpreting [4] VerfÜgung Et gouf ugeholl, dass op d'mannst dräi Iwwerleeungen misst an ausgesicht eng Referenz Gentherapie Rechnung gedroe ginn: 1) constancy vun hiren Ausdrock uechter d'Interventioun, 2) seng amplification Effizienz an 3) hir Heefegkeet, déi un déi vun de Genen vun Interessi ähnlech soll [5]. Ausserdeem, d'Relevanz, Genauegkeet an Richtegkeet vun Interpretatiounen vun RT-qPCR ze garantéieren, ass et unzeroden, datt déi genee Richtlinne fir RT-qPCR MIQE (Minimum Informatioune fir Verëffentlechung vun Chemeschen fonnt Real-Time Hinnen alleguer) zu Directioun respektéiert soll [6] . Verschidden Instrumenter fir statistesch Analyse wéi NormFinder [7], geNorm [8], BestKeeper [9] goufen an der Wiel vun passenden Referenzmaterial Genen ze hëllefen entwéckelt. Dës Instrumenter evaluéieren de Variatiounen vun der Ausdrock vun enger Rei vun potentiellen Referenzmaterial Genen an proposéiere déi Referenz Gentherapie (s) ass ubruecht fir normalization vun der Gentherapie Ausdrock Daten zu enger bestëmmter studéieren. VerfÜgung Mo. Kriibs d'véiert stäerkste gemeinsam Kriibs ass weltwäit, mat engem Rapport 934.000 Fäll vun 2002 [10]. Iwwerliewe vu Moo Kriibs ass aarm well Patienten oft nëmmen diagnostizéiert ginn no der Krankheet scho wesentlech erweidert huet [11], déi ganz wichteg fréi ze erkennen mécht. Duerchmusterung um fréi ze erkennen Netzneutralitéit bedeit Bild vum Examen. Fir d'Präsenz vun Kriibs confirméieren, sinn biopsies aus verdächtegt Stoffer geholl an deen zu RT-qPCR zu Manque Ausdrock vu Kriibs Zesummenhang Genen confirméieren. Mä passenden Referenzmaterial Genen hunn fir valabel Vergläicher tëschent Ausstralung vun normal versus Kriibs Genen identifizéiert ginn. Referenz Genen gewiescht fir RT-qPCR Studien zu verschiddenen Cancers vun aner Stoffer beschriwwen [1, 12-21]. Mä et schéngt fir Gentherapie Ausdrock Studien am Mo. Kriibs kee Konsens op Referenzmaterial Genen ze ginn. Mir gesichte dofir PubMed mat Mesh Begrëffer "gastric Kriibs", "real-Zäit", an "Hinnen alleguer". An eng Evaluatioun vun 115 Artikelen vum Mee 2007 bis November 2009 publizéiert, fonnt mir dass GAPDH (53 Fäll; 46.1%) an ACTB (41 Fäll; 35.7%) déi oft benotzt Referenzmaterial Genen vun gastric Kriibs Studien huet; gefollegt vun 18S rRNA (8 Fäll; 7.0%), Beta-2-microglobulin (B2M; 3 Fäll; 2,6%), hypoxanthine phosphoribosyl transferase 1 (HPRT1; 2cases; 1,7%), TATA bindend FAQ (TBP; 1 Fall; 0,9 %), an der Beta-tubulin (Tubb; 1 Fall; 0,9%). Zu fënnef Fäll (4,3%), war externen Standard rop fir absolute quantification (genuch betount) amplaz vun normalized Wäert vun Referenzmaterial Gentherapie benotzt. VerfÜgung Déi heiteg studéieren duerfir bescht Referenz Genen vun der Gentherapie Ausdrock Studien am Mo. Kriibs ze fannen ass gemeet . An dëser Etude, ze propagéieren mir der fënnef Referenzmaterial Genen déi meescht dacks Genen am Mo. Kriibs Studien (ACTB, GAPDH, B2M, 18S rRNA, an HPRT1) an zum Vergläich, RPL29, eng Referenz Gentherapie an anere Kriibs Studien gebraucht benotzt goufen, an "Net-Mo. Kriibs Zell Linnen", "Mo. Kriibs Zell Linnen", "normal Mo. Stoffer 'an' entholl Mo. Stoffer" (Table 1). Fir déi entspriechend Referenzmaterial Gentherapie aus der Lëscht ze wielen, am Verglach mir der Ausstralung vun glycoprotein NMB (GPNMB), eis Zil- Gentherapie, mat deenen an den uewe genannten Lëscht vun méiglechen "Referenz" genes.Table 1 D'Referenz Genen évaluéiert an dëser Etude. VerfÜgung Gene Symbol VerfÜgung GenBank Zougank Nr
Gene Numm
Frankräich Lokalisatioun VerfÜgung
Beschreiwung
ACTB VerfÜgung NM_001101 VerfÜgung Beta-actin VerfÜgung 7p15-12 VerfÜgung Cytoskeletal strukturell FAQ VerfÜgung GAPDH VerfÜgung NM_002046 VerfÜgung Glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase VerfÜgung 12p13 VerfÜgung Oxidoreductase zu glycolysis an gluconeogenesis VerfÜgung HPRT1 VerfÜgung NM_000194 VerfÜgung Hypoxanthine phosphoribosyl transferase 1 VerfÜgung Xq26 VerfÜgung Metabolic salvage vun purines VerfÜgung B2M VerfÜgung NM_004048
Beta-2-microglobulin VerfÜgung 15q21.1 VerfÜgung Beta-Kette vun gréisser histocompatibility komplex Klass ech Molekülle VerfÜgung 18S rRNA VerfÜgung NR_003286 VerfÜgung 18S ribosomal RNS VerfÜgung 22p12 VerfÜgung Ribosom subunit
RPL29 VerfÜgung NM_00992 VerfÜgung Ribosomal FAQ L29 VerfÜgung 3p21.3-p21.2 VerfÜgung Strukturfongen entstoend vun Ribosom VerfÜgung GPNMB VerfÜgung NM_001005340 VerfÜgung Glycoprotein (transmembrane) nmb VerfÜgung 7p15 || C VerfÜgung zu Wuesstem Retard a Reduktioun vun metastatic Potential VerfÜgung Method interesséiert VerfÜgung Zell Linnen a mënschlech Stoffer VerfÜgung Mir kritt Zell Linnen vum amerikanesche Type Kultur Kollektioun (Manassas, VA, USA) oder koreanesch Zell Linn Bank (Seoul, Korea): sechs Mo. entholl Zell Linnen (SNU-216, SNU-638, SNU-719, AGS, MKN-28 an KATOIII), fënnef Net-Mo. Kriibs Zell Linnen (JIMT1, SK-BR-3, SNU-C5, A549, a U87), an zwee normale Mënsch Zell Linnen (HDF, HMEC). All d'Zell Strecken an designéierte Medien haten (Mediatech, Manassas, VA, USA) ergänzt mat 10% An et Bovine serum (Invitrogen, Calsbard, CA, USA). Zwanzeg reagéiert Puer normal an entholl Mo. Stoffer sech duerch Bild resection während Ënnersichung vun de Patienten kritt déi Awëllegung huet (Table 2). All Prozedure goufen am Aklang mat Ëmwelt- déi institutionell review Verwaltungsrot vun National Cancer Center an der Deklaratioun vun Helsinki.Table 2 Charakteristike vu Patienten guttgeheescht duerchgefouert deen Mo. Kriibs Stoffer gëtt. VerfÜgung zu zu Zuel vun VerfÜgung Zuel vu Patienten VerfÜgung Total VerfÜgung 20 VerfÜgung Männlech VerfÜgung 14 VerfÜgung Weiblech VerfÜgung 6 VerfÜgung Alter VerfÜgung Patienten bei Diagnos (Joer) VerfÜgung Range VerfÜgung 34-77 VerfÜgung Mëttler ± Fils VerfÜgung 60,8 ± 12,1 VerfÜgung Genau Etapp † VerfÜgung entholl Etapp VerfÜgung T1 VerfÜgung 8 VerfÜgung T2 VerfÜgung 8 VerfÜgung T3 VerfÜgung 4 VerfÜgung Node Etapp VerfÜgung N0 VerfÜgung 8 VerfÜgung N1 VerfÜgung 6 VerfÜgung N2 VerfÜgung 2 VerfÜgung N3 VerfÜgung 4
† folgendermoossen Etapp Klassifikatioun der Systematik TNM vun International Unioun Géint Cancer (UICC) [27]. VerfÜgung RNS erauszéien a VerfÜgung cDNA Synthes Echantillon Mo. Kriibs Otemschwieregkeeten zu RNAlater Léisung agekacht waren (QIAGEN, Hilden, Däitschland) bis benotzen fir RNS erauszéien. Total RNS war mat TRIzol Régent ofgebaut laut den Hiersteller d'Protokoll (Invitrogen), a mat DNaseI op RNeasy Mini Kolonne (QIAGEN) behandelt Reschtoffall Frankräich DNA ze läschen. Konzentratioun an enger 260/280 Verhältnis vun sidd RNS sech mat Nanodrop ND-1000 (Thermo Wëssenschaftlech, Mëtt, DE, USA) gemooss, a Qualitéit huet op Agilent 2100 Bioanalyzer benotzt RNS 6000 Nano Kit (Agilent Technologies, Santa Clara évaluéieren , CA, USA). Zwee μg vun puer dovun-DT primed total RNS (zoufälleg hexamer total RNS fir 18S rRNA amplification primed) sech ëmgedréint-ausserdeem mat Transcriptor Réckproduktioun Transcriptase no de Protokoll d'Hiersteller (Roche Obwuel Science, Mannheim, Däitschland). VerfÜgung Transkriptiouns grouss real Réckproduktioun hut Hinnen alleguer (RT-qPCR) VerfÜgung op virdrun Rapporten Opgrond, adoptéiert mir primers vun amplicon ënnert 200 BP Längt, ausser fir ACTB, Konstanz an amplification Effizienz (Table 3) ze erhalen. D'primers fir d'amplification vun GPNMB sech duerch Primer 3 Software http entworf: //frodo Wi mit hat /primer3 /.... Mir laachen mRNA Ausdrock vu 6 Referenzmaterial Genen an eng Zilscheif Gentherapie vun RT-qPCR op enger Light-LS 480 II (Roche Obwuel Science). RT-qPCR Reaktioun war mat 5 NG vun verdënntem cDNA gesuergt, 5 pmole vun all primer (Table 3), 5 μl vun 2 × Light-LS Fast DNA MasterPlus SYBR Green ech am final Volume vun 10 μl. D'Hinnen alleguer Zyklus ware Set wéi follegt zesummen: Pre-incubation fir 5 Minutte bei 95 ° C ëm 45 Zykle gefollegt, mat all Zyklus dorënner 15 Sekonnen op 95 ° C, 30 Sekonnen an 58 ° C, an 30 Sekonnen op 72 ° C. Relativer quantification war vun Light LS Software 1.5.0 (Roche Obwuel Science) baséiert op "Barrière Point" (CP) Wäert gesuergt, datt den Zyklus Zuel definéiert bei deem de fluorescence Signal vun der Prouf engem Hannergrond fluorescence wéi value.Table 3 Primers fir sechs Referenz Genen an engem Zil- Gentherapie. VerfÜgung Gene
Stiermer primer [5 '→ 3'] VerfÜgung ëmgekéierte Haaptrei [5 '→ 3']
verankert VerfÜgung Exons
Amplicon VerfÜgung Gréisst
Rennsport on
genome

Amplification
efficiency

Reference

ACTB
CATCGAGCACGGCATCGTCA
TAGCACAGCCTGGATAGCAAC
Exon 3 VerfÜgung Exon 4 VerfÜgung 211 BP VerfÜgung 652 BP VerfÜgung 1,971 VerfÜgung [28] zu GAPDH VerfÜgung TGCACCACCAACTGCTTA VerfÜgung GGATGCAGGGATGATGTTC VerfÜgung Exon 7 VerfÜgung Exon 8
177 BP VerfÜgung 370 BP VerfÜgung 1,999 VerfÜgung [29] zu HPRT1 VerfÜgung AGACTTTGCTTTCCTTGGTCAG VerfÜgung TCAAGGGCATATCCTACAACAA VerfÜgung Exon 6 VerfÜgung Exon 8 VerfÜgung 151 BP VerfÜgung 5120 BP VerfÜgung 1,949 VerfÜgung [30] zu B2M VerfÜgung ACTGAATTCACCCCCACTGA VerfÜgung CCTCCATGATGCTGCTTACA VerfÜgung Exon 2 VerfÜgung Exon 4 VerfÜgung 114 BP VerfÜgung 741 BP VerfÜgung 1,924 VerfÜgung [ ,,,0],28] VerfÜgung 18S rRNA VerfÜgung GTAACCCGTTGAACCCCATT VerfÜgung CCATCCAATCGGTAGTAGCG VerfÜgung NA1 VerfÜgung 151 BP VerfÜgung 151 BP VerfÜgung 2.000 VerfÜgung [31] zu RPL29 VerfÜgung GGCGTTGTTGACCCTATTTC VerfÜgung GTGTGTGGTGTGGTTCTTGG VerfÜgung Exon 1 VerfÜgung Exon 2 VerfÜgung 120 BP VerfÜgung 507 BP VerfÜgung 1,937 VerfÜgung [16] zu GPNMB VerfÜgung TGCGTCCGTGAGAATTCA VerfÜgung TGTGCTCCCTCATGTAAGCA VerfÜgung Exon 1
Exon 2 VerfÜgung 144 BP VerfÜgung 6522 BP VerfÜgung 1,945 VerfÜgung Am Haus design2 VerfÜgung 1. net 2. Primers sinn VerfÜgung vun Primer 3 mat mënschlechen mispriming Bibliothéik Duerchmusterung Optiounen entworf goufen.
Data Analysen VerfÜgung statistique analyséiert goufen mat GraphPad Prism V4.03 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) gesuergt. Normalitéit war no Kolmogorov-Smirnov (KS) évaluéieren, D'Agostino-Pearson (DAP), an Shapiro-Wilk (stellare) Tester. Fir d'Verdeelung vun den Net-normal verdeelt Gruppen, Net-parametric Mann-Whitney U-Test an Wilcoxon ënnerschriwwen Geleeënheet Test gemaach huet. P-Wäerter mat p VerfÜgung &Si besteet; 0,05 waren statistesch relevant considéréiert. Mir applizéiert NormFinder V12 [7] an geNorm ™ V3.44 [8] Software den Ausdrock Wäerter vu sechs Kandidaten Referenzmaterial Genen ze bestëmmen. VerfÜgung Resultater VerfÜgung RNS Qualitéit Foussgänger VerfÜgung mir d'Qualitéit vun RNS évaluéieren wéi ugefaange benotzt Material op verschidde Manéieren. A 260/280 Verhältnis vun Nanodrop gemooss gouf 2,08 ± 0.09 (mengen ± Fils) confirméiert, datt den RNS war reng an FAQ-gratis. RNS Qualitéit als RNS Integritéit Zuel (RIN) Rapport vun RNS 6000 Nano Labchip fir cultured Zell Linn war 9,7 ± 0,2 (mengen ± Fils), an 7,4 ± 1.0 fir Patient Otemschwieregkeeten Echantillon. Fir d'reagéiert Puer Mo. Otemschwieregkeeten Echantillonen, huet mir keng statistesch groussen Ënnerscheed zu entweder A 260/280 Verhältnis tëscht normal (2.05 ± 0,03) an entholl (2.04 ± 0,05) Stoffer (vläit Student d't VerfÜgung fannen - Test p VerfÜgung -value = 0.214) oder RIN Wäerter tëscht normal (7,2 ± 0,5) an entholl (7.5 ± 1,4) Otemschwieregkeeten Prouf Gruppen (vläit Student d't VerfÜgung Azeton p VerfÜgung -value = 0.340).
Expression laut vum Kandidat Referenzmaterial Genen an Zil- Gentherapie VerfÜgung Mir standing RT-qPCR a sech d'amplification Effizienz vun all primer Formatioun (Table 3). Den Ausdrock vun sechs Kandidaten Referenzmaterial Genen vun Conditioune vun CP Wäerter entsteet aus RT-qPCR, sinn zu Dorënner 1 als luucht Komplott ugewisen. D'Zell Linnen Schatzkummer engem Spektrum vun CP Wäerter, eng grouss Differenz zu Ausdrock vertrëtt, variéieren tëscht 14,56 an 34,89, jee op d'Referenz Gentherapie benotzt. ACTB an GAPDH zougedréckt meescht räich Ausdrock vun zwou 'Mo. Kriibs Zell Linnen "an" non-Mo. Kriibs Zell Linnen ", mee am Géigesaz HPRT1 zougedréckt niddregsten Ausdrock Niveau. Den Ausdrock vun Zil- Gentherapie GPNMB zu CP Wäerter gounge vun 27,7 op 32,1 zu Zell Linnen. D'Normalitéit Foussgänger zougedréckt HPRT1 am "Mo. Kriibs Zell Linnen" an 18S rRNA an "non-Mo. Zell Linnen" sinn net normalerweis verdeelt duerch KS-Test. Sou, mir huelen an Net-parametric Mann-Whitney U-Test fir Net-normal verdeelt firstellen Gruppen ze vergläichen, an et awer bedeitend Ënnerscheeder an der Ausstralung vun GAPDH (p VerfÜgung = 0.014) an B2M (p VerfÜgung = 0.035) tëschent "Mo. Kriibs Zell Linnen" an "non-Mo. Kriibs Zell Linnen". Figur 1 Expression Niveauen fir sechs Kandidaten Referenzmaterial Genen Réckstänn vun RT-qPCR. Barrière Punkt (CP) Wäerter an 'Mo. Kriibs Zell Linnen "an" non-Mo. Kriibs Zell Linnen "," normal Mo. Stoffer' an 'entholl Mo. Stoffer "sinn den Ausdrock Niveau vertrueden. Horizontal Bar an der Mëtt vun Fragmenter Flecken weist Duerchschnëtt Ausdrock Niveau. Déi ënnescht de CP Wäert, ass d'héich den Ausdrock vun Genen. VerfÜgung Mënscherechter Mo. Stoffer och grouss Variatiounen am CP Wäerter zougedréckt rangéiert vun 13,3 op 29.4 (Dorënner 1), mam héchste Ausdrock vun B2M an 18S rRNA an déifst Ausdrock vun HPRT1 . Den Ausdrock vun Zil- Gentherapie GPNMB zu CP gounge vun 28,5 op 34,7 am Mo. Stoffer. An Normalitéit Test, ACTB, HPRT1, an 18S rRNA am Grupp "normal Mo. Stoffer an all Genen ausser GAPDH am 'entholl Mo. Stoffer', gefollegt normal Verdeelung vun KS-Test. HPRT1, B2M, an RPL29 zu entholl Mo. Stoffer batter der Normalitéit zu DAP- an stellare-Tester. Sou, fir Net-normal verdeelt vläit Gruppen vergläichen, mir standing Net-parametric Wilcoxon Geleeënheet Test ënnerschriwwen. Grouss Ausdrock Erhéijung vun normal ze entholl Mo. Stoffer (p VerfÜgung &Si besteet; 0,05) waren an HPRT1 (p VerfÜgung = 0.011) an 18S rRNA (p VerfÜgung = 0.021), mee net an ACTB (p
= 0.058), GAPDH (p VerfÜgung = 0.918), B2M (p VerfÜgung = 0.740), oder RPL29 (p VerfÜgung = 0.208). VerfÜgung Expression Stabilitéit vum Kandidat Referenzmaterial Genen VerfÜgung fir déi stabil Referenzmaterial Genen ze identifizéieren, analyséiert mir den Ausdrock Date mat geNorm an NormFinder. Mir kategoriséiert der Zell Linnen an Stoffer an de folgende Gruppen - "Net-Mo. Kriibs Zell Linnen", "Mo. Kriibs Zell Linnen", "normal Mo. Stoffer", "entholl Mo. Stoffer", "all Mo. Stoffer (normal + entholl Mo. Stoffer ) "an" all Mo. Kriibs Zell Linnen an Stoffer ". D'Applikatioun vun geNorm mat standard Limit (M &Si besteet; 1,5) Indikatiounen onbestänneg Referenzmaterial Genen an lénks minimal Zuel vun gëeegent Referenzmaterial Genen fir all Grupp zu Enn (Dorënner 2). Fir d'optimal Zuel vu Genen fir geometreschen mengen normalization bestëmmen néideg, am Verglach mir Pair-schlau Variant (V n /V n + 1) berechent vun geNorm tëscht all Kombinatioun vu mi normalization Faktoren (NF n an NF n + 1) fir all Echantillon vun der Grupp. Mir applizéiert Default loung (0,15) fir präventive [8] ënnert déi Abezéiung vun zousätzleche Referenzmaterial Genen net néideg ass. An all an dëser Etude bewäert Gruppen, sinn d'Pair-schlau Variatioune schonn ënnert der loung (Dorënner 3), also war et interpretéiert, datt mat méi wéi zwee optimal Genen Genauegkeet ze verbesseren net positiv sinn. Wéinst dem fonnt mir eng Korrelatioun tëscht Varianz an Schréiegt vun der M-Wäert rop. Am Fall vun "Net-Mo. Kriibs Zell Linnen", nieft vun GAPDH als drëtt Gentherapie un déi zwee optimal erwaart Genen B2M-RPL29 Erhéijunge vun 0,0218 vun der Stabilitéit Wäert M, mat sengem Brëll-schlau Varianz V 2 /3 vun 0,032. Op dës Manéier, bei all nolauschterer der souguer gemaach ginn vun de Korrelatioun tëscht Pair-schlau Variant an der increment vun M-value vun dëser Grupp ginn r VerfÜgung 2 = 0.956 festleet. Fir "Mo. Kriibs Zell Linnen, déi héich V 4/5 (0.018) a V 5/6 (0.028) Wäerter wéi V 2/3 oder V 3/4 erklären firwat déi héich-ukomm HPRT1 an ACTB Genen soll ausgeschloss ginn. D'Korrelatioun souguer gemaach gouf r VerfÜgung 2 = 0.895. D'Korrelatioun Ech "normal Mo. Stoffer", "entholl Mo. Stoffer" an "all Mo. Stoffer" goufen r VerfÜgung 2 = 0.971, 0,996 an 0,960 bzw.. An all Zell Linnen Mo. Kriibs an Stoffer ", huet et manner Korrelatioun (r VerfÜgung 2 = 0.718). Figur 2 Duerchschnëttlech Ausdrock Stabilitéit (M) vu sechs Kandidaten Referenzmaterial Genen vun geNorm analyséiert. Ausdrock Stabilitéit waren an "non-Mo. Kriibs Zell Linnen" (A), "Mo. Kriibs Zell Linnen" (B), "normal Mo. Stoffer" (C), "entholl Mo. Stoffer (D)," all Mo. Stoffer "opgezeechent (E) an "all Mo. Kriibs Zell Linn an Stoffer (F). Déi mannst stabil Referenzmaterial Gentherapie (méi Wäert M) ass op der lénker Säit an déi stabil geschéckt (ënneschten M Wäert) ass op de Recht vun der Komplott. Déi meescht stabil Referenzmaterial Genen sech duerch stepwise Exklusioun vun der mannst stabil Genen Mëllechstrooss. VerfÜgung 3 Pair-schlau Variant Analyse vun sechs Kandidaten Referenzmaterial Genen Dorënner. Pair-schlau Variant Wäert (Vn /n + 1) war vun geNorm Analyse entsteet. Optimal Zuel vu Genen huet andeems Vn geschate /n + 1. All d'Variatioune goufen ënner de standard Limite vun 0,15. VerfÜgung Mir och NormFinder Programm zu der selwechter Donnéeën baut a berechent Stabilitéit Wäerter applizéiert. Wéi an Table 4 gewisen, beweist den niddregsten Stabilitéit Wäert stäerkste stabil Ausdrock a mir Genen no klasséiert. Déi bescht eenzeg Referenz Gentherapie fir all Grupp ass wéi follegt; "Net-Mo. Kriibs Zell Linnen" - GAPDH (0.036), "Mo. Kriibs Zell Linnen" - B2M (0.014), "normal Mo. Stoffer" - RPL29 (0.028), "entholl Mo. Stoffer" - RPL29 (0.028), "all Mo. Stoffer "- RPL29 (0.032) an" all Mo. Zell Linnen an Stoffer "- ACTB (0.029). D'Platz vun Referenzmaterial Genen fir "Mo. Kriibs Zell Linnen" war identesch mat deem vun der geNorm Analyse, mä gouf an aner Kategorien liicht anescht. NormFinder Schätzunge och déi beschte Kombinatioun vun Referenzmaterial Genen vun sub-entstoen an "all Mo. Stoffer" - RPL29-B2M (0.005) an zu all Mo. Zell Linnen an Stoffer "- 18S rRNA-B2M (0.013) .Table 4 Ranking vun de Kandidat eenzel Referenzmaterial Genen baséiert op hir Stabilitéit Wäerter aus NormFinder berechent. VerfÜgung non-Mo. Kriibs Zell Linnen VerfÜgung Mo. Kriibs Zell Linnen
entholl Mo. Stoffer VerfÜgung Normal Mo. Stoffer
All Mo. Stoffer

All Zell Mo. Linnen + Stoffer
Gene am Ranking fir
Stabilitéit Wäert
Gene am Ranking fir
Stabilitéit Wäert
Gene am Ranking fir
Stabilitéit Wäert
Gene am Ranking fir
Stabilitéit Wäert
Gene am Ranking fir
Stabilitéit Wäert VerfÜgung VerfÜgung Gene am Ranking fir
Stabilitéit value

GAPDH
0.036
B2M
0.014
RPL29
0.028
RPL29
0.028
RPL29
0.032
ACTB
0.029
RPL29
0.052
GAPDH
0.021
B2M
0.035
B2M
0.039
B2M
0.041
HPRT1
0.038
B2M
0.053
RPL29
0.029
HPRT1
0.038
HPRT1
0.042
HPRT1
0.044
RPL29
0.068
HPRT1
0.110
18S rRNA VerfÜgung 0,036 VerfÜgung ACTB VerfÜgung 0,043 VerfÜgung ACTB VerfÜgung 0,065 VerfÜgung ACTB VerfÜgung 0,052 VerfÜgung 18S rRNA VerfÜgung 0,071 VerfÜgung 18S rRNA VerfÜgung 0,112 VerfÜgung ACTB VerfÜgung 0,060 VerfÜgung 18S rRNA VerfÜgung 0,062 VerfÜgung 18S rRNA VerfÜgung 0,067 VerfÜgung 18S rRNA
0.055
GAPDH
0.082
ACTB
0.143
HPRT1
0.115
GAPDH
0.140
GAPDH
0.147
GAPDH
0.140
B2M
0.084
Target Gentherapie Ausdrock Profiler vun Referenzmaterial Genen agestallt fir normalization VerfÜgung Fir d'Evaluatioun vun der Referenz Genen vun real Situatioun beaflosst ginn, konnt mir Mo. Kriibs Zell Linnen "," all Mo. Stoffer "an" all Mo. Zell Linnen an Stoffer, well Kriibs Fuerscher 'Schwéierpunkt op Gentherapie Ausdrock zu normal an entholl Stoffer souwéi Mo. vergläichen entstanen Kriibs Zell Linnen fir eng kënschtlech studéieren. Mir applizéiert eenzeg Referenz Genen an Kombinatioune vun der famill quantification (RQ) vun GPNMB VerfÜgung als Zil Gentherapie. GPNMB ass eng transmembrane glycoprotein a spillt eng Roll zesumme mat p53 an cytokine-mediated Transkriptiouns Facteuren an ënnerscheet immun Zellen [22] an Broscht Kriibs [23]. D'RQ vun GPNMB Ausdrock vun all sechs eenzeg Referenz Genen an B2M-GAPDH alleng op "Mo. Kriibs Zell Linnen" war Verglach (Dorënner 4). D'RQs vun B2M, GAPDH als eenzeg Referenz Gentherapie an B2M-GAPDH datt déi optimal Formatioun vun Referenzmaterial Genen fir "Mo. Kriibs Zell Linnen" vun geNorm zougedréckt ähnlech héich-niddereg Musteren (Dorënner 4A, B an 4G) gin virausgesot huet. Am Verglach, schéinen de RQ vun RPL29 an engem vermeintlech nik Ausdrock vun SNU-216, mä reduzéiert Ausdrock vun SNU-719 Zell Linnen (Dorënner 4C). D'RQ vun 18S rRNA zougedréckt och nik Ausdrock vun SNU-216 mee Gang Ausdrock vun MKN-28 (Dorënner 4D). D'RQ vun ACTB an HPRT1 zougedréckt extrem reduzéiert Ausdrock vun SNU-719 an KATOIII (Dorënner 4E an 4F). Figur 4 rel quantification vun GPNMB Ausdrock am Mo. Kriibs Zell Linnen hänkt op verschiddene Referenzmaterial Genen. D'GPNMB Ausdrock zu sechs Mo. Kriibs Zell Strecken vun sechs eenzeg Referenz Genen an beschte Kombinatioun vun geNorm (mengen ± Fils) ofgeleet normalized; normalized vun B2M (A), déi GAPDH (B), vun RPL29 (C), andeems 18S rRNA (D), vun ACTB (E), HPRT1 (F) a geometreschen heeschen vun B2M-GAPDH geschéckt (G).
D'Differenz vun GPNMB RQ tëscht Mo. Stoffer normal an entholl war Patient ofhängeg. RQ ass héich an e puer erhéijen mä vis vun aneren. D'RQ vun all sechs eenzeg Referenz Gentherapie normalized net déi selwecht genau Muster show gemaach. Am Fall vun normalization vun RPL29 déi als stäerkste stabil eenzeg Referenz Gentherapie zu NormFinder an déi stabil Kombinatioun mat HPRT1 zu geNorm, déi héich-niddereg Muster vun RQ Ënnerscheed tëscht normal a entholl (Dorënner 5A) war ähnlech ze RQ vun HPRT1 virausgesot hat, obwuel et Ënnerscheed sech zu dräi Patienten (Dorënner 5B). D'RQ vun B2M (Dorënner 5c) an 18S rRNA (Dorënner 5D) zougedréckt a verschiddene Muster aus héich eenzeg Referenz Genen zu méi Patienten klasséiert. Mat ACTB (Dorënner 5E) GAPDH (Dorënner 5F), gouf den Ënnerscheed grouss; do waren an 35% vum ganzen Patienten Differenzen. D'RQ normalized vun geometreschen heescht vun RPL29-HPRT1 Kombinatioun aus geNorm (Dorënner 5G) an RPL29-B2M aus NormFinder (Dorënner 5H) zougedréckt ähnleche Muster. Wann de globale fantastesch änneren (entholl /Normal) war Verglach, RQ vun GPNMB vun B2M (T /N = 2,46 ×, vläit net VerfÜgung Azeton p VerfÜgung = 0.017) an RPL29-B2M (T /N = 2,08 ×, p VerfÜgung = 0.025) huet däitlech eng Erhéijung vun normal ze entholl Mo. Stoffer. RQ vun RPL29 (T /N = 2,23 ×, p VerfÜgung = 0.071), HPRT1 (T /N = 1.34 ×, p VerfÜgung = 0.258), ACTB (T /N = 1,60 ×, p VerfÜgung = 0.395), 18S rRNA (T /N = 1,36 ×, p VerfÜgung = 0.527) an RPL29-HPRT1 (T /N = 1,76 ×, p VerfÜgung = 0.086) huet och GPNMB Ausdrock vun entholl Mo. Stoffer waarden, mä et net statistesch relevant war. Am Verglach, awer et entgéintgesate Richtung vum Ausdrock Ënnerscheed (T /N = 0,75 ×, p VerfÜgung = 0.637) vun GAPDH. Dëst deit drophin, datt GAPDH Ausdrock vun entholl Mo. Stoffer Verglach héich erhuewen sinn op der aner Referenz Genen. Dës Resultater weist och, dass RQ Donnéeën vun Zil- Gentherapie konnt an verschidden Weeër interpretéiert ginn je op d'Referenz Genen fir normalization benotzt. Figur 5 rel quantification vun GPNMB Ausdrock zu normal an entholl Mo. Stoffer hänkt op verschiddene Referenzmaterial Genen. D'GPNMB Ausdrock am Mo. Kriibs Stoffer (staark Potto: Normal, oppen Potto: entholl) waren déi sechs eenzeg Referenz Genen normalized an zwee Kombinatioune ofgeleet vun geNorm an NormFinder (mengen ± Fils); normalized vun RPL29 (A), déi HPRT1 (B), vun B2M (C), andeems 18S rRNA (D), vun ACTB (E), GAPDH (F), geometreschen heeschen vun RPL29-HPRT1 (G) an RPL29-B2M (H). VerfÜgung Fir d' 'all Mo. Kriibs Zell Linnen an Stoffer, NormFinder an geNorm virausgesot 18S rRNA-B2M an 18S rRNA-ACTB als déi bescht Kombinatiounen. D'Muster vun GPNMB RQ vun geometreschen heeschen vun deenen Kombinatioune war ähnlech tëscht hinnen. GPNMB RQs tëscht 'Mo. Kriibs Zell Linnen "an" all Mo. Stoffer' kéint mat 18S rRNA-ACTB bannent selwescht verglach gin, mee et war 1 Logbuch vun Uerdnung Ënnerscheed vun 18S rRNA-B2M geschéckt. Musteren vun RQ am "Mo. Kriibs Zell Linnen" (Dorënner 6A, 6B) waren ähnlech ze RQ vun B2M-GAPDH (Dorënner 4G), mee RQ vun "all Mo. Stoffer" vun 18S rRNA-ACTB (Dorënner 6B) aus verschiddene waren ( Figur 5G, 5H). Et schéngt, datt dëst Resultat bäidroen kéinten vill Ausdrock 18S rRNA fräi fir an entholl Mo. Stoffer (Dorënner 1). Sou, wann dës Kombinatioune als beschte virausgesot huet, sinn se fir d'Interpretatioun vun Donnéeën net gëeegent. Figur 6 rel quantification vun GPNMB Ausdrock an der Schwämm vun all Mo. Kriibs Zell Linnen an Stoffer hänkt op verschiddene Kombinatioune vun Referenzmaterial Genen. D'GPNMB Ausdrock am Mo. Kriibs Zell Linnen an Mo. Stoffer (staark Potto: Normal, oppen Potto: entholl) waren déi zwee Kombinatioune normalized ofgeleet vun geNorm an NormFinder (± Fils heeschen); normalized vun 18S rRNA-ACTB zu Zell Mo. Kriibs Linnen (A) an Mo. Stoffer (C) an normalized vun 18S rRNA-B2M am Mo. Kriibs Zell Linn (B) an Mo. Stoffer (D). VerfÜgung Diskussioun VerfÜgung Ënnerscheed Gene Ausdrock zu Kriibs aus transcriptome Etude identifizéiert hindeit, datt e puer spezifesch Genen kéint zu tumorigenesis an Metastasen vum Kriibs betraff sinn. RT-qPCR ass e sécherlech a speziell Method fir d'Confirmatioun vun der Identitéit vum Kandidat Genen vun Mo. Kriibs, well et och ganz schwaach Signaler vun extrem kleng Quantitéiten vun biopsied Echantillon bieden wann de Patient am fréie Phase vun Kriibs ass. Allerdéngs, an d'Feele vu passenden Referenzmaterial Genen, kritt Donnéeën versichen Fro un misinterpretation Haaptfiguren. Virum dëser Etude, kee validéiert Referenzmaterial Gentherapie gouf fir "Mo. Kriibs Zell Linn 'oder' Mo. Kriibs Otemschwieregkeeten 'identifizéiert, mä ACTB an GAPDH hunn déi dacks bis elo an verschidden Experimenter Astellungen a Krankheete Konditiounen ouni Rücksicht vun hire onkompatibel Ausdrock gebraucht gouf . Mir iwwerpréift, zousätzlech zu ACTB an GAPDH, véier aner Referenz Genen, HPRT1, RPL29, 18S rRNA, an B2M dass fir aner Mënsch Cancers als Referenz Genen vun rezent Studien bewäert goufen. VerfÜgung Et evident ass, datt entspriechend primer Formatioun ausgesicht Punkt ass eng wichteg ab präzis Resultater ze kréien. Mir als Punkten an Dir primers folgenden. Éischt, mir adoptéiert primer besot datt virdrun gemellt waren ze hunn oder entworf eng amplicon Längt ronn 200 BP ze besëtzen. Zweet, goufen all vun der primer baut néideg déi net eng mRNA ass op d'mannst zwee Nopeschlänner exons ausser 18S rRNA Gentherapie zu span. D'virun zwee Punkten sinn op der amplification Effizienz dinn. Et ass néideg, dass Referenzmaterial Gentherapie an Zil- Gentherapie ähnlechen amplification Effizienz erhalen [13]. Amplicon Längt ass enk Famill mat amplification Effizienz [24]. Sou géif een ähnlechen Effizienz vun amplicon vun ähnlechen Längt erwaarden, a méi Efficacitéit aus enger kuerz amplicon. De Virdeel vu kuerz amplicon, 70-250 BP, an RT-qPCR ass dass amplification "onofhängeg" vun RNS Qualitéit ass [25]. D'amplification Effizienz ass och vun gDNA kontaminéierte betraff, well kompetitiv bindend vun primers Akten als limitéieren Faktor dauernd Ofsenkung vun amplification Effizienz [13]. An dësem Kontext, ass DNaseI Behandlung während der RNS Offäll entscheedende amplification vum Reschtoffall gDNA ze verhënneren, mä et wier vläicht net ganz effikass ginn. Dofir, fir eis zweet Rücksicht hëlleft mat gDNA mat verschiddene amplicon Gréisste méiglech kontaminéierte z'entdecken. Mir confirméiert datt all vir an ëmgedréint primer op verschiddene Exon vun BLAT Recherchen iwwert Mënsch Nepgen Message an och war verankert ass, datt et kee Implikatioune Produit aus contaminating gDNA mat verlängert amplicon Längt (Table 2). Nieft, mir suergen och den héich Qualitéit vun RNS, déi ab Material, op verschidde Manéieren. Mir standing och d'Experiment an triplicate fir all Gentherapie an all Prouf. VerfÜgung Zënter der Entwécklung vun qPCR, waren e puer statistesch Programmer entwéckelt optimal Referenzmaterial Genen ze identifizéieren. Mir hate geNorm an NormFinder d'Stabilitéit vun de sechs Referenzmaterial Genen ze analyséiere mir studéiert. D'geNorm Programm rechent M-Wäerter baséieren op der Moyenne Pair-schlau Variant vun engem bestëmmte Gentherapie Verglach mat all aner Genen Kandidat Referenzmaterial studéiert a verléiert se [8]. Am Verglach, bestëmmten NormFinder eng Strategie, "Modell-baséiert Approche zu Estimatioun vun Ausdrock Variant" genannt [7].

• An Silico Analyse vun Gastric carcinoma Serial Analys vum Gene Expression Bibliothéiken verréid verschiddene Profiler mat ethnicity
• Adjuvant Chimio-Stralung fir gastric adenocarcinoma: eng institutionell Erfahrung