Želodca patogen človek Helicobacter pylori je potencialno aceton karboksilaza, ki poveča njeno sposobnost, da kolonizira mice

želodčni patogen ljudi Helicobacter pylori
ima potencialno aceton karboksilaza, ki poveča njeno sposobnost, da kolonizira miših
Povzetek
ozadja
Helicobacter pylori
colonizes človeški želodec in je etiološko sredstvo peptičnega. Vsi trije H. pylori
sevi, ki so jih sekvencirali do sedaj vsebuje potencialno operon katere izdelke delež homologijo z podenot acetona karboksilaza (kodirani z acxABC
) od Xanthobacter autotrophicus
sev Py2 in Rhodobacter capsulatus
sev B10. Aceton karboksilaze katalizira pretvorbo aceton acetoacetata. Geni gorvodno od domnevnega acxABC
operon kodirajo encime, ki pretvarjajo acetoacetat za acetoacetilno-CoA, ki se presnavlja dodatno ustvariti dve molekul acetil-CoA.
Rezultati
želite ugotoviti, če je H. pylori acxABC
operon ima vlogo pri gostiteljici kolonizacije v acxB
homolog v H. pylori
SS1 sev-miške prilagojen deaktivirali z kloramfenikol odpornost (cat
) kasete. V študijah z miško kolonizacija
številke H. pylori opomogla od miši, cepljenih z acxB: cat
mutant so bili na splošno od enega do dveh velikostnih razredov nižje od tistih, izterjati od miši, cepljenih z starševskega seva. Statistična analiza podatkov z test Wilcoxonov Rank navedeno razlike v številu H. pylori PODJETJA
izolirali iz miši, cepljenih z dvema sevi so pomembne na ravni 99% zaupanja. Ravni acetona, povezanih z želodčnega tkiva, odvzetega iz neokuženih miši in ugotovili, da se giblje od 10-110 μmols na gram mokre mase tkiva
Zaključek
kolonizacija okvar acxB:. Mačka
mutant predlaga, vlogo za acxABC
operon preživetja bakterije v želodcu. Proizvodi na H. pylori acxABC
operon lahko deloval predvsem v izkoriščenosti z acetonom ali lahko kataliziranje povezano reakcijo, ki je pomembna za preživetje ali rast v gostitelju. H. pylori
naleti pomembne ravni acetona v želodcu, ki ga je lahko uporabljala kot potencialni elektron donor za microaerobic dihanje.
Ozadje
Helicobacter pylori
je mikroaerofilnih, gram-negativne bakterije, ki je pomemben patogen želodčne sluznice človeškega [1, 2]. Kolonizacija želodčne sluznice s H. pylori
vodi do kroničnega vnetja, ki lahko napreduje do različnih bolezni, vključno kronične gastritis, čira na želodcu, rak želodca in-sluznice povezan limfom [3-5]. V odsotnosti antimikrobne terapije, gostitelj je verjetno, da trpijo doživljensko H. pylori
okužbo želodčne sluznice.
Sposobnost H. pylori
da bi vztrajal v človeškem želodcu dalj časa kaže, da je je dobro prilagojen za pridobitev hranilnih snovi, ki jih potrebuje za rast v to edinstveno nišo. Na primer, sluznica plast želodca miške vsebuje znatne količine molekularnega vodika (17-93 uM), ki izvira iz metabolne aktivnosti mikrobne flore v debelem črevesu [6]. H. pylori
je sposoben uporabo te molekulsko vodik kot elektron donor za microaerobic dihanja in funkcionalno hidrogenazo za uspešno kolonizacijo miši zahteva H. pylori
[6, 7]. Za razliko od mnogih bakterij na vodik oksidacijo, pa H. pylori
ne more avtotrofna CO 2 posnetka.
Številne študije so raziskovali možnosti H. pylori
izkoristiti različne vire ogljika. H. pylori
ima omejeno sposobnost za pridobivanje in presnovi sladkorjev, je ugotovitev, da je v skladu z analizo genomskih zaporedij H. pylori
sevov 22695 in J99 [8]. Glukoza je edini ogljikov hidrat, ki je H. pylori
sposoben uporabo, ki jo naredi preko Entner-Doudoroff poti [9, 10]. Aminokisline služi tudi kot vir ogljika za H. pylori
in jih uporabimo prednostno s H. pylori
v rastnem mediju, ki vsebuje mešanico glukoze in aminokislin [9, 11]. Piruvat, ključni intermediat v osrednjem presnovo se zdi, da se ustvari predvsem iz laktata, alanin in serin namesto glukoze v H. pylori
[12, 13]. Piruvat pretvori v acetil-CoA, ki piruvata: flavodoxin oksidoreduktazo v H. pylori
, ki lahko nato uvrstili v trikarboksilno kislino (TCA) cikel [14]. Poleg tega lahko alanin, laktat, acetat, format in sukcinat se proizvaja z H. pylori
celic inkubiranih aerobno [12]. Proizvodnja acetat in formiata kot presnovnih produktov kažejo na obstoj mešane kislino fermentacije pot v H. pylori
, čeprav je kisik bistvena za rast bakterije [12].
Analiza genomskih zaporedij H . pylori
sevov 26695, J99 in HPAG1 pokazala potencialno operon treh genov (označeno kot HP0695, HP0696 in HP0697 v H. pylori
26.695) izdelki, katerih skupno 50-63% identičnost aminokislin z ß , α, in y podenote acetona karboksilaza iz Xanthobacter autotrophicus
seva Py2 in Rhodobacter capsulatus
sev B10 [15]. Homologov v acetonu karboksilaza najdemo v številnih bakterij, toda X. autotrophicus
in R. capsulatus
encimi so najboljše označen. Aceton karboksilaze katalizira ATP-odvisen karboksilacija aceton acetoacetat je potrebna za rast X. autotrophicus
in R. capsulatus
z acetonom kot edinega vira ogljika in elektron donor za dihanje [15-17]. X. autotrophicus
aceton karboksilaze ima visoko afiniteto za acetonu (Km = 8 um), vendar se stopnja fluktuacije encima je zelo počasen (~ 45 na minuto) [15]. Nadomestilo za nizko stopnjo realizacije acetona karboksilaza, X. autotrophicus
proizvaja velike količine encima (17-25% celotnega topnega proteina), ko goji na acetona [15]
genov, ki se nahajajo v bližini H. pylori
HP0695-HP0696-HP0697 operon kodirajo encime izkazalo za pretvorbo acetoacetat na acetoacetilno-CoA, ki je nadalje presnavlja do acetil-CoA [8, 18]. Aceton, acetoacetat in 3-β-hidroksibutirat so ketonska telesa, ki jih sesalcev perivenous hepatocitov med razgradnjo maščobnih kislin in se uporabljajo kot elektron donatorji za dihanje, ko so ogljikovi hidrati niso na voljo [19]. Tako kot so ketonska telesa pomemben vir energije za ljudi, ko so ogljikovi hidrati niso na voljo, lahko te spojine delujejo kot dihalna elektronov donatorji za H. pylori
kolonizacije želodčno sluznico. Da bi ugotovili, ali ima HP0695, HP0696, HP0697 operon vlogo pri gostiteljici kolonizacije smo inaktiviran HP0696 v H. pylori
seva SS1. HP0696 mutant bila ogrožena v njegovo sposobnost, da kolonizira miši, ki kažejo, da je aceton karboksilacijo ali povezanih encimsko aktivnost produkti HP0695, HP0696, HP0697 operon v katalizirano je pomembno prispevalo k temu, da gosti kolonizacijo.
Rezultati
H. pylori
vsebuje nabor genov napovedanih, da sodelujejo pri metabolizmu acetona
treh H. pylori
sevov, katerih genomi so zaporedje vsebuje skupek osmih ohranjenih genov znotraj zaporedja kb DNA ~ 10, od katerih jih je šest kodirajo encime predvidoma prebavi aceton in acetoacetat do acetil-CoA (sl. 1 in 2). Helicobacter acinonychis
, sorodne vrste, ki okuži velika mačji, ima tudi ta gen grozda. Kot je navedeno zgoraj, tri od teh genov delijo homologijo z acxABC
, čeprav sta prva dva gena v operon označena kot geni, ki kodirajo izkoriščenosti hidantoin protein A in methylhydantoinase, oziroma v označenih H. pylori
genomov. Hydantoinases katalizirajo hidrolizo 5-členskih obročev preko hidrolize notranjega imida vez in imajo pogosto precej široko substrata specifičnost. Proteinov v baze podatkov, katerih biokemična funkcije so dokazali, analiza BLAST je pokazala, da se predvidene izdelki na H. pylori
genov najtesneje ujemajo s tistimi na Xanthobacter
sp. Py2 acxABC
operon (59-68% identitete aminokislinske preko celotne dolžine treh napovedanih podenot). Za nazadnje zaporedje H. pylori
in H. acinonychis
genomov zadnjo gen operon je obrazložen kot acxC
[20, 21]. Tako, na H. pylori
HP0695, HP0696, HP0697 operon verjetno kodira aceton karboksilaza namesto hydantoinase, in s tem se sklicuje na ta operon kot acxABC
. Slika 1 Organizacija genov, ki sodelujejo pri metabolizmu acetona v H. pylori in H. acinonychus sevov. Gene oznake so navedene pod vsako puščico (niso pripravile na lestvici). Odprte bralne okvirje, ki niso bili dani imena genov v označenih zaporedjem nukleotidov, ki so označeni bodisi s označbo KM (za H. pylori
26695), označbo JHP (za H. pylori
J99), ali samo open številka bralni okvir (za H. pylori
HPAG1 in A. acinonychis
seva Sheeba). Ortologne geni v štirih sevov sta v isti barvi. Geni jhp0628 v H. pylori
J99 in 0671 v H. pylori
HPAG1 ustrezajo fuzijo hp0688 in hp0689 s H. pylori
26695. H. pylori
J99 in HPAG1 ima dva gena v tej regiji, jhp0629 (HPAG1_0672) in jhp0630 (HPAG1_0672), ki kodirajo tipa II DNA methyltransferase in restrikcijski encim tipa II, v tem zaporedju, in se ne najdemo v H. pylori
26695. Funkcije izdelkov genov v metabolizmu aceton grozda so opisani v besedilu. Predlagane naloge proizvodov okoliških genov so: fecA
, železo (III) dicitrate transportni protein; feoB
, železov (II) transportne beljakovine; dgkA
, diacilglicerolno kinaze; gyrA
, podenota A DNK giraze; dcuA
, anaerobna C4-dikarboksilat transporter; in ansB
, asparaginaza II.
Slika 2 Predlagana pot za izkoriščanje acetona v H. pylori. Predlagana pot za pretvorbo acetona, acetil-CoA v H. pylori
in H. acinonychis
je prikazano na sliki. so navedene reakcije in geni, ki kodirajo encime, ki so odgovorni za katalizira vsako reakcijo
dveh drugih genov znotraj gena grozda, pametnim stiskanjem
(HP0691) in scoB
(HP0692), kodiranje sukcinil CoA. acetoacetata CoA-transferaze ( SCOT), ki katalizira pretvorbo acetoacetatno plus sukcinil-CoA v acetoacetilno-CoA plus sukcinat [18]. Acetoacetila-CoA proizvaja Scot je nadalje presnavlja acetoacetila-CoA tiolazo, ki ga kodira Fada
(HP0690; gen se označi kot THL
in H. pylori
J99 in atoB
in H. pylori
HPAG1 in H. acinonychis
), da se tvorita dva molekule acetil-CoA iz acetoacetilno-CoA plus koencim A (CoA) [8]. Preostala dva gena v tem grozdov, HP0693 in HP0694, predvidoma za kodiranje kratke verige permease maščobne kisline in zunanji membranski protein, v tem zaporedju, in lahko deluje pri prevozu acetoacetata.
Osem genov v tej domnevni acetona metabolizma grozda razporejena enako relativno med seboj v treh H. pylori
sevi, toda grozd je usmerjen na enega od dveh možnih smereh (sl. 1), ki označuje nastop inverzije DNA v tej regiji med razvojem H. pylori
. Trase zaporedij DNA iz treh sevov zmanjšal mesto za inverzijo na ~ 40 bp nizvodno od področij acxC
homolog in ~ 160 bp navzgor od začetnega kodona za Fada
(podatki niso prikazani). Ni velike neposredne ali obrnjeni ponavlja se nahajajo v bližini teh regijah, ki so lahko vključene v inverzije, in zato ne moremo špekulirajo, da bi mehanizem za to inverzije. Za H. pylori
sevov J99 in HPAG1, ne pa 26695, obstaja napovedano tipa II DNK metiltransferazo (jhp0629 in HPAG1_0673) in omejitev encim tipa II (jhp0630 in HPAG1_0672) sosednji domnevnega aceton presnova gena grozda.
H. acinonychis
ima domnevnega presnovo aceton genov grozda in geni v skupini, so v istem usmerjenosti kot tiste v H. pylori
J99. V H. acinonychis
so ti geni, ki mejijo na dgkA
in gyrA
, saj so v H. pylori
, vendar so obdane na nasprotnem koncu, ki ga dcuA
in ansB
. FecA
in feoB
geni, ki se nahajajo v bližini metabolizma aceton gena kopica v H. pylori
sevi, so ~ 69 kb tega gena grozda v H. acinonychis
. Tako je relativna razporeditev genov v metabolizmu aceton grozda je ostala izjemno ohranja pri razvoju H. pylori
in H. acinonychis
kljub dejstvu, da je sosednja regija genomih teh dveh vrst obdelano . obsežne preureditve
H. pylori acxB: cat
mutant je pomanjkljiva v njegovo sposobnost, da kolonizira miši
acxB
gen v H. pylori
SS1, ki je sev miši prilagojeno , je bil prekinjen z upor kloramfenikol (cat
) kasete. Kulture z divjim sevom H. pylori
SS1 in acxB: cat
mutant gojimo v Mueller-Hinton bujon z dodatkom konjskega seruma ali prej opisanega definiranem mediju [22]. Različne količine acetona v območju od 1,3 mM do 26 mM bili vključeni v medijih rasti bi ugotovili, ali aceton vplivala rast bodisi seva. Rast celic smo kontrolirali s sposobnih število celic, kot tudi optične gostote kultur ob različnih časih. Vključno z acetonom v obeh medijih rasti ni imela nobenega vpliva na stopnjo rasti ali izplena končno celic H. pylori
SS1 ali acxB: mačka
mutant (podatki niso prikazani). Neuspeh acetona za spodbujanje rasti H. pylori
SS1 pod pogoji testiranih ni nepričakovano, saj so mediji rasti za H. pylori
zelo hranili bogat. Te ugotovitve kažejo tudi, da se acxABC
ni potrebno za acetona razstrupljanje
sposobnost acxB:. Mačka
mutant kolonizirati miši je bil v primerjavi z starševsko H. pylori
SS1 seva v dveh ločene poskuse. V vsakem preskušanju so enajst miši inokulirali s seva divjega tipa in enajst cepimo z acxB: mačka
mutant. Tri tedne po inokulacijo miši s H. pylori
sevi so bile miši žrtvovali in smo določili številke H. pylori
v želodcev teh živali. Pri miših, ki so bile inokulirano sev divjega tipa, večina živali (19/22 živali) je imel H. pylori
šteje, da so bile precej nad mejo detekcije, kar je 500 cfu na gram želodec (sl. 3). Število H. pylori
v vzorcih, ki so bili nad mejo detekcije v razponu od 10 4 - 10 6 cfu na gram želodec. Večina miši, cepljenih z acxB: mačka
mutant so imeli tudi merljive ravni H. pylori
(15/22 živali), vendar je število H. pylori PODJETJA
povezana s temi miših so bili na splošno eno do dva reda velikosti nižja od tiste pri miših, ki so bile inokulirane z sev divjega tipa. Statistična analiza podatkov z test Wilcoxonov Rank preverjeno, da so bile razlike v številu H. pylori PODJETJA
izolirane iz miši, cepljenih z dvema sevov pomembna na ravni 99% zaupanja, kar pomeni, da aceton karboksilaza okrepljeno sposobnost H. pylori
SS1 za kolonizacijo želodec miške. Ker nismo mogli klonirati v acxABC
operon nismo mogli preveriti s dopolnjevanja, da je bil v acxB
mutacija odgovoren za napake v kolonizacije. Vendar pa je malo verjetno, da je kolonizacija fenotip v acxB
mutant zaradi polarnih učinkov, saj ni nobenih dodatnih geni in v acxABC
operon v katerem koli od treh H. pylori
sevov, katerih genomi so bili zaporedje doslej (sl. 1). Poleg tega je kolonizacija napaka ni verjetno posledica oslabitve ali sekundarni mutacije, saj smo zgradili na acxB
mutant na svež izolatom seva SS1 predelanega iz okuženega miško. Slika 3 Mouse kolonizacija vsebnosti H. pylori SS1 in izogenimi acxB: mutant mačka. Podatki so predstavljeni kot razprševanje parcelo formirajo kolonijo enot na gram želodca kot ga določa števila plošč. Vsaka točka predstavlja cfu štetje iz ene miši, izražena kot vrednost log10 (CFU /g v želodcu) v Y-osi. Bazna linija [log10 (cfu /g želodec) = 2.7] je meja odkrivanje testa, ki predstavlja število pod 500 cfu /g želodec.
Ravni aceton v želodcu miške
Ker se podatki iz miške kolonizacija testi kažejo, da možnost, da se uporabi acetona s H. pylori
je pomembno za učinkovito gostiteljice kolonizacije, smo želeli ugotoviti, ali H. pylori PODJETJA
naleteli na pomembne ravni aceton v želodcu miške. Čeprav so poročali vrednosti aceton različnih telesnih tekočinah, sva odkrila nobenih poročil o nivojih acetona, povezanih z želodčnim sokom ali tkiva. Zato smo izmerili raven aceton, povezane z miško želodčnega tkiva po hitro odstranjevanje želodce od miši in takoj dajanje želodcev v zaprtih vial v serumu. Ker smo želeli oceniti stopnjo aceton, da H. pylori
lahko naletite med trdovratne okužbe, so bile živali, ki se uporabljajo za te študije ohraniti na rednem urniku hranjenja in so žrtvovali zjutraj pred prejemom običajno dnevno hrano dodelitve. Zapečatene serumu Viale vsebujejo miši želodcev inkubiramo na ledu, da se omogoči aceton povezana z želodčno tkiva k ravnotežju s plinsko fazo v vialah, nakar so bili vzorci faza plin analizirajo s plinsko kromatografijo. Ta postopek je bil najprej naredili z žrtvovanjem živali in odstranitev želodce. Podobne rezultate pa smo dobili z odstranitvijo želodcev iz živih živali, ki so bile anesteziranih. Količino acetona povezan z želodčnega tkiva za vsako posamezno miš gibala v razponu od ~ 10 do 110 μmols acetona na gram mokre teže tkiva (sl. 4), pri večini vrednostmi (6/7), ki spada v razponu od 10 do 35 μmols acetona na gram tkiva mokro težo. Ti podatki kažejo, da so milimolarno količine acetona, povezane z miško želodčnega tkiva in je lahko na voljo kot morebitni ogljika ali vira energije za H. pylori
. Ta stopnja acetona povezanega z miško želodčnega tkiva bil višji od tistega, smo pričakovali od vrednosti serumskih ketonskih teles razlikujejo pri ljudeh in drugih sesalcih običajno giblje od < 0,5 mm do nekaj milimolaren [23]. Aceton nastaja pri sesalcih, ki ga spontano dekarboksilacijo acetoacetata in to dekarboksilacija se poveča pri nizkem pH, zato aceton lahko nabirajo v želodcu zaradi želodčne kisline. Slika ravni 4 aceton, povezane z miško želodčnega tkiva. Ravni acetona v želodcu so se za tri miši po žrtvovanju živali in takoj odstranite svoje želodce (post mortem), in za štiri miši, ki so bile anesteziranih po kateri so njihovi želodci odstranili (pre mortem). Izrezali želodcev mišje smo takoj premestiti v zaprtih kivetah, ki smo nato dali na led za vsaj 30 minut, da se omogoči aceton povezana z želodčno tkiva k ravnotežju s plinsko fazo. Ravni acetona v fazah plinov vial smo izmerili s plinsko kromatografijo in oceniti iz standardne krivulje, generirane pri vsaki viali. Vsaka vrednost predstavlja povprečno najmanj treh meritev in napak palice kažejo standardnih odklonov za vsak vzorec.
Debato
Nudimo dokaze, da je H. pylori
imajo funkcionalno aceton karboksilaza kot prej domnevamo, ki Ensign in sodelovanja -workers [15]. V H. pylori acxABC
operon je v bližini scoAB
in fadB
genov, ki kodirajo encime, območni in acetoacetilno-CoA tiolazo. Tako je ta gen grozd kodira nabor encimov, sposobnih presnovo aceton, acetil-CoA. Acetil-CoA, proizvedene iz acetona in acetoacetata lahko upoštevajo STS ciklu dajejo energijo za H. pylori
. Kot ugotavlja Pflock in sodelavcev delavci acxABC
operon in drugih genov, povezanih z metabolizmom acetona so prisotne v H. acinonychis
[24]. Ti geni so odsotni, pa je v drugi tesno povezana ε-Proteobacteria katerega genome doslej zaporedje, ki vključuje Helicobacter hepaticus
, Campylobacter jejuni
, Thiomicrospira denitrificans
in Wolinella succinogenes
. Pridobitev in vzdrževanje acetona metabolizma gena grozda v H. pylori
in H. acinonychis
je lahko povezana z dejstvom, da za razliko od teh drugih sorodnih ε-Proteobacteria, ki jih zadržujejo v želodčno sluznico. Strnitev teh genov in odsotnost ortologne genov v drugi tesno povezana ε-Proteobacteria lahko pomeni morebitno pridobitev teh genov s H. pylori
in H. acinonychus
preko bočnega prenosa genov. Vsebnost G + C tega grozda presnove aceton genov v H. pylori
je nekoliko višja od povprečja v celotnem genomu, vendar se zdi zaradi izdelkov iz teh genov je zelo bogato z glicinom (~ 10% pa jih primerjati do 6% genoma povprečja). Poleg tega, značilnosti sestavo teh genov, kot dinukleotidom relativne številčnosti in kodonskega pristranskosti, ne kaže znakov nedavnega bočnega prenosa te regije [25] (J. Mrázek, osebna komunikacija).
Jungblut in sodelavci so poročali, da H . pylori
AcxC (HP0698) navzkrižno reagira s protitelesi iz adenokarcinomom bolnika, kar pomeni, da je H. pylori acxABC
operon izražen v gostitelju [26]. Poleg tega smo pokazati tukaj, da H. pylori
lahko naletijo pomembne ravni acetona v želodcu miške in zato je ta spojina lahko služi kot pomemben dihal elektron donor za bakterije v gostitelju. V skladu s to hipotezo, je na H. pylori acxB
mutant bistveno zmanjša njegovo sposobnost, da kolonizira želodec miške, ki sklepamo rezultate iz nezmožnosti mutanta izkoristiti aceton kot vira energije. Nezmožnost acetona za spodbujanje rasti H. pylori
SS1 v tekoči kulturi lahko posledica neuspeha rastnega medija, ki se uporabljajo za posnemajo pogoje za rast s katerimi se srečujejo bakterija, ko kolonizacije želodčne sluznice. Alternativna hipoteza za kolonizacije okvar acxB
mutant je, da je potrebno acetona karboksilaza za razstrupljanje acetona. Vendar pa naš neupoštevanje zaviranja pri rasti v acxB
mutant z dodatkom acetona v gojitvenem mediju, nasprotuje tem zadnjem hipoteze. Druga možnost je, da so izdelki v acxABC
operon katalizirajo neznano reakcijo, ki je pomembna za preživetje in celično rast H. pylori
v želodčni sluznici. Nadaljnje biokemijska karakterizacija produktov na H. pylori acxABC
operon naj bi pomagalo razlikovati med temi possibililties.
Nedavna analiza transkriptome H. pylori
26695 uporabo cel genom mikromrež je predlagal, da regulator odgovor HP1021 močno aktivira transkripcijo acxABC
in scoAB
, in aktivnim transkripcijo Fada
in hp0693 v manjšem obsegu [24]. Avtorji te študije so pokazali, da HP1021 veže na promotor regulativnega regijo acxABC
, kar kaže, da je ta regulator odziv neposredno posreduje njegove učinke na transkripcijo acxABC
in da geni v metabolizmu aceton grozda so del regulon nadzorovano s HP1021. Pflock in kolegi identificirati 79 genov v H. pylori
26695, katerega izraz je bil spremenjen v HP1021 mutant - 51 geni so bili prepisani na nižjih ravneh v mutant pa je bilo 28 genov, izražena na višjih ravneh [24]. HP1021 razlikuje od večine drugih regulatorjev za ukrepanje v tem, da nima zelo ohranjeno-fosfat sprejemanje aspartat ostanke, in ni bila ugotovljena sorodni histidin kinaza za HP1021. Obstajajo nasprotujoča si poročila o transkripcijo HP1021 v odgovor na kislem pH, kakor tudi za prepis H. pylori acxABC
odgovor za znižanje pH [27-29]. Te razlike so lahko zaradi načina, na katerega so bili kultivirani bakterije. Čeprav so ta poročila konflikta v zvezi s prepisom HP1021 v odgovor na kislem pH, rezultati obeh študij kažejo, da pogoji, ki vodijo do zmanjšanjem števila HP1021 rezultata povečano izražanje acxABC
. To se zdi protislovno, glede na navidezno vlogo HP1021 pri aktiviranju transkripcijo acxABC
.
Le druge bakterije, za katere je bila preučila ureditev v acxABC
operon je X. autotrophicus
. Transkripcije nadzor acxABC
in X. autotrophicus
razlikuje od tistega v H. pylori
. X. autotrophicus
nima homolog HP1021, temveč ureja prepis acxABC
preko σ 54 (RpoN) in σ 54-odvisne aktivator AcxR [15]. Čeprav H. pylori
ima σ 54, v acxABC
operon ni del H. pylori
RpoN regulon [30].
Kljub naši ugotovitvi, da motnje acxB
negativno vpliva na kolonizacijo miši s H. pylori
SS1, zadnjih cele študije genoma mikromrež z šestinpetdeset globalno reprezentativnih sevov H. pylori
in štiri H. acinonychis
sevi so pokazali, da v acxABC
geni niso prisotne v vseh H. pylori
sevov [31]. Zanimivo bi bilo ugotoviti, če so izolati nimajo acxABC
so manj konkurenčne na kolonizacijo svoje naravne gostitelje kot sevi, ki imajo te gene. Druga možnost je, seve, brez acxABC
lahko prilagoditve, ki nadomeščajo pomanjkanje aceton karboksilaza dejavnosti. Izsledki študij mikromrež po Gressmann in kolegi, je pokazala, da so bili scoAB
, Fada
, HP0693 in HP0694 prisotna v vseh H. pylori
in H. acinonychis
sevov pregledani [31]. Tako selektivno tlak ohranja možnost izkoristiti acetoacetat kot potencialni elektron donor v H. pylori
in H. acinonychis
zdi, da je večja od tiste, za presnovo acetona.
Zaključek
H . pylori acxABC
operon verjetno kodira aceton karboksilaza, ki katalizira pretvorbo aceton acetoacetata in je tesno povezano z geni, katerih izdelki so napovedali, da katalizirajo zaporedno pretvorbo acetoacetata do acetil-CoA. Pregled genomov drugih tesno povezana ε-Proteobacteria kažejo, da so prisotni le v bakterijah v tem poddebla ki zadržujejo želodčne sluznice geni vključeni v metabolizem acetona. V acxABC
operon ni bistvenega pomena za miške kolonizacijo s H. pylori
SS1, vendar ni videti, da povečanje kolonizacijo. Nadaljnje karakterizacija domnevnega H. pylori
aceton karboksilaza in proizvodov iz drugih genov v acetona metabolizma genski skupini morajo zagotoviti vpogled v to, kako ketonska telesa iz gostitelja prispevajo k presnovnih gospodarstva H. pylori
in H . acinonychis
in kako te spojine vpliv na sposobnost teh bakterij kolonizirati svoje gostitelje.
Metode
bakterij in mediji
plazmida gradnjo in kloniranje je bilo narejeno v E. coli
seva DH5α ki je gojimo v Luria-Bertani mediju pri 37 ° C. H. pylori
sev 26.695 uporabimo kot šablono za verižni reakciji s polimerazo (PCR). H. pylori
SS1 bila uporabljena kot divji tip seva za vse poskuse in je kultiviramo na obeh krvni agar ali triptičnih sojinem agarju z dodatkom 5% konjski serum (TSA-seruma) pri 37 ° C v atmosferi 4% O 2, 5% CO 2 in 91% N 2. Ko gojimo v tekočem mediju, so H. pylori
kulture gojijo v Mueller-Hinton brozge dopolnili s 5% konjskega seruma in 30 ug /ml bacitracina ali opredeljeno gojišča s Bruggrabber in sodelavci [22] opisanega. Kulture (10-15 ml zrasla medij) gojimo v 150-ml viale serumskih zapečatenih s 20 mm Teflon /silikonskih ploščic in aluminijastimi kapicami in v atmosferi 4% O 2, 5% CO 2, 10 % H 2, 81% N 2. Če ni drugače označeno, ko so bili vključeni antibiotikov v mediju so bili v naslednjih koncentracijah doda: 100 mg /ml ampicilina, 30 ug /ml kloramfenikol, 200 ug /ml bacitracina 10 ug /ml vankomicin in 10 ug /ml amphotericin B.
Inaktivacija acxB
(HP0696) v H. pylori
SS1
A 2,3-kb DNA fragment, ki izvaja acxB
smo pomnožili s PCR s H. pylori
seva 22695 in klonirali v pGEM-T (Promega). Mačji
kaseta je bila uvedena v tej plazmida v eko
47III mestu, ki se nahaja približno na sredini klonirane acxB
. Nastali plazmid je bil uporabljen kot samomorilski vektorja inaktivira kromosomsko kopijo acxB
v H. pylori
SS1. Samomor Vektor je bil uveden v H. pylori
sevov ATCC 43504 in SS1, sev, ki lahko naselijo miši. Ker je bila prijavljena ponoviti prehod H. pylori
seva SS1 na mediju za posledico izgubo nalezljivosti pri miših, je v acxB
mutant zgrajena v sveži izolatom seva SS1 predelanega iz okuženega miško. Število prehodov za acxB
mutant v sev SS1 bil omejen in zapiše in mutant smo shranili zmrznjeno pri -80 ° C. SS1 sev staršev se je ohranila in shranjeni zamrznjeni na enak način. Potrdili smo s PCR, da je kromosomsko kopijo acxB
moten z izmenjavo alelov z prenašajo plazmida kopijo gena uporabo niz začetnih oligonukleotidov, ki obdajata mesto motenj.
krivulje rasti za H. pylori
sevi
so H. pylori
celice iz TSA-serumskih plošč, na katerih so bili sevi progasta na prejšnji dan, se sprostijo v-fosfatnim pufrom (PBS), ki se uporabijo za inokulacijo tekočega medija na oD 600 z dne 0.03. Kjer je navedeno, je acetona dodamo aseptično mediju. Vzorci so bili odvzeti v različnih časih in gostote celic smo merili z sipanja svetlobe na OD 600. Alternativno, je bilo število živih celic določimo po serijske razredčitve vzorcev in prevleka na TSA-seruma. Po 4 do 5 dni inkubaciji smo število kolonije, ki tvorijo enote (CFU), določena za ploščama.
Mouse Kolonizacija
Mouse Kolonizacija teste smo izvedli v bistvu, kot je opisano zgoraj [32]. Ti postopki v skladu z ustreznimi zveznih smernic in institucionalne politike za nego in oskrbo laboratorijskih živalih. Na kratko, H. pylori
celice, pridobljene po 48 urah rasti na agar ploščah krvi in ​​suspendiramo v PBS na OD 600 1,7. Headspace v epruveti škropimo z argonom, da zmanjšajo izpostavljenost kisika.

• Zdravilni potencial Picrorhiza kurroa (Scrofulariaceae) korenike proti razjed na želodcu, indometacin povzroča: a. Mehanične raziskovanje
• Odmerka odvisno zaviranje poškodbe želodca z vodikom v alkalnem elektrolizo pitno vodo