L'agente patogeno umano gastrica da Helicobacter pylori ha un potenziale carbossilasi acetone che migliora la sua capacità di colonizzare topi

L'agente patogeno umano gastrica da Helicobacter pylori
ha un potenziale carbossilasi acetone che migliora la sua capacità di colonizzare topi
Abstract
sfondo
Helicobacter pylori
colonizza lo stomaco umano ed è l'agente eziologico della malattia di ulcera peptica . H. pylori
Tutti e tre i ceppi che sono stati sequenziati fino ad oggi contengono un potenziale operone cui prodotti quota di omologia con le subunità di acetone carbossilasi (codificata dal acxABC
) da Xanthobacter autotrophicus
ceppo PY2 e Rhodobacter capsulatus
ceppo B10. carboxylase Acetone catalizza la conversione di acetone per acetoacetato. Geni a monte del putativo acxABC
enzimi operone codifica che convertono acetoacetato di Acetoacetil-coenzima A, che viene metabolizzato ulteriormente per generare due molecole di acetil-CoA.
Risultati
Per determinare se il H. pylori acxABC
operone ha un ruolo nella colonizzazione host acxB
omologo nel topo-adattato ceppo H. pylori
SS1 è stato inattivato con una cassetta cloramfenicolo-resistenza (cat
). Negli studi di colonizzazione del mouse i numeri di H. pylori
recuperati dai topi inoculati con il acxB: gatto
mutante erano generalmente uno o due ordini di grandezza inferiori a quelli recuperato da topi inoculati con il ceppo parentale. Una analisi statistica dei dati utilizzando un test Wilcoxin Classifica indicato le differenze nel numero di H. pylori
isolate da topi inoculati con i due ceppi sono stati significativi al livello di confidenza del 99%. I livelli di acetone associato con il tessuto gastrico rimosso da topi infetti sono stati misurati e risultato compreso tra 10-110 μmols per grammo di tessuto di peso fresco
Conclusione
Il difetto colonizzazione del acxB: Cat.
Mutante suggerisce un ruolo per la acxABC
operone nella sopravvivenza del batterio nello stomaco. Prodotti della H. pylori acxABC
operone possono funzionare soprattutto nell'utilizzo acetone o possono catalizzare una reazione correlata che è importante per la sopravvivenza o la crescita nell'ospite. H. pylori
incontra livelli significativi di acetone nello stomaco, che si potrebbe utilizzare come donatore potenziale di elettroni per la respirazione microaerofilia.
Sfondo
Helicobacter pylori è un
microaerofili, batterio gram-negativo che è un significativa patogeno della mucosa gastrica umana [1, 2]. La colonizzazione della mucosa gastrica da H. pylori
porta a infiammazione cronica che può progredire ad una varietà di malattie, tra cui gastrite cronica, ulcera peptica, cancro gastrico e linfoma mucosa-associata [3-5]. In assenza di terapia antimicrobica, il padrone di casa rischia di subire una vita H. pylori
infezione della mucosa gastrica.
La capacità di H. pylori
a persistere nello stomaco umano per lunghi periodi indica che si è ben adattato per acquisire le sostanze nutritive di cui ha bisogno per la crescita in questa nicchia unico. Ad esempio, lo strato mucoso dello stomaco del mouse contiene quantità significative di idrogeno molecolare (17-93 micron) derivanti da attività metabolica della flora microbica nell'intestino crasso [6]. H. pylori
è in grado di utilizzare questo idrogeno molecolare come un donatore di elettroni per la respirazione microaerobica e idrogenasi funzionale è necessario per il successo della colonizzazione topi da H. pylori
[6, 7]. A differenza di molti batteri-ossidanti idrogeno, però, H. pylori
non è in grado di CO autotrofa 2 fissazione.
Diversi studi hanno esaminato la capacità di H. pylori
di utilizzare diverse fonti di carbonio. H. pylori
ha una limitata capacità di acquisire e metabolizzare gli zuccheri, un'osservazione che è coerente con l'analisi delle sequenze genomiche di H. pylori
ceppi 22695 e J99 [8]. Il glucosio è l'unico carboidrato che H. pylori
è in grado di utilizzare, che lo fa attraverso la via Entner-Doudoroff [9, 10]. Gli aminoacidi servono anche come fonti di carbonio per H. pylori
e sono utilizzati di preferenza da H. pylori
in terreni di crescita contenente una miscela di glucosio e amminoacidi [9, 11]. Piruvato, un intermedio chiave nel metabolismo centrale, sembra essere generata principalmente dalle lattato, alanina e serina, piuttosto che il glucosio in H. pylori
[12, 13]. Piruvato viene convertito in acetil-CoA dal piruvato: flavodoxin ossidoriduttasi in H. pylori
, che possono poi alimentare il ciclo degli acidi tricarbossilici (TCA) [14]. Inoltre, alanina, lattato, acetato, formiato e succinato possono essere prodotti da H. pylori
cellule incubate aerobicamente [12]. La produzione di acetato e formiato come prodotti metabolici suggerisce l'esistenza di un percorso misto acido fermentazione in H. pylori
, anche se l'ossigeno è essenziale per la crescita del batterio [12]
. Analisi delle sequenze genomiche di H . pylori
ceppi 26695, J99 e HPAG1 rivelato un potenziale operone di tre geni (designato come HP0695, HP0696 e HP0697 in H. pylori
26695) i prodotti di cui ha condiviso 50-63% aminoacido identità con il β , α, e subunità γ di acetone carbossilasi da Xanthobacter autotrophicus
ceppo PY2 e Rhodobacter capsulatus
ceppo B10 [15]. Omologhi di acetone carbossilasi si trovano in un numero di batteri, ma R. capsulatus
X. autotrophicus
ed enzimi sono la migliore caratterizzati. Acetone carbossilasi catalizza la carbossilazione ATP-dipendente di acetone per acetoacetato ed è necessario per la crescita di X. autotrophicus Comprare e R. capsulatus
con acetone come unica fonte di carbonio e donatore di elettroni per la respirazione [15-17]. X. autotrophicus
acetone carbossilasi ha un'alta affinità per l'acetone (Km = 8 micron), ma il tasso di turnover dell'enzima è molto lento (~ 45 per min) [15]. Per compensare il basso tasso di turnover di acetone carbossilasi, X. autotrophicus
produce elevate quantità di enzima (17-25% di proteina solubile totale) se coltivate in acetone [15]
geni localizzati nei pressi del H. pylori
HP0695-HP0696-HP0697 enzimi operone codifica mostrati per convertire acetoacetato a acetoacetil-coenzima a, che viene metabolizzato ulteriormente ad acetil-CoA [8, 18]. Acetone, acetoacetato e 3-β-idrossibutirrato sono corpi chetonici prodotte dagli epatociti perivenose mammiferi durante la degradazione degli acidi grassi e sono usati come donatori di elettroni per la respirazione quando i carboidrati non sono prontamente disponibili [19]. Proprio come i corpi chetonici sono importanti fonti di energia per l'uomo quando i carboidrati non sono disponibili, questi composti possono servire come donatori di elettroni respiratori per H. pylori
colonizzare la mucosa gastrica. Per determinare se il operone HP0695-HP0696-HP0697 ha un ruolo nella colonizzazione dell'ospite abbiamo inattivato HP0696 in H. pylori
ceppo SS1. Il mutante HP0696 è stata compromessa nella sua capacità di colonizzare topi suggeriscono che carbossilazione acetone o una connessa attività enzimatica catalizzata da prodotti dell'operone HP0695-HP0696-HP0697 è un importante fattore che contribuisce ad ospitare la colonizzazione
. Risultati
H. pylori
contiene una serie di geni predetti di essere coinvolto nel metabolismo acetone
I tre ceppi di H. pylori
i cui genomi sono stati sequenziati contenere un gruppo di otto geni conservati all'interno di un ~ 10 kb sequenza di DNA, sei dei quali codificano enzimi previsto per metabolizzare acetone e acetoacetato di acetil-CoA (Figg. 1 e 2). Helicobacter acinonychis
, una specie simile che infetta i grandi felini, possiede anche questo cluster genico. Come indicato sopra, tre di questi geni condividono omologia con acxABC
, anche se le prime due geni dell'operone sono indicati come i geni codificanti utilizzazione idantoina proteina A e methylhydantoinase, rispettivamente, nei H. pylori
genomi annotati. Hydantoinases catalizzare l'idrolisi di anelli di 5-membered tramite idrolisi di un legame imide interna e spesso hanno piuttosto ampio specificità di substrato. Di proteine ​​presenti nel database le cui funzioni biochimiche sono stati dimostrati, analisi BLAST ha rivelato che i prodotti previsti della H. pylori
geni più strettamente corrispondono a quelli della Xanthobacter
sp. PY2 acxABC
operone (59-68% aminoacido identità su tutta la lunghezza delle tre subunità previsti). Per la maggior recentemente sequenziato H. pylori
e H. acinonychis
genomi l'ultimo gene dell'operone è annotata come acxC
[20, 21]. Così, la H. pylori
HP0695-HP0696-HP0697 operone probabilmente codifica acetone carbossilasi piuttosto che idantoinasi, e noi, quindi, si riferiscono a questo operone come acxABC
. Figura 1 Organizzazione dei geni coinvolti nel metabolismo di acetone in H. pylori e H. acinonychus ceppi. designazioni Gene sono riportati di seguito ogni freccia (non in scala). Aperte cornici di lettura che non sono stati dati una designazione gene nelle sequenze del genoma annotate sono indicati sia con una designazione cv (per H. pylori
26695), una designazione JHP (per H. pylori
J99), oppure solo la aperto il numero di lettura della struttura (per H. pylori
HPAG1 e A. acinonychis
ceppo Sheeba). geni ortologhi nei quattro ceppi sono dello stesso colore. I geni jhp0628 in H. pylori
J99 e 0671 in H. pylori
HPAG1 corrispondono ad una fusione di hp0688 hp0689 e da H. pylori
26695. H. pylori
J99 e HPAG1 hanno due geni all'interno di questa regione, jhp0629 (HPAG1_0672) e jhp0630 (HPAG1_0672), che codificano un tipo II DNA metiltransferasi e un enzima di restrizione di tipo II, rispettivamente, e non si trovano in H. pylori
26695. funzioni dei prodotti dei geni all'interno del cluster metabolismo acetone sono descritti nel testo. Le funzioni proposte prodotti dei geni circostanti sono: Feca
, ferro (III) proteina di trasporto dicitrate; feoB
, ferro (II) proteina di trasporto; dgkA
, diacilglicerolo chinasi; gyrA
, subunità A della girasi DNA; dcuA
, anaerobica C4-dicarboxylate trasportatore; e ANSB
, asparaginasi II.
Figura 2 percorso proposto per l'utilizzo di acetone in H. pylori. Il percorso proposto per la conversione di acetone in acetil-CoA in H. pylori Comprare e H. acinonychis
mostrato. Reazioni e geni che codificano gli enzimi responsabili per catalizzare ogni reazione sono indicate
altri due geni all'interno del cluster gene, SCOA
(HP0691) e SCOB
(HP0692), codificare succinil CoA:. Acetoacetato CoA-transferasi ( SCOT), che catalizza la conversione di acetoacetato più succinil-CoA per acetoacetil-coenzima a più succinato [18]. Acetoacetil-coenzima A prodotto da SCOT viene metabolizzato ulteriormente acetoacetil-CoA tiolasi, che è codificata dal Fada
(HP0690; gene è annotato come THL
in H. pylori
J99 e atob
in H. pylori
HPAG1 e H. acinonychis
), per generare due molecole di acetil-CoA da acetoacetile-CoA più coenzima a (CoA) [8]. I due geni rimanenti all'interno di questo gruppo, HP0693 e HP0694, sono previsti per codificare una catena corta permeasi acidi grassi e una proteina della membrana esterna, rispettivamente, e possono funzionare in trasporto di acetoacetato.
Gli otto geni all'interno di questo gruppo metabolismo acetone putative sono disposti stesso rispetto all'altro nelle tre H. pylori
ceppi, ma il cluster è orientato in una delle due direzioni possibili (Fig. 1) che indica la presenza di una inversione di DNA in questa regione durante l'evoluzione H. pylori
. Allineamenti di sequenze di DNA dai tre ceppi restrinsero il sito di inversione a ~ 40 bp a valle del acxC
omologa e ~ 160 bp a monte del codone di inizio per Fada
(dati non riportati). Non ci sono grandi ripetizioni dirette o invertite si trovano nei pressi di queste regioni che potrebbero essere stati coinvolti in inversione, e quindi non possiamo speculare al meccanismo di questa inversione. Per H. pylori
ceppi J99 e HPAG1, ma non 26695, ci sono un predetto tipo II DNA metiltransferasi (jhp0629 e HPAG1_0673) e un enzima di restrizione di tipo II (jhp0630 e HPAG1_0672) adiacente alla acetone gene cluster metabolismo putative.
H. acinonychis
possiede il gene cluster metabolismo acetone putativo ei geni all'interno del cluster sono nello stesso orientamento come quelli di H. pylori
J99. In H. acinonychis
questi geni sono adiacenti al dgkA
e gyrA
come sono in H. pylori
, ma sono affiancate sul lato opposto da dcuA
e ANSB
. Il
Feca e feoB
geni, che si trovano vicino al gene cluster metabolismo acetone nel H. pylori
ceppi, sono ~ 69 KB di questo gene cluster in H. acinonychis
. Così, la disposizione relativa dei geni all'interno del cluster metabolismo acetone è rimasta notevolmente conservata durante l'evoluzione di H. pylori Comprare e H. acinonychis
nonostante il fatto che la regione adiacente nel genoma di queste due specie ha subito . ampi riarrangiamenti
Il H. pylori acxB: gatto
mutante è carente nella sua capacità di colonizzare topi
Il acxB
gene in H. pylori
SS1, che è un ceppo di topi adattato , è stato interrotto con una cassetta di resistenza cloramfenicolo (cat
). Le colture di wild-type H. pylori
SS1 e il acxB: gatto
mutante sono state coltivate in brodo Mueller-Hinton integrato con siero di cavallo o di un mezzo definito precedentemente descritto [22]. Quantità variabili di acetone che vanno da 1,3 mm a 26 mm sono stati inclusi nei media di crescita per determinare se l'acetone influenzato la crescita di uno sforzo. La crescita cellulare è stata monitorata dal conteggio delle cellule vitali e densità ottica delle colture in tempi diversi. Tra cui l'acetone in entrambi i terreni di crescita ha avuto alcun effetto sul tasso di crescita o il rendimento delle cellule finale di H. pylori
SS1 o acxB: gatto
mutante (dati non riportati). Il fallimento di acetone per stimolare la crescita di H. pylori
SS1 nelle condizioni testate non è inaspettato in quanto i mezzi di crescita per H. pylori
è molto ricca di nutrienti. Questi risultati suggeriscono anche che acxABC
non è necessario per la disintossicazione acetone
La capacità del acxB: Cat.
Mutante di colonizzare topi è stato confrontato con quello del genitori H. pylori
SS1 ceppo in due prove separate. In ogni prova, undici topi sono stati inoculati con il ceppo wild-type e undici sono state inoculate con il acxB: gatto
mutante. Tre settimane dopo l'inoculazione dei topi con il H. pylori
ceppi, i topi sono stati sacrificati e il numero di H. pylori
nello stomaco degli animali sono stati determinati. Per i topi che erano stati inoculati con il ceppo wild-type, la maggior parte degli animali (19/22 animali) avevano H. pylori
conta che erano ben al di sopra del limite di rilevazione, che era di 500 CFU per grammo di stomaco (Fig. 3). Il numero di H. pylori
in campioni che erano al di sopra del limite di rilevazione variava da 10 4-10 6 cfu per grammo di stomaco. La maggior parte dei topi inoculati con il acxB: gatto
mutante avevano anche livelli misurabili di H. pylori
(15/22 animali), ma i numeri di H. pylori
associati a questi topi erano generalmente uno a due ordini di grandezza inferiori a quelli in topi che erano stati inoculati con il ceppo wild-type. Una analisi statistica dei dati utilizzando un test Wilcoxin Classifica verificato che le differenze nel numero di H. pylori
isolati da topi inoculati con i due ceppi sono stati significativi al livello di confidenza del 99%, indicando che l'acetone carboxylase migliorato la capacità di H. pylori
SS1 a colonizzare lo stomaco del mouse. Dal momento che non siamo riusciti a clonare il acxABC
dell'operone non abbiamo potuto verificare da complementazione che il acxB
mutazione era responsabile del difetto di colonizzazione. Tuttavia, è improbabile che il fenotipo colonizzazione acxB
mutante è dovuto agli effetti polari poiché non ci sono ulteriori geni nel acxABC
operone in una qualsiasi delle tre H. pylori
ceppi cui genomi sono stati sequenziato finora (Fig. 1). Inoltre, il difetto di colonizzazione non è probabilmente a causa di attenuazione o una mutazione secondaria dato che abbiamo costruito la acxB
mutante in un isolato fresco di ceppo SS1 recuperato da un mouse infetto. Figura 3 mouse saggio di colonizzazione di H. pylori SS1 e un isogenico acxB: ceppo mutante cat. I dati sono presentati come un diagramma a dispersione di colonia unità per grammo di stomaco formando come determinato dalla conta su piastra. Ogni punto rappresenta il conteggio cfu da un mouse, espressa come valore log10 (ufc /g stomaco) in Y. La linea di base [log10 (ufc /g stomaco) = 2,7] è il limite di rilevazione del test, che rappresenta il valore inferiore a 500 cfu /g stomaco.
Livelli Acetone nello stomaco del mouse
Poiché i dati dal saggi di colonizzazione del mouse suggerito che la capacità di utilizzare l'acetone da H. pylori
era importante per un efficace colonizzazione dell'ospite, abbiamo voluto determinare se H. pylori
incontrato notevoli livelli di acetone nello stomaco del mouse. Anche se i livelli di acetone sono stati riportati per vari fluidi corporei, non eravamo a conoscenza di eventuali segnalazioni di livelli di acetone associati con succo gastrico o tessuto. Pertanto, abbiamo misurato i livelli di acetone associato con il tessuto gastrico del mouse dopo aver rimosso rapidamente gli stomaci da topi e subito mettendo lo stomaco in fiale di siero sigillati. Dal momento che abbiamo voluto per stimare i livelli di acetone che H. pylori
potrebbero incontrare durante l'infezione persistente, gli animali utilizzati per questo studio sono stati mantenuti su un programma d'alimentazione normale e sono stati sacrificati al mattino prima di ricevere la loro normale riparto cibo quotidiano. Le fiale di siero sigillate contenenti le stomaci topi sono stati incubati su ghiaccio per consentire l'acetone, associato al tessuto gastrico per equilibrare con la fase gas nelle fiale, dopo di che campioni di fase gas sono stati analizzati mediante gascromatografia. Questa procedura è stata fatta inizialmente sacrificando gli animali e la rimozione di loro stomaci. Risultati simili, tuttavia, sono stati ottenuti rimuovendo le stomaci di animali vivi che erano stati anestetizzati. La quantità di acetone associato con il tessuto gastrico per ogni singolo topo vario, che vanno da 10 a 110 ~ μmols acetone per grammo di tessuto peso umido (Fig. 4), con la maggior parte dei valori (6/7) compreso nell'intervallo di 10 e 35 μmols acetone per grammo di tessuto di peso fresco. Questi dati suggeriscono che quantità millimolari di acetone sono associati con tessuto gastrico mouse e potrebbero essere disponibili come fonte di carbonio o energia potenziale di H. pylori
. Questo livello di acetone, associato al tessuto gastrico del mouse era superiore a quello che ci aspettavamo da livelli di corpi chetonici nel siero variano negli esseri umani e altri mammiferi in genere vanno da < 0,5 mm a pochi millimolare [23]. Acetone è prodotta nei mammiferi dalla decarbossilazione spontanea di acetoacetato e questo decarbossilazione è aumentata a pH basso, e così acetone possono accumularsi nello stomaco a causa di acidità gastrica. Figura 4 livelli Acetone associato con il tessuto gastrico mouse. i livelli di acetone stomaco sono stati determinati per tre topi dopo aver sacrificato gli animali e subito la rimozione di loro stomaci (post mortem), e per quattro topi che sono stati anestetizzati, dopo che i loro stomaci sono stati rimossi (pre-mortem). stomaci topo escissi sono stati collocati immediatamente in fiale sigillate che sono stati trasmessi su ghiaccio per almeno 30 minuti per consentire acetone associato al tessuto gastrico per equilibrare con la fase gas. livelli di acetone nella fase gas dei flaconi sono stati misurati mediante gascromatografia e stimati da curve standard generate per ogni flaconcino. Ogni valore rappresenta una media di almeno tre misurazioni e barre di errore indicano le deviazioni standard per ogni campione
. Discussione
Forniamo la prova che H. pylori
in possesso di una carbossilasi acetone funzionale come postulato in precedenza da Ensign e co -workers [15]. Il H. pylori acxABC
operone si trova vicino al
scoAB e fadB
geni che codificano gli enzimi SCOT e acetoacetil-CoA tiolasi. Così, questo cluster gene codifica una serie di enzimi capaci di metabolizzare acetone in acetil-CoA. Acetil-CoA prodotto da acetone e acetoacetato potrebbe alimentare il ciclo TCA per fornire energia per H. pylori
. Come osservato da Pflock e collaboratori del acxABC
operone e altri geni associati con il metabolismo di acetone sono presenti in H. acinonychis
[24]. Questi geni sono assenti, invece, negli altri strettamente correlati ε-Proteobacteria i cui genomi sono stati sequenziati fino ad ora, che comprende Helicobacter hepaticus
, Campylobacter jejuni
, Thiomicrospira denitrificans
, e Wolinella succinogenes
. L'acquisizione e la manutenzione del metabolismo acetone cluster di geni in H. pylori
e H. acinonychis
possono essere correlati al fatto che, a differenza di questi altri legati ε-Proteobacteria, colonizzano la mucosa dello stomaco. Il raggruppamento di questi geni e l'assenza di geni ortologhi in altri strettamente correlati ε-Proteobacteria potrebbe indicare possibile acquisizione di questi geni da H. pylori
e H. acinonychus
attraverso il trasferimento genico laterale. Il contenuto G + C di questo gruppo di geni metabolismo acetone a H. pylori
è leggermente superiore alla media dell'intero genoma, ma ciò sembra dovuto ai prodotti di questi geni essendo molto ricca di glicina (~ 10% confronta al 6% medio del genoma). Inoltre, caratteristiche di composizione di questi geni, come dinucleotide abbondanze relative e pregiudizi codone, non sono indicativi di recente trasferimento laterale di questa regione [25] (J. Mrázek, comunicazione personale).
Jungblut e collaboratori hanno riferito che H . pylori
AcxC (HP0698) cross-reagito con gli anticorpi da un paziente di adenocarcinoma, che indica che il H. pylori acxABC
operone si esprime nello Stato membro ospitante [26]. Inoltre, mostriamo qui che H. pylori
possono incontrare livelli significativi di acetone nello stomaco del mouse e quindi questo composto può servire come un importante donatore di elettroni respiratorio per il batterio nell'ospite. In accordo con questa ipotesi, l'H. pylori acxB
mutante era significativamente ridotta nella sua capacità di colonizzare stomaco topo che si deduce risultati dalla incapacità del mutante di utilizzare acetone come fonte di energia. L'incapacità di acetone per stimolare la crescita di H. pylori
SS1 in coltura liquida possono derivare dal fallimento dei media di crescita utilizzati per simulare condizioni di crescita incontrate dal batterio quando colonizzare la mucosa gastrica. Un'ipotesi alternativa a difetto colonizzazione del acxB
mutante è che l'acetone carbossilasi è necessaria per la disintossicazione di acetone. Tuttavia, la nostra incapacità di osservare alcuna inibizione della crescita del acxB
mutante con l'aggiunta di acetone nel terreno di coltura argomenta contro questa seconda ipotesi. Un'altra possibilità è che i prodotti della acxABC
operone catalizzano una reazione sconosciuta che è importante per la sopravvivenza o la crescita delle cellule di H. pylori
nella mucosa gastrica. Ulteriore caratterizzazione biochimica dei prodotti del H. pylori acxABC
operone dovrebbe aiutare a distinguere tra questi possibililties.
Una recente analisi del trascrittoma di H. pylori
26695 utilizzando un intero genoma microarray ha suggerito che l'HP1021 regolatore di risposta iperattivazione trascrizione di acxABC
e scoAB
, e trascrizione attivati ​​di fada
e hp0693 in misura minore, [24]. Gli autori di questo studio hanno dimostrato che HP1021 lega la regione regolatoria promotore di acxABC
, suggerendo che questo regolatore risposta media direttamente i suoi effetti sulla trascrizione di acxABC
e che i geni all'interno del cluster metabolismo acetone sono parte di una controllata regulon per HP1021. Pflock e colleghi hanno identificato 79 geni a H. pylori
26695 la cui espressione è stata alterata nel mutante HP1021 - 51 geni sono stati trascritti a livelli inferiori del mutante mentre il 28 geni sono stati espressi a livelli più alti [24]. HP1021 si differenzia dalla maggior parte degli altri regolatori di risposta in quanto manca il residuo di aspartato-fosfato accettare altamente conservata, e non è stata identificata una chinasi istidina affine per HP1021. Ci sono notizie contrastanti sulla trascrizione di HP1021 in risposta a pH acido, nonché sulla trascrizione di H. pylori acxABC
in risposta ad abbassare pH [27-29]. Queste differenze possono essere dovuto al modo in cui sono stati coltivati ​​i batteri. Anche se questi rapporti conflitto per quanto riguarda la trascrizione di HP1021 in risposta a pH acido, i risultati di entrambi gli studi indicano che le condizioni che portano alla down-regolazione del risultato HP1021 in una maggiore espressione di acxABC
. Questo sembra controintuitivo dato il ruolo apparente di HP1021 nell'attivare la trascrizione di acxABC
.
L'unico altro batterio per cui regolazione della acxABC
operone è stato esaminato è X. autotrophicus
. controllo trascrizionale di acxABC
in X. autotrophicus
è diversa da quella in H. pylori
. X. autotrophicus
manca un omologo di HP1021, ma regola la trascrizione di acxABC zona Via σ 54 (RpoN) e il σ 54 dipendenti attivatore AcxR [15]. Anche se H. pylori
possiede σ 54, il acxABC
operone non è parte del H. pylori
RpoN regulon [30].
Nonostante la nostra osservazione che interruzione di acxB
incide negativamente la colonizzazione di topi da H. pylori
SS1, recenti studi intero genoma microarray con cinquantasei ceppi globalmente rappresentative di H. pylori
e quattro H. acinonychis
ceppi hanno indicato che il acxABC
geni non sono presenti in tutti H. pylori
ceppi [31]. Sarebbe interessante per determinare se gli isolati privi acxABC Quali sono meno competitivi a colonizzare i loro ospiti naturali rispetto ai ceppi che possiedono questi geni. In alternativa, i ceppi manca acxABC
può avere adattamenti che compensano la mancanza di attività di acetone carbossilasi. I risultati degli studi di microarray di Gressmann e colleghi hanno indicato che scoAB
, fada
, HP0693 e HP0694 erano presenti in tutto il H. pylori
e H. acinonychis
ceppi esaminati [31]. Così, la pressione selettiva di mantenere la capacità di utilizzare acetoacetato come donatore di elettroni potenziale in H. pylori Comprare e H. acinonychis
sembra essere superiore a quello per il metabolismo acetone.
Conclusione
Il H . pylori acxABC
operone probabile codifica acetone carbossilasi che catalizza la conversione di acetone per acetoacetato ed è intimamente associata con i geni i cui prodotti sono previsti per catalizzare la conversione sequenziale di acetoacetato in acetil-CoA. Ispezione dei genomi di altri strettamente correlati ε-Proteobacteria suggerisce che i geni coinvolti nel metabolismo di acetone sono presenti solo nei batteri all'interno di questo subphylum che colonizzano la mucosa gastrica. Il acxABC
operone non era essenziale per la colonizzazione del mouse da H. pylori
SS1, ma sembra per migliorare la colonizzazione. Ulteriore caratterizzazione del putativo H. pylori
acetone carbossilasi ed i prodotti degli altri geni all'interno del cluster genico metabolismo acetone dovrebbe fornire informazioni su come corpi chetonici dall'host contribuiscono alle economie metabolici di H. pylori
e H . acinonychis
e come questi composti impatto la capacità di questi batteri di colonizzare i loro ospiti.
Metodi
ceppi batterici e media
edilizia plasmidi e la clonazione è stato fatto in E. coli ceppo
DH5α che è stato coltivato in terreno Luria-Bertani a 37 ° C. H. pylori
ceppo 26695 è stato utilizzato come modello per la reazione a catena della polimerasi (PCR). H. pylori
SS1 stato utilizzato come ceppo selvatico per tutti gli esperimenti e stato coltivato su entrambi agar sangue o agar di soia triptico supplementato con 5% di siero di cavallo (TSA-siero) a 37 ° C in atmosfera di 4% O 2, 5% di CO 2 e il 91% N 2. Quando coltivate in mezzo liquido, H. pylori
culture sono state coltivate in brodo Mueller-Hinton integrato con siero di cavallo al 5% e 30 ug /ml bacitracina o il mezzo di crescita definito descritto da Bruggrabber e collaboratori [22]. Cultures (10-15 ml coltivate media) sono state coltivate in 150 ml fiale di siero sigillati con dischi silicone 20 mm Teflon /e capsule in alluminio e in atmosfera di 4% O 2, 5% CO 2, 10 % H 2, 81% N 2. Salvo diversamente indicato, quando gli antibiotici sono stati inclusi nel mezzo sono stati aggiunti i seguenti concentrazioni: 100 ug /ml di ampicillina, 30 ug /ml cloramfenicolo, 200 mg /ml bacitracina 10 ug /ml vancomicina, e 10 ug /ml di amfotericina B.
inattivazione di acxB
(HP0696) in H. pylori
SS1
Un 2.3-kb frammento di DNA che ha portato acxB
è stato amplificato mediante PCR da H. pylori
ceppo 22695 e clonato in pGEM-T (Promega). Un gatto
cassetta è stato introdotto in questo plasmide in un Eco
47III sito che si trova circa a metà del acxB
clonato. Il plasmide risultante è stato utilizzato come vettore di suicidio per inattivare la copia cromosomica di acxB
in H. pylori
SS1. Il vettore di suicidio è stato introdotto in H. pylori
ceppi ATCC 43504 e SS1, un ceppo in grado di colonizzare i topi. A causa ripetuto passaggio di H. pylori
ceppo SS1 sul medio è stato segnalato a causare la perdita di infettività nei topi, la acxB
mutante è stato costruito in un isolato fresco di ceppo SS1 recuperato da un mouse infetto. Il numero di passaggi di acxB
mutante nel ceppo SS1 è stata limitata e registrato, e il mutante è stato conservato congelato a -80 ° C. Il ceppo SS1 parentale è stato mantenuto e conservato congelato in modo identico. Abbiamo confermato mediante PCR che la copia cromosomica di acxB
è stata interrotta da scambio allelica con la copia plasmide-carico del gene utilizzando un set di primer che fiancheggiavano il sito di interruzione.
Curve di crescita per H. pylori
ceppi
H. pylori
cellule da piastre TSA-siero in cui i ceppi erano stati striate il giorno precedente sono state sospese in PBS (PBS) e utilizzati per inoculare mezzo liquido ad un OD 600 di 0,03. Dove indicato, acetone è stato aggiunto al mezzo asettico. I campioni sono stati prelevati in momenti e densità di cellule diverse sono stati misurati dalla dispersione della luce a OD 600. In alternativa, conteggio delle cellule vitali sono stati determinati dopo diluizione seriale dei campioni e placcatura su TSA-siero. Dopo 4 a 5 giorni di incubazione, il numero di unità formanti colonie (ufc) sono stati determinati per le piastre.
Mouse colonizzazione
saggi colonizzazione topo furono effettuate essenzialmente come descritto in precedenza [32]. Queste procedure rispettate le linee guida federali competenti e le politiche istituzionali per la cura e la gestione degli animali da laboratorio. In breve, le cellule H. pylori
sono state raccolte dopo 48 ore di crescita su piastre di agar sangue e sospese in PBS per un OD 600 del 1.7. Headspace nel tubo è stato strippata con argon per ridurre al minimo l'esposizione all'ossigeno.

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