Der menschliche Magen-Erreger Helicobacter pylori hat ein Potential Aceton Carboxylase, die ihre Fähigkeit mice

Der menschliche Magen-Erreger Helicobacter pylori
hat ein Potential Aceton Carboxylase zu kolonisieren verbessert, die ihre Fähigkeit verbessert Mäuse
Abstrakt
Hintergrund
zu kolonisieren Helicobacter pylori
kolonisiert den menschlichen Magen und ist der Erreger der Magengeschwüre. Alle drei H. pylori
Stämme, die bisher ein Potential Operon, dessen Produkte Anteil Homologie mit den Untereinheiten von Aceton Carboxylase (codiert durch acxABC
) von Xanthobacter autotrophicus
Stamm Py2 und Rhodobacter capsulatus enthalten sequenziert wurden
Stamm B10. Aceton Carboxylase katalysiert die Umwandlung von Aceton zu Acetoacetat. Gene stromaufwärts des Operons codieren Enzyme
putative acxABC die Acetoacetat konvertieren Acetoacetyl-CoA, das weiter metabolisiert wird zwei Molekülen Acetyl-CoA zu erzeugen.
Ergebnisse
Wenn der H. pylori acxABC Um zu bestimmen
Operon hat eine Rolle in der Host-Kolonisation wurde die acxB
Homolog in der Maus-adaptierten H. pylori
SS1 Stamm mit einem Chloramphenicol-Resistenz (cat
) Kassette inaktiviert. In Maus Kolonisation Studien
die Zahlen von H. pylori von Mäusen mit dem acxB beimpft gewonnen: Katze
Mutante der Regel ein bis zwei Zehnerpotenzen niedriger als bei der Elternstamm geimpft von Mäusen gewonnen diejenigen waren. Eine statistische Analyse der Daten für ein Wilcoxin Rank-Test zeigten die Unterschiede in der Zahl der H. pylori von Mäusen, die mit den beiden Stämmen geimpft isoliert
am Konfidenzniveau von 99% signifikant waren. Levels von Aceton mit Magengewebe von nicht-infizierten Mäusen entfernt assoziiert wurden gemessen und gefunden 10-110 umol pro Gramm Nassgewicht Gewebe reichen
Fazit
Die Kolonisation Defekt des acxB: Kat.
Mutante, die eine Rolle schlägt für die acxABC
Operon in das Überleben des Bakteriums in den Magen. Produkte der H. pylori acxABC
Operon kann in erster Linie in Aceton Nutzungsfunktion oder eine verwandte Reaktion katalysieren, die für das Überleben oder das Wachstum in den Host wichtig ist. H. pylori
signifikante Mengen an Aceton in den Magen trifft, die sie als potentielle Elektronendonor für mikroaeroben Atmung verwenden könnte.
Hintergrund Helicobacter pylori
ist ein mikroaerophile, gramnegativen Bakterium, das a ist signifikante Pathogen des menschlichen Magenschleimhaut [1, 2]. Kolonisierung der Magenschleimhaut durch H. pylori
führt zu einer chronischen Entzündung, die zu einer Vielzahl von Krankheiten, einschließlich chronischer Gastritis, Magengeschwür, Magenkrebs und Schleimhaut-assoziiertes Lymphom fortschreiten kann [3-5]. In Abwesenheit von antimikrobiellen Therapie ist der Wirt wahrscheinlich eine Lebensdauer H. pylori
Infektion der Magenschleimhaut zu leiden.
Die Fähigkeit von H. pylori
im menschlichen Magen über einen längeren Zeitraum persistieren anzeigt, dass es ist gut, die Nährstoffe zu erwerben angepasst es für das Wachstum in dieser einzigartigen Nische braucht. Beispielsweise enthält die Schleimschicht der Magen der Maus signifikante Mengen an molekularem Wasserstoff (17-93 uM), die von der metabolischen Aktivität der mikrobiellen Flora im Dickdarm [6]. H. pylori ist in der Lage diese
molekularem Wasserstoff als Elektronendonor für mikroaeroben Atmung der Verwendung und einem funktionellen Hydrogenase ist für eine erfolgreiche Besiedelung von Mäusen erforderlich durch H. pylori
[6, 7]. Im Gegensatz zu vielen Wasserstoff oxidierende Bakterien jedoch H. pylori
ist nicht in der Lage autotrophen CO 2 -Fixierung.
Mehrere Studien untersuchten die Fähigkeit von H. pylori
an verschiedene Kohlenstoffquellen zu nutzen. H. pylori
eine begrenzte Fähigkeit hat, Zuckern zu erwerben und zu metabolisieren, eine Beobachtung, die mit der Analyse der genomischen Sequenzen von H. pylori-Stämme 22695 und
J99 konsistent ist [8]. Glucose ist das einzige Kohlenhydrat, das H. pylori
der Verwendung fähig ist, was es tut, über den Entner-Doudoroff-Weg [9, 10]. Aminosäuren dienen auch als Kohlenstoffquellen für H. pylori
und werden bevorzugt durch H. pylori
in Wachstumsmedien, die eine Mischung aus Glucose und Aminosäuren verwendet [9, 11]. Pyruvat, ein Schlüsselzwischenprodukt in zentralen Metabolismus scheint aus Lactat, Alanin und Serin in erster Linie erzeugt werden, und nicht Glucose in H. pylori
[12, 13]. Pyruvat umgewandelt wird zu Acetyl-CoA durch Pyruvat: Flavodoxin Oxidoreduktase in H. pylori
, die dann in die Tricarbonsäure (TCA) -Zyklus ernähren kann [14]. Zusätzlich Alanin, Lactat, Acetat, Formiat und Succinat kann durch H. pylori
Zellen aerob inkubiert hergestellt werden [12]. Die Herstellung von Acetat und Formiat als Stoffwechselprodukte weist auf die Existenz eines gemischten Säuregärung Stoffwechselweg in H. pylori
, obwohl Sauerstoff für das Wachstum des Bakteriums wesentlich ist [12].
Analyse der Genomsequenzen von H die Produkte, von denen 50-63% Aminosäureidentität mit dem β geteilt. pylori
26695 Zerrungen, J99 und HPAG1 ein potentielles Operons von drei Genen (als HP0695, HP0696 und HP0697 in H. pylori
26695) ergab , α und γ-Untereinheiten von Aceton Carboxylase aus Xanthobacter autotrophicus
Stamm Py2 und Rhodobacter capsulatus
Stamm B10 [15]. Homologe von Aceton Carboxylase sind in einer Reihe von Bakterien, aber die X. autotrophicus
und R. capsulatus
Enzyme sind die am besten charakterisierte gefunden. Aceton Carboxylase katalysiert die ATP-abhängige Carboxylierung von Aceton zu Acetoacetat und ist für das Wachstum von X. autotrophicus
und R. capsulatus
mit Aceton als einzige Kohlenstoffquelle und Elektronendonor erforderlich für die Atmung [15-17]. X. autotrophicus
Aceton Carboxylase hat eine hohe Affinität zu Aceton (Km = 8 &mgr; M), aber die Umsatzrate des Enzyms ist sehr langsam (~ 45 pro min) [15]. Um die niedrige Fluktuationsrate von Aceton Carboxylase kompensieren, X. autotrophicus
produziert große Mengen des Enzyms (17-25% des gesamten löslichen Proteins), wenn sie auf Aceton gewachsen [15]
Gene befindet sich in der Nähe der H. pylori
HP0695-HP0696-HP0697-Operon Enzyme kodieren gezeigt Acetoacetat umwandeln zu Acetoacetyl-CoA, das weiter metabolisiert wird zu Acetyl-CoA [8, 18]. Aceton, Acetessigsäure und 3-β-Hydroxybutyrat sind Ketonkörper durch Säuger perivenösen Hepatozyten während Fettsäure Abbau hergestellt und werden als Elektronendonatoren für die Atmung verwendet, wenn Kohlenhydrate nicht leicht verfügbar sind [19]. So wie Ketonkörper wichtige Energiequellen für den Menschen sind, wenn Kohlenhydrate nicht verfügbar sind, können diese Verbindungen dienen als Atmungselektronenspender für H. pylori-Kolonisierung
der Magenschleimhaut. Um festzustellen, ob der HP0695-HP0696-HP0697-Operon eine Rolle bei der Host-Kolonisation hat wir HP0696 in H. pylori
Stamm SS1 inaktiviert. Die HP0696-Mutante wurde in seiner Fähigkeit beeinträchtigt Mäuse zu kolonisieren darauf hindeutet, dass Aceton Carboxylierung oder eine ähnliche enzymatische Aktivität katalysiert durch Produkte der HP0695-HP0696-HP0697-Operon ist ein bedeutender Faktor Kolonisation zu bewirten.
Ergebnisse | H. pylori
enthält eine Reihe von Genen vorhergesagt
Die drei H. pylori-Stämme
deren Genome eine Gruppe von acht konservierte Gene enthalten, in Aceton Stoffwechsel beteiligt werden innerhalb eines ~ 10 kb DNA-Sequenz, von denen sechs sequenziert worden Enzyme kodieren vorhergesagt Aceton zu metabolisieren und Acetoacetat zu Acetyl-CoA (Fig. 1 und 2). Helicobacter acinonychis
, eine eng verwandte Arten, die große Katzen infiziert, besitzt auch dieses Gen-Cluster. Wie oben erwähnt, teilen sich drei dieser Gene Homologie mit acxABC
, obwohl die ersten beiden Gene in dem Operon Gene wie angegeben kodieren hydantoin Nutzungs Protein A und Methylhydantoinase jeweils in den kommentierten H. pylori
Genomen. Hydantoinasen katalysieren die Hydrolyse von 5-Ringe durch Hydrolyse eines internen Imidbindungen und haben oft ziemlich breite Substratspezifität. Von Proteinen in der Datenbank, deren biochemische Funktionen nachgewiesen wurden, ergab, BLAST-Analyse, dass die vorhergesagten Produkte der H. pylori
Gene am ehesten denen des sp
Xanthobacter entsprechen. Py2 acxABC
Operon (59-68% Aminosäureidentität über die gesamte Länge der drei vorhergesagten Untereinheiten). Für die zuletzt H. pylori
und H. sequenziert acinonychis
das letzte Gen des Operons Genome als acxC
kommentierte [20, 21]. Somit kodiert das H. pylori
HP0695-HP0696-HP0697-Operon wahrscheinlich Aceton Carboxylase statt Hydantoinase, und wir daher in diesem Operon als acxABC
verweisen. Abbildung 1 Organisation der beteiligten Gene in Aceton Metabolismus bei H. pylori und H. acinonychus Stämme. Gene Bezeichnungen sind unter jeder Pfeil (nicht maßstäblich gezeichnet) angezeigt. Offene Leserahmen, die in den kommentierten Genomsequenzen ein Gen designation nicht angegeben wurden, werden entweder mit einem HP-Bezeichnung angegeben (für H. pylori
26695), eine JHP Bezeichnung (für H. pylori
J99), oder nur das offene Leserahmennummer (für H. pylori
HPAG1 und A. acinonychis
Stamm Sheeba). Orthologen Gene in den vier Stämme haben die gleiche Farbe. Die Gene jhp0628 in H. pylori
J99 und 0671 in H. pylori
HPAG1 entsprechen einer Fusion von hp0688 und hp0689 von H. pylori
26695. H. pylori
J99 und HPAG1 haben zwei Gene innerhalb dieses Bereichs, jhp0629 (HPAG1_0672) und jhp0630 (HPAG1_0672), die einen Typ II DNA methyltransferase und einen Typ II-Restriktionsenzym sind, und werden nicht gefunden in H. pylori
26695. Funktionen der Produkte der Gene kodieren innerhalb des Aceton Stoffwechsel Cluster sind im Text beschrieben. Die vorgeschlagenen Funktionen der Produkte der umgebenden Gene sind: FECA
, Eisen (III) Dicitrat Transportprotein; feoB
, Eisen (II) Transportprotein; dgkA
, Diacylglycerin-Kinase; gyrA
, die Untereinheit A von DNA-Gyrase; dcuA
, anaerob C4-Dicarboxylat-Transporter; und ansB
Asparaginase II.
Abbildung 2 Vorgeschlagen Weg für Aceton Nutzung in H. pylori. Der vorgeschlagene Weg für die Umwandlung von Aceton zu Acetyl-CoA in H. pylori und H.
acinonychis
gezeigt ist. Die Reaktionen und Gene, die für die Enzyme, die für jede Reaktion katalysieren angegeben
Zwei andere Gene im Gencluster, SCOA
(HP0691) und Scob
(HP0692), kodieren Succinyl CoA:. Acetoacetat-CoA-Transferase ( SCOT), die die Umwandlung von Acetoacetat und Succinyl-CoA katalysiert, um Acetoacetyl-CoA sowie Succinat [18]. Acetoacetyl-CoA von SCOT produziert wird verstoffwechselt weiter durch Acetoacetyl-CoA-Thiolase, die von
Fada kodiert wird (HP0690; Gen kommentierte als thl
in H. pylori
J99 und atoB
in H. pylori
HPAG1 und H. acinonychis
) zu erzeugen, zwei Molekülen Acetyl-CoA aus Acetoacetyl-CoA und Coenzym A (CoA) [8]. Die zwei verbleibenden Gene innerhalb dieses Clusters, HP0693 und HP0694, wird vorhergesagt, eine kurzkettige Fettsäure-Permease und ein äußeres Membranprotein zu kodieren sind, und in den Transport von Acetoacetat funktionieren., Die acht Gene innerhalb dieses putative Aceton Stoffwechsel cluster die gleiche relativ zueinander in den drei H. pylori-Stämme
angeordnet sind, aber der Cluster in einem der beiden potentiellen Richtungen ausgerichtet (Fig. 1), die das Auftreten eines DNA-Inversion in dieser Region während der Evolution H. pylori
. Alignments von DNA-Sequenzen aus den drei Stämmen verengte die Stelle der Inversion zu ~ 40 bp stromabwärts des acxC
homolog und ~ 160 bp stromaufwärts des Startcodons für FADA
(Daten nicht gezeigt). Keine großen direkten oder invertierten Wiederholungen sind in der Nähe dieser Regionen, die in Inversion beteiligt gewesen sein soll, und so können wir nicht über den Mechanismus für diese Inversion spekulieren. Für H. pylori-Stämme
J99 und HPAG1, aber nicht 26695 gibt es einen Typ II DNA methyltransferase vorhergesagt (jhp0629 und HPAG1_0673) und eine Typ II-Restriktionsenzym (jhp0630 und HPAG1_0672) neben dem putative Gencluster Aceton Stoffwechsel.
H. acinonychis
die mutmaßliche Cluster Aceton Stoffwechsel-Gen besitzt und die Gene im Cluster sind in der gleichen Ausrichtung wie bei H. pylori
J99. In H. acinonychis
diese Gene zu dgkA Karten und gyrA
benachbart sind, wie sie in H. pylori
sind, aber am entgegengesetzten Ende durch dcuA
und ansB
flankiert. Die FECA
und feoB
Gene, die in der Nähe des Aceton Stoffwechsel-Gencluster in der H. pylori-Stämme
befinden, sind ~ 69 kb von diesem Gencluster in H. acinonychis
. Somit blieb die relative Anordnung der Gene innerhalb des Aceton Metabolismus cluster bemerkenswert während der Evolution von H. pylori und H.
konservierten acinonychis
trotz der Tatsache, dass der benachbarte Bereich in den Genomen dieser beiden Spezies unterzogen wurde . umfangreiche Umlagerungen
die H. pylori acxB: Katze
Mutante ist in seiner Fähigkeit, defiziente Mäuse zu kolonisieren
die acxB
Gen in H. pylori
SS1, die eine Maus-angepasst ist Stamm , wurde mit einer Resistenz gegen Chloramphenicol (cat
) Kassette aufgebrochen. Kulturen von Wildtyp H. pylori
SS1 und die acxB: Katze
Mutante wurden in Mueller-Hinton-Bouillon mit Pferdeserum oder einem zuvor beschriebenen definierten Medium [22] ergänzt war. Variierende Mengen von Aceton im Bereich von 1,3 mM bis 26 mM wurden in den Wachstumsmedien enthalten, um zu bestimmen, ob Aceton Wachstum beeinträchtigt entweder Stamm. Das Zellwachstum wurde durch Lebendzellanzahl sowie optische Dichten von Kulturen zu verschiedenen Zeitpunkten überwacht. Einschließlich Aceton in entweder Nährmedien hatte keine Wirkung auf die Wachstumsrate oder endgültige Zellausbeute von H. pylori
SS1 oder acxB: cat
Mutante (Daten nicht gezeigt). Das Scheitern von Aceton zu stimulieren das Wachstum von H. pylori
SS1 unter den getesteten Bedingungen ist nicht unerwartet, da das Wachstumsmedium für H. pylori
sehr nährstoffreich ist. Diese Ergebnisse legen nahe, dass acxABC
nicht für Aceton Entgiftung benötigt wird
Die Fähigkeit des acxB: Kat.
Mutierten Mäuse zu kolonisieren wurde im Vergleich mit dem des elterlichen H. pylori
SS1 Stamm in zwei getrennte Studien. In jedem Versuch wurden elf Mäuse, die mit dem Wildtyp-Stamm beimpft und elf wurden mit dem acxB geimpft: Katze
Mutante. Drei Wochen nach der Inokulation der Mäuse mit der H. pylori-Stämme
wurden die Mäuse getötet und die Anzahl von H. pylori
in den Mägen der Tiere bestimmt. Für die Mäuse, die mit dem Wildtyp-Stamm geimpft worden waren, die meisten Tiere (19/22 Tiere) hatte H. pylori
zählt, die deutlich über der Nachweisgrenze, die 500 KBE pro Gramm Magen (Abb war. 3). Die Anzahl der H. pylori
in Proben, die von 10 lag oberhalb der Nachweisgrenze 4 - 10 6 cfu pro Gramm Magen. Die meisten der mit dem acxB beimpft Mäuse: Katze
Mutante auch messbare Niveaus von H. pylori
(15/22 Tiere), aber die Zahl der H. pylori hatte
mit diesen Mäusen assoziiert waren in der Regel ein bis zwei Größenordnungen niedriger als bei Mäusen, die mit dem Wildtyp-Stamm geimpft worden waren. Eine statistische Analyse der Daten überprüft einen Wilcoxin Rank-Test, dass die Unterschiede in der Anzahl der H. pylori von Mäusen inokuliert isoliert
Konfidenzniveau von 99% beim signifikanten mit den beiden Stämmen waren, was darauf hinweist, dass Aceton Carboxylase die Fähigkeit der verbesserten H. pylori
SS1 der Maus Magen zu besiedeln. Da wir nicht in der Lage waren die acxABC
Operon zu klonen konnten wir nicht durch Komplementierung überprüfen, ob die acxB
Mutation für den Mangel bei der Kolonisation verantwortlich war. Es ist jedoch unwahrscheinlich, dass die Kolonisierung Phänotyp der mutanten acxB
zurückzuführen auf polaren Effekte, da keine zusätzliche Gene in das Operon
acxABC sind in jedem der drei H. pylori-Stämme
deren Genome haben sequenziert bisher (Abb. 1). Darüber hinaus ist die Kolonisierung Defekt nicht wahrscheinlich aufgrund Dämpfung oder einer sekundären Mutation, da wir die acxB
Mutante in einem frischen Isolat Stamm SS1 von einer infizierten Maus gewonnen konstruiert. Abbildung 3 Maus Kolonisation Test von H. pylori SS1 und eine isogene acxB: Katze mutierten Stamm. Die Daten werden als Streudiagramm der Kolonie präsentiert Einheiten pro Gramm Magen gebildet wird, wie durch Plattenzählungen ermittelt. Jeder Ort, um die KBE Zählung von einer Maus darstellt, ausgedrückt als der Wert von log10 (KBE /g Magen) in der Y-Achse. Die Basislinie [log10 (cfu /g Magen) = 2,7] ist die Nachweisgrenze des Assays, die die Zählung von weniger als 500 cfu /g Magen darstellt. Acetonspiegel im Mäusemagen
Da die Daten aus dem Maus Kolonisation Tests vorgeschlagen, dass die Fähigkeit Aceton von H. pylori zu nutzen
für eine effektive Wirts Besiedlung wichtig war, wollten wir
begegnet erheblichen Acetonspiegel in der Maus Magen, wenn H. pylori zu bestimmen. Obwohl Aceton Niveaus für verschiedene Körperflüssigkeiten berichtet wurde, waren wir von allen Berichten von Acetonspiegel im Zusammenhang mit Magensaft oder Gewebe nicht bewusst. Daher messen wir Aceton Ebenen mit der Maus nach Magen-Gewebe verbunden schnell die Mägen von Mäusen zu entfernen und sofort die Mägen in versiegelten Serumfläschchen platzieren. Da wir Acetonspiegel abschätzen wollten, dass H. pylori
während einer Infektion auftreten können, die für diese Studie verwendeten Tiere wurden auf einer regelmäßigen Fütterung Zeitplan eingehalten und wurden am Morgen geopfert vor ihrer normalen täglichen Nahrung Zuteilung zu erhalten. Die versiegelten Serumampullen die Mäuse Mägen enthielten, wurden auf Eis inkubiert, um das Aceton mit dem Magengewebe assoziiert zu ermöglichen, mit der Gasphase in den Phiolen zu äquilibrieren, wonach Proben Gasphase wurde durch Gaschromatographie analysiert. Dieses Verfahren wurde zunächst getan, indem sie die Tiere zu opfern und das Entfernen ihre Mägen. Ähnliche Ergebnisse wurden durch Entfernen der Mägen von lebenden Tieren jedoch erhalten, das betäubt worden waren. Die Menge an Aceton, die mit Magen-Gewebe für jede einzelne Maus vielfältig und reicht von ~ 10 bis 110 &mgr; Mol Aceton pro Gramm Nassgewicht Gewebe (Fig. 4), wobei die meisten Werte (6/7) im Bereich von 10 und 35 &mgr; mol fallenden Aceton pro Gramm Nassgewicht Gewebe. Diese Daten legen nahe, daß millimolare Mengen Aceton assoziiert sind mit Magengewebe Maus und könnte als eine potentielle Kohlenstoff- oder Energiequelle für H. pylori
verfügbar sein. Dieses Niveau von Aceton mit der Maus Magengewebe assoziiert war höher als das, was man erwartet, da Serumspiegel von Ketonkörpern variieren in Menschen und anderen Säugetieren im allgemeinen von < 0,5 mM bis einigen millimolar [23]. Aceton wird durch die spontane Decarboxylierung von Acetoacetat in Säugern erzeugt und diese Decarboxylierung wird bei niedrigem pH erhöht und so Aceton im Magen ansammeln kann aufgrund der Magensäure. Abbildung 4 Acetonspiegel im Zusammenhang mit Magen-Gewebe Maus. Magen-Aceton-Spiegel wurden für drei Mäuse bestimmt, nachdem die Tiere zu opfern und sofort zu entfernen ihre Mägen (post-mortem) und vier Mäuse, die betäubt wurden, nach dem ihre Mägen wurden entfernt (pre-mortem). Exzidiert Maus Mägen wurden sofort in versiegelten Ampullen gegeben, die dann für mindestens 30 min auf Eis gestellt wurden Aceton mit dem Magengewebe assoziiert zu ermöglichen, mit der Gasphase zu äquilibrieren. Aceton Ebenen in den Gasphasen der Phiolen wurden durch Gaschromatographie gemessen und geschätzt aus Standardkurven für jedes Fläschchen erzeugt. Jeder Wert stellt einen Durchschnitt von mindestens drei Messungen und Fehlerbalken zeigen die Standardabweichungen für jede Probe.
Discussion
wir nachweisen, dass H. pylori
besitzen eine funktionelle Aceton Carboxylase, wie zuvor von Ensign postuliert und co Workers [15]. Die H. pylori acxABC
Operon ist in der Nähe des scoAB
und fadB
Gene, die die Enzyme SCOT und Acetoacetyl-CoA-Thiolase kodieren. Somit codiert das Gen-Cluster eine Reihe von Enzymen fähig Aceton zur Metabolisierung zu Acetyl-CoA. Acetyl-CoA, hergestellt aus Aceton und Acetessigsäure in den TCA-Zyklus ernähren könnte Energie für H. pylori
zur Verfügung zu stellen. Wie durch Pflock und Mitarbeiter beobachteten assoziiert die acxABC
Operon und andere Gene, die mit Aceton Stoffwechsel in H. vorhanden sind acinonychis
[24]. Diese Gene fehlen, jedoch in der anderen nahe verwandten ε-Proteobacteria deren Genome wurden bisher sequenziert, die Helicobacter hepaticus
umfasst, Campylobacter jejuni
, Thiomicrospira denitrificans
und Wolinella succinogenes
. Der Erwerb und die Aufrechterhaltung des Gencluster Aceton Metabolismus bei H. pylori
und H. acinonychis
der Tatsache zusammenhängen, dass, im Gegensatz zu diesen anderen verwandten ε-Proteo sie die Magenschleimhaut besiedeln. Das Clustering dieser Gene und das Fehlen von orthologen Genen in anderen eng verwandten ε-Proteo könnte darauf hindeuten, möglichen Erwerb dieser Gene von H. pylori
und H. acinonychus
durch seitliche Gentransfer. Der G + C-Gehalt dieses Clusters Aceton Metabolismus Gene in
H. pylori ist etwas höher als der Durchschnitt für das gesamte Genom, aber dies scheint auf die Produkte dieser Gene sehr reich an Glycin ist (~ 10% zu vergleichen, bis 6% Genom Durchschnitt). Außerdem kompositorischen Merkmale dieser Gene, wie Dinucleotid relativen Häufigkeiten und Codonbevorzugung, sind kein Hinweis auf den letzten seitlichen Übertragung dieser Region [25] (J. Mrázek, persönliche Mitteilung).
Jungblut und Mitarbeiter berichteten, dass H . pylori
mit Antikörpern von einem Adenokarzinom Patienten AcxC (HP0698) kreuzreagierten, dass [26] in dem Wirt exprimiert wird, um die H. pylori acxABC
Operon anzeigt. Darüber hinaus zeigen wir hier, dass H. pylori-
signifikante Mengen an Aceton in der Maus Magen begegnen können und so kann diese Verbindung für das Bakterium in dem Host als eine wichtige Atem Elektronendonor dienen. In Übereinstimmung mit dieser Hypothese wurde die H. pylori acxB
Mutante in seiner Fähigkeit, deutlich reduziert die Maus Magen zu besiedeln, die wir ergibt sich aus der Unfähigkeit des mutierten schließen Aceton als Energiequelle zu nutzen. Die Unfähigkeit von Aceton zu stimulieren das Wachstum von H. pylori
SS1 in Flüssigkultur aus dem Versagen der Wachstumsmedien führen kann verwendet Wachstumsbedingungen durch das Bakterium angetroffen nachahmen, wenn die Magenschleimhaut kolonisieren. Eine alternative Hypothese für die Besiedlung Defekt der acxB
Mutante ist, dass Aceton Carboxylase zur Entgiftung von Aceton benötigt wird. Doch unser Versagen jede Hemmung des Wachstums der acxB
Mutante durch die Zugabe von Aceton in dem Kulturmedium spricht gegen diese Hypothese zu beobachten. Eine andere Möglichkeit besteht darin, dass die Produkte der acxABC
Operon eine unbekannte Reaktion katalysieren, die für das Überleben oder das Zellwachstum von H. pylori
in der Magenschleimhaut wichtig ist. Weitere biochemische Charakterisierung der Produkte von der H. pylori acxABC
Operon sollten zwischen diesen possibililties zu unterscheiden helfen.
Ein kürzlich Transkriptom-Analyse von H. pylori
26695 mit einem Gesamtgenom-Microarray vorgeschlagen, dass die Antwortregulator HP1021 stark aktivierte Transkription von acxABC
und scoAB
und aktiviert die Transkription von Fada
und hp0693 in geringerem Umfang [24]. Die Autoren dieser Studie zeigten, dass HP1021 die Promotorregulationsregion acxABC
bindet darauf hindeutet, dass diese Antwort Regler seine Wirkungen auf die Transkription von acxABC Karten und dass die Gene innerhalb des Aceton Metabolismus Cluster direkt Teil eines Regulons vermittelt gesteuerten von HP1021. Pflock und Kollegen identifizierten 79 Gene in H. pylori 26695
deren Expression wurde in der HP1021-Mutante verändert - 51 Gene auf den unteren Ebenen in der Mutante transkribiert wurden, während 28 Gene in höheren Konzentrationen [24] zum Ausdruck gebracht wurden. HP1021 unterscheidet sich von den meisten anderen Antwortaufsichtsbehörden, dass es die hochkonservierten Phosphat-akzeptierende Aspartatrest fehlt und ein verwandtes Histidinkinase für HP1021 nicht identifiziert wurde. Es gibt widersprüchliche Berichte über die Transkription von HP1021 in Reaktion auf einen sauren pH-Wert, sowie die Transkription von H. pylori acxABC
in Reaktion pH zu senken [27-29]. Diese Unterschiede können auf die Art und Weise zurückzuführen sein, in dem die Bakterien kultiviert wurden. Obwohl diese Berichte Konflikt in Bezug auf die Transkription von HP1021 in Reaktion auf einen sauren pH-Wert ergibt sich aus beiden Studien zeigen an, dass Bedingungen, die von acxABC
in erhöhten Expression Herunterregulierung der HP1021 Ergebnis führen. Dies scheint nicht eingängig die scheinbare Rolle der HP1021 gegeben bei der Aktivierung der Transkription von acxABC
. Die einzige andere Bakterium
für die Regulierung der acxABC
Operon geprüft wurde X. autotrophicus
ist. Transkriptions-Kontrolle von acxABC
in X. autotrophicus
unterscheidet sich von dem in H. pylori
. X. autotrophicus
fehlt ein Homolog von HP1021, sondern reguliert die Transkription von acxABC
über σ 54 (RpoN) und die σ 54-abhängige Aktivator AcxR [15]. Obwohl H. pylori
σ 54 besitzt, ist die acxABC
Operon nicht Teil der H. pylori
RpoN Regulon [30].
Trotz unserer Beobachtung, dass Störungen der acxB
beeinträchtigt Kolonisierung von Mäusen durch H. pylori
SS1, kürzlich gesamte Genom Microarray-Studien mit sechsundfünfzig global repräsentative Stämme von H. pylori
und vier H. acinonychis
Stämme zeigten, dass die acxABC
Gene in allen H. pylori nicht
Stämme [31]. Es wäre interessant, wenn die Isolate fehlt acxABC zu bestimmen
weniger wettbewerbsfähig sind in ihren natürlichen Wirten als Stämme besiedeln, die diese Gene besitzen. Alternativ Stämme fehlt acxABC
Anpassungen können, die für den Mangel an Aceton-Carboxylase-Aktivität kompensieren. Die Ergebnisse der Microarray-Studien von Gressmann und Kollegen zeigten, dass scoAB
, Fada
, HP0693 und HP0694 in allen H. pylori anwesend waren
und H. acinonychis
Stämme untersucht [31]. Somit
der selektive Druck der Aufrechterhaltung der Fähigkeit Acetoacetat als potenzielle Elektronendonor in H. pylori
und H. acinonychis
größer zu sein scheint als die für Aceton Stoffwechsel.
Schlussfolgerung zu nutzen, um die H . pylori acxABC
Operon kodiert wahrscheinlich Aceton-Carboxylase, die die Umwandlung von Aceton katalysiert zu Acetoacetat und innig mit Genen, deren Produkte vorhergesagt katalysieren die sequentielle Umwandlung von Acetoacetat zu Acetyl-CoA zugeordnet ist. Inspektion der Genome von anderen eng verwandten ε-Proteo legt nahe, dass in Aceton Stoffwechsel beteiligten Gene in Bakterien innerhalb dieser subphylum nur vorhanden sind, die die Magenschleimhaut besiedeln. Die acxABC
Operon war nicht wesentlich für Maus Kolonisierung von H. pylori
SS1, aber es schien Kolonisation zu verbessern. Eine weitere Charakterisierung des vermeintlichen H. pylori
Aceton Carboxylase und die Produkte der anderen Gene innerhalb des Aceton Stoffwechsel-Gencluster sollte Einblick in die Ketonkörper vom Host tragen zu den metabolischen Volkswirtschaften von H. pylori bieten
und H die Fähigkeit dieser Bakterien. acinonychis
und wie diese Verbindungen Auswirkungen ihrer Wirte zu kolonisieren.
Methoden
Bakterienstämme und Medien
Plasmidkonstruktion und Klonierung wurde in E. coli-Stamm DH5a
durchgeführt, die wurde bei 37 ° C in Luria-Bertani-Medium, kultiviert. H. pylori
Stamm 26695 wurde als Matrize für die Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet. H. pylori
SS1 wurde als Wildtyp-Stamm für alle Experimente verwendet und wurde kultiviert, entweder auf Blut-Agar oder tryptische Soja-Agar ergänzt mit 5% Pferdeserum (TSA-Serum) bei 37 ° C unter einer Atmosphäre von 4% O 2, 5% CO 2 und 91% N 2. Bei Kultivierung in einem flüssigen Medium, H. pylori
Kulturen wurden in Mueller-Hinton-Brühe mit 5% Pferdeserum und 30 ug /ml Bacitracin oder dem Medium definierten Wachstums beschrieben von Bruggrabber und Mitarbeiter [22]. Kulturen (10-15 ml Medium gezüchtet) wurden in 150-ml-Serumfläschchen versiegelt mit 20 mm Teflon /Silikon Scheiben und Aluminiumkappen und unter einer Atmosphäre von 4% O 2, 5% CO 2, 10 gewachsen % H 2, 81% N 2. Soweit nicht anders angegeben, als Antibiotika in dem Medium enthalten waren wurden sie in den folgenden Konzentrationen zugegeben: 100 &mgr; g /ml Ampicillin, 30 ug /ml Chloramphenicol, 200 ug /ml Bacitracin 10 ug /ml Vancomycin, und 10 &mgr; g /ml Amphotericin B.
Inaktivierung von acxB
(HP0696) in H. pylori
SS1
Ein 2,3-kb-DNA-Fragment, das acxB und Videos PCR von H. pylori
22695 Stamm verstärkt durchgeführt wurde und kloniert in pGEM-T (Promega). Eine Katze
Kassette wurde bei einer 47III Seite
Eco in dieses Plasmid eingeführt etwa in der Mitte des geklonten acxB
entfernt. Das resultierende Plasmid wurde zur Inaktivierung der chromosomalen Kopie acxB
in H. pylori
SS1 als Suizid-Vektor verwendet. Der Suizidvektor wurde eingeführt in H. pylori
Stämme ATCC 43504 und SS1, eine Sorte, die Mäuse zu kolonisieren können. Da wiederholte Passage von H. pylori
Stamm SS1 auf Medium berichtet wurde, zu einem Verlust der Infektiosität bei Mäusen Ergebnis wurde die acxB
Mutante in einem frischen Isolat Stamm konstruiert SS1 von einer infizierten Maus gewonnen. Die Anzahl der Durchgänge der acxB
mutant in der SS1-Stamm wurde begrenzt und aufgezeichnet, und die Mutante bei -80 ° C eingefroren gelagert. Die elterliche SS1 Stamm wurde gehalten und eingefroren in gleicher Weise gespeichert. Wir bestätigten durch PCR, dass die chromosomale Kopie von acxB und Videos allelischen Austausch mit dem plasmidgetragenen Kopie des Gens unter Verwendung eines Satzes von Primern, die den Ort der Störung.
Wachstumskurven für H. pylori flankiert wurde unterbrochen
Stämme
H. pylori
Zellen aus TSA-Serumplatten, auf denen die Stämme am Vortag ausgestrichen worden war, in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und verwendet zum beimpfen flüssigen Medium bei einer OD 600 von 0,03. Wo angegeben, wurde aseptisch zu dem Medium Aceton zugegeben. Proben wurden zu verschiedenen Zeitpunkten und Zelldichten genommen wurden durch Lichtstreuung an OD 600 gemessen. Alternativ wurden Lebendzellzählungen folgende Verdünnungsreihe der Proben bestimmt und Plattierung auf TSA-Serum. Im Anschluss an 4 bis 5 Tagen Inkubation wurde die Anzahl der koloniebildenden Einheiten (cfu) wurden auf den Platten bestimmt.
Maus Kolonisierung
Maus Kolonisierung Assays wurden im wesentlichen durchgeführt, wie früher beschrieben [32]. Diese Verfahren erfüllt die einschlägigen Richtlinien des Bundes und institutionellen Richtlinien für die Pflege und den Umgang mit Labortieren. Kurz gesagt wurden die H. pylori
Zellen nach 48 h Wachstum auf Blutagarplatten und suspendiert in PBS bis zu einer OD 600 von 1,7 geerntet. Kopfraum in dem Rohr wurde mit Argon durchperlt Sauerstoffeinwirkung zu minimieren.

• ein mechanistisches exploration.
• Dosisabhängige Hemmung der Magen-Schädigung durch Wasserstoff in alkalischen elektrolysierten Trinkwasser