Den humane gastriske patogen Helicobacter pylori har en potentiel acetone carboxylase, der forbedrer dens evne til at kolonisere mus

Den menneskelige gastrisk patogen Helicobacter pylori
har et potentiale acetone carboxylase, der forbedrer dens evne til at kolonisere mus
Abstrakt
Baggrund
Helicobacter pylori
koloniserer menneskets mave og er den ætiologiske agent for mavesår sygdom . Alle tre H. pylori
stammer, som er blevet sekventeret til dato indeholde en potentiel operon hvis produkter deler homologi med underenhederne acetone carboxylase (kodet af acxABC
) fra Xanthobacter autotrophicus
stamme PY2 og Rhodobacter capsulatus
stamme B10. Acetone carboxylase katalyserer omdannelsen af ​​acetone til acetacetat. Genes opstrøms for det formodede acxABC
operon koder for enzymer, der konverterer acetoacetat at acetoacetyl-CoA, som metaboliseres yderligere til at generere to molekyler acetyl-CoA. Search Results
at bestemme om H. pylori acxABC
operon har en rolle i vært kolonisering den acxB
homolog i mus tilpassede H. pylori
SS1 stamme blev inaktiveret med en chloramphenicol-resistens (cat
) kassette. I mus kolonisering studier antallet af H. pylori
genvundet fra mus podet med acxB: cat
mutant var generelt en til to størrelsesordener lavere end genvundet fra mus podet med den parentale stamme. En statistisk analyse af data ved hjælp af en Wilcoxin Rank test angivet forskellene i antallet af H. pylori
isoleret fra mus podet med de to stammer var signifikante ved et konfidensniveau på 99%. Niveauer af acetone forbundet med gastrisk væv fjernet fra inficerede mus blev målt og fundet at variere fra 10-110 pmol per gram vådvægt væv
Konklusion
kolonisering defekt af acxB:. Kat
mutant foreslår en rolle for acxABC
operonen i overlevelse af bakterien i maven. Produkter af H. pylori acxABC
operon kan fungere primært i acetone udnyttelsen eller katalysere en relateret reaktion, der er vigtig for overlevelse eller vækst i værten. H. pylori
møder signifikante niveauer af acetone i maven, som det kunne bruge som en potentiel elektron donor for mikroaerob respiration.
Baggrund
Helicobacter pylori
er en mikroaerofil, gram-negative bakterie, der er en signifikant patogen af ​​den humane gastriske mucosa [1, 2]. Kolonisering af maveslimhinden med H. pylori
fører til kronisk inflammation, der kan udvikle sig til en række sygdomme, herunder kronisk gastritis, mavesår, gastrisk cancer og mucosal-associeret lymfom [3-5]. I fravær af antimikrobiel terapi, værten er tilbøjelige til at lide en levetid H. pylori
infektion af maveslimhinden.
Evne H. pylori
at vare i den menneskelige mave i længere perioder indikerer, at det er godt tilpasset til at erhverve de næringsstoffer, den har brug for vækst i denne unikke niche. For eksempel slimlag af muse maven indeholder betydelige mængder af molekylært hydrogen (17-93 uM) med oprindelse fra metaboliske aktivitet af mikrobielle flora i tyktarmen [6]. H. pylori
er i stand til at udnytte denne molekylære hydrogen som en elektrondonor til mikroaerob respiration og en funktionel hydrogenase er nødvendig for en vellykket kolonisering af mus af H. pylori
[6, 7]. I modsætning til mange brint-oxiderende bakterier, men H. pylori
ikke kan autotrof CO 2 fiksering.
Flere undersøgelser har undersøgt muligheden for H. pylori
at udnytte forskellige kulstof-kilder. H. pylori
har en begrænset evne til at tilegne sig og metabolisere sukker, en observation der er i overensstemmelse med en analyse af de genomiske sekvenser af H. pylori
stammer 22.695 og J99 [8]. Glucose er det eneste kulhydrat at H. pylori
er stand til at udnytte hvilket sker via Entner-Doudoroff ruten [9, 10]. Aminosyrer tjener også som carbonkilder for H. pylori
og udnyttes fortrinsvis ved H. pylori
i vækstmedier indeholder en blanding af glucose og aminosyrer [9, 11]. Pyruvat, et nøglemellemprodukt i det centrale stofskifte, ser ud til at blive genereret primært fra lactat, alanin og serin, snarere end glucose i H. pylori
[12, 13]. Pyruvat omdannes til acetyl-CoA ved pyruvat: flavodoxin oxidoreductase i H. pylori
, som derefter kan indgå i tricarboxylsyre (TCA) cyklus [14]. Desuden kan alanin, lactat, acetat, formiat og succinat fremstilles ved H. pylori Salg celler inkuberet aerobt [12]. Produktionen af ​​acetat og formiat som metaboliske produkter antyder eksistensen af ​​en blandet syre gæring vej hos H. pylori
, selvom ilt er afgørende for vækst af bakterien [12].
Analyse af genom sekvenser af H . pylori
stammer 26.695, J99 og HPAG1 afslørede en potentiel operon af tre gener (betegnet som HP0695, HP0696 og HP0697 i H. pylori
26.695) de produkter, hvori delte 50-63% aminosyre identitet med β , α, og y-subunits acetone carboxylase fra Xanthobacter autotrophicus
stammen PY2 og Rhodobacter capsulatus
stammen B10 [15]. Homologer acetone carboxylase findes i en række bakterier, men X. autotrophicus
og R. capsulatus
enzymer bedst karakteriseres. Acetone carboxylase katalyserer den ATP-afhængige carboxylering af acetone til acetacetat og er nødvendig for vækst af X. autotrophicus
og R. capsulatus
med acetone som eneste carbonkilde og elektrondonor for respiration [15-17]. X. autotrophicus
acetone carboxylase har en høj affinitet for acetone (Km = 8 uM), men omsætningshastigheden af ​​enzymet er meget langsom (~ 45 per min) [15]. For at kompensere for den lave omsætningshastighed acetone carboxylase, X. autotrophicus
producerer store mængder af enzymet (17-25% af totalt opløseligt protein) ved dyrkning på acetone [15]
Gener beliggende nær H. pylori Salg HP0695-HP0696-HP0697 operon koder for enzymer vist sig at konvertere acetoacetat at acetoacetyl-CoA, som metaboliseres yderligere til acetyl-CoA [8, 18]. Acetone, acetoacetat og 3-β-hydroxybutyrat er ketonstoffer produceres af mammale perivenøs hepatocytter under fedtsyre nedbrydning og anvendes som elektrondonorer for respiration når kulhydrater er ikke let tilgængelige [19]. Ligesom ketonstoffer er vigtige energikilder for mennesker, når kulhydrater ikke er tilgængelige, kan disse forbindelser virke som respiratoriske elektrondonorer for H. pylori
koloniserer maveslimhinden. For at afgøre, om HP0695-HP0696-HP0697 operon har en rolle i host kolonisering vi inaktiveret HP0696 i H. pylori
stamme SS1. Den HP0696 mutanten blev kompromitteret i sin evne til at kolonisere mus tyder på, at acetone carboxylering eller et beslægtet enzymatisk aktivitet katalyseret af produkter af HP0695-HP0696-HP0697 operon er en væsentlig medvirkende faktor til at være vært for kolonisering.
Resultater
H. pylori
indeholder et sæt gener forudsagt at være involveret i acetone metabolisme
De tre H. pylori Salg stammer, hvis genomer er blevet sekventeret indeholde en klynge af otte bevarede gener inden for en ~ 10 kb DNA-sekvens, hvoraf seks koder for enzymer forventes at metabolisere acetone og acetoacetat til acetyl-CoA (fig. 1 og 2). Helicobacter acinonychis
, en nært beslægtede arter, der inficerer store katte, også i besiddelse af dette gen klynge. Som angivet ovenfor, tre af disse gener deler homologi med acxABC
, selv om de to første gener i operonen er angivet som gener, der koder hydantoin udnyttelse protein A og methylhydantoinase henholdsvis i den kommenterede H. pylori
genomer. Hydantoinaser katalyserer hydrolysen af ​​5-leddede ringe via hydrolyse af en intern imid binding, og ofte har temmelig bred substratspecificitet. Af proteiner i databasen, hvis biokemiske funktioner er blevet påvist, afslørede BLAST analyse, at de forventede produkter af H. pylori
gener bedst matcher de af Xanthobacter
sp. PY2 acxABC
operonen (59-68% aminosyreidentitet over hele længder af de tre forudsagte underenheder). For det senest sekventeret H. pylori
H. acinonychis
genomer den sidste gen af ​​operonen er kommenteret som acxC
[20, 21]. Således H. pylori
HP0695-HP0696-HP0697 operon sandsynligvis koder acetone carboxylase stedet hydantoinase, og vi dermed henvise til denne operon som acxABC
. Figur 1 Organisation af de involverede i acetone metabolisme i H. pylori og H. generne acinonychus stammer. Gene betegnelser er angivet nedenfor hver pil (ikke tegnet i skala). Åbne læserammer, der ikke fik et gen betegnelse i den kommenterede genom sekvenser er angivet med enten en hp betegnelse (for H. pylori
26.695), en JHP betegnelse (for H. pylori
J99), eller kun den åben læseramme nummer (for H. pylori
HPAG1 og A. acinonychis
stamme Sheeba). Ortologe gener i de fire stammer er den samme farve. Generne jhp0628 i H. pylori
J99 og 0671 i H. pylori
HPAG1 svarer til en fusion af hp0688 og hp0689 fra H. pylori
26695. H. pylori
J99 og HPAG1 har to gener i denne region, jhp0629 (HPAG1_0672) og jhp0630 (HPAG1_0672), der koder for en type II DNA methyltransferase og en type II-restriktionsenzym, henholdsvis og er ikke fundet i H. pylori
26695. funktioner for produkter af generne i acetone metabolisme klyngen er beskrevet i teksten. De foreslåede funktioner af produkterne af de omgivende gener er: fecA
, jern (III) dicitrate transport protein; feoB
, jern (II) transport protein; dgkA
, diacylglycerol kinase; gyrA
, underenhed A af DNA gyrase; dcuA
, anaerob C4-dicarboxylat transporter; og ansB
, asparaginase II.
figur 2 Foreslået vej for acetone udnyttelse i H. pylori. Den foreslåede pathway for omdannelsen af ​​acetone til acetyl-CoA i H. pylori
og H. acinonychis
vises. Reaktioner og gener, der koder de enzymer, der er ansvarlige for katalysere hver reaktion er angivet
To andre gener inden for genet klyngen, Scoa
(HP0691) og scoB
(HP0692), kode succinyl CoA:. Acetoacetat CoA-transferase ( SCOT), der katalyserer omdannelsen af ​​acetoacetat plus succinyl-CoA til acetoacetyl-CoA plus succinat [18]. Acetoacetyl-CoA produceret af SCOT metaboliseres yderligere ved acetoacetyl-CoA thiolase, som kodes af Fada
(HP0690; genet betegnet som THL
i H. pylori
J99 og atoB
i H. pylori
HPAG1 og H. acinonychis
), at generere to molekyler af acetyl-CoA fra acetoacetyl-CoA plus coenzym A (CoA) [8]. De to resterende gener i denne klynge, HP0693 og HP0694, forudsiges at kode for et kortkædet fedtsyre permease og en ydre membran-protein, og kan fungere i transport af acetoacetat.
De otte gener inden for denne formodede acetone metabolisme klynge er anbragt samme forhold til hinanden i de tre H. pylori
stammer, men klyngen er orienteret i en af ​​de to mulige retninger (fig. 1), der angiver forekomsten af ​​et DNA-inversion i denne region i udviklingen i H. pylori
. Opstillinger af DNA-sekvenser fra de tre stammer indsnævret stedet for inversion til ~ 40 bp nedstrøms for acxC
homolog og ~ 160 bp opstrøms for startcodonet for Fada
(data ikke vist). Ingen store direkte eller inverterede gentagelser findes i nærheden af ​​disse regioner, der kunne have været involveret i inversion, og så vi ikke kan spekulere til mekanismen for denne inversion. For H. pylori
stammer J99 og HPAG1, men ikke 26.695, er der en forudsagt type II DNA methyltransferase (jhp0629 og HPAG1_0673) og en type II-restriktionsenzym (jhp0630 og HPAG1_0672) støder op til det formodede acetone metabolisme-genklyngen.
H. acinonychis
besidder den formodede acetone metabolisme genklynge og generne inden for klyngen er i samme orientering som i H. pylori
J99. I H. acinonychis
disse gener støder op til dgkA
og gyrA
som de er i H. pylori
, men er flankeret på den modsatte ende af dcuA
og ansB
. Den fecA
og feoB
gener, som er placeret i nærheden af ​​acetone stofskifte gen klynge i H. pylori
stammer, er ~ 69 kb fra dette gen klynge i H. acinonychis
. Således relative arrangement af generne i acetone metabolisme klynge har været bemærkelsesværdigt konserverede under evolutionen af ​​H. pylori
og H. acinonychis
trods af, at den tilstødende region i genomerne af disse to arter er blevet underkastet . omfattende omlejringer
H. pylori acxB: cat
mutant er mangelfuld i sin evne til at kolonisere mus
acxB
gen i H. pylori
SS1, som er en mus-tilpasset stamme , blev afbrudt med en chloramphenicol resistens (cat
) kassette. Kulturer af vildtype H. pylori
SS1 og acxB: cat
mutant blev dyrket i Mueller-Hinton-bouillon suppleret med hesteserum eller en tidligere beskrevet defineret medium [22]. Varierende mængder af acetone i området fra 1,3 mM til 26 mM blev inkluderet i dyrkningsmediet at afgøre, om acetone påvirkede væksten af ​​enten stamme. Cellevækst blev overvåget ved levedygtige celletal samt optiske tætheder af kulturer på forskellige tidspunkter. Herunder acetone i enten vækstmedier havde ingen effekt på vækstraten eller endelig celle udbyttet af H. pylori
SS1 eller acxB: cat
mutant (data ikke vist). Den manglende acetone til at stimulere væksten af ​​H. pylori
SS1 under de testede betingelser ikke er uventet, da væksten medier for H. pylori
er meget næringsrige. Disse resultater tyder også på, at acxABC
ikke er nødvendig for acetone afgiftning
evne acxB:. Kat
mutant at kolonisere mus blev sammenlignet med den for forældrenes H. pylori
SS1 stammen i to separate forsøg. I hver undersøgelse var elleve mus inokuleret med vildtype-stammen og elleve blev podet med acxB: cat
mutant. Tre uger efter podning af musene med H. pylori
stammer blev musene aflivet, og antallet af H. pylori
i maver dyrene blev bestemt. For de mus, der var blevet podet med vildtypestammen, de fleste af dyrene (19/22 dyr) havde H. pylori
tællinger, der var et godt stykke over detektionsgrænsen, hvilket var 500 cfu per gram maven (fig. 3). Antallet af H. pylori
i prøver, der var over detektionsgrænsen varierede fra 10 4-10 6 cfu per gram mave. De fleste af musene inokuleret med den acxB: cat
mutant også har målelig niveauer af H. pylori
(15/22 dyr), men antallet af H. pylori
forbundet med disse mus var generelt en til to størrelsesordener lavere end dem hos mus, der var blevet podet med vildtypestammen. En statistisk analyse af data ved hjælp af en Wilcoxin Rank test kontrolleret, at forskellene i antallet af H. pylori
isoleret fra mus podet med de to stammer var signifikante ved et konfidensniveau på 99%, hvilket indikerer, at acetone carboxylase forbedret evne til H. pylori
SS1 at kolonisere mus maven. Da vi var ude af stand til at klone acxABC
operonet kunne vi ikke verificere ved komplementering at acxB
mutation var ansvarlig for defekt i koloniseringen. Det er imidlertid usandsynligt, at koloniseringen fænotype acxB
mutanten skyldtes polære virkninger, da der ikke er yderligere gener i acxABC
operonen i nogen af ​​de tre H. pylori Salg stammer, hvis genomer er blevet sekventeret til dato (fig. 1). Desuden koloniseringen manglen ikke sandsynligt skyldes svækkelse eller en sekundær mutation, da vi konstrueret acxB
mutanten i en frisk isolat af stamme SS1 udvundet fra en inficeret mus. Figur 3 Mouse kolonisering assay for H. pylori SS1 og en isogen acxB: cat mutantstamme. Data er præsenteret som et scatter plot af kolonidannende enheder per gram maven som bestemt ved pladetællinger. Hver plet repræsenterer cfu tælle fra én mus, udtrykt som værdien af ​​log10 (cfu /g mave) i Y-aksen. Basislinjen [log10 (cfu /g mave) = 2,7] er detektionsgrænsen for assayet, som repræsenterer tællingen under 500 cfu /g mave.
Acetone niveauer i muse maven
Da dataene fra mus kolonisering analyser foreslog, at evnen til at udnytte acetone af H. pylori
var vigtigt for effektiv vært kolonisering, vi ønskede at afgøre, om H. pylori
stødt betydelige acetone niveauer i musen maven. Selv acetone niveauer er blevet rapporteret for forskellige kropsvæsker, var vi ikke bekendt med rapporter om acetone der er forbundet med mavesaft eller væv. Derfor målte vi acetone, der er forbundet med muse gastrisk væv efter hurtig fjernelse af maver fra mus og umiddelbart placere maver i forseglede serumhætteglas. Da vi ønskede at estimere acetone niveauer, H. pylori
kunne støde på under vedvarende infektion, blev dyr, der anvendes til denne undersøgelse vedligeholdes på en regelmæssig fodring tidsplan og blev ofret i morgen forud for modtagelsen deres normale daglige mad kolonihave. De forseglede serum hætteglas indeholdende musenes maver blev inkuberet på is for at tillade acetonen forbundet med den gastriske væv ækvilibrere med gasfasen i hætteglassene, efter hvilket tidsrum prøverne gasfasen blev analyseret ved gaskromatografi. Denne procedure blev udført først ved at ofre dyrene og fjerne deres maver. Lignende resultater blev imidlertid opnået ved at fjerne de maver fra levende dyr, der var blevet bedøvet. Mængden af ​​acetone er forbundet med gastrisk væv for hver individuel mus varierede, lige fra -10 til 110 pmol acetone per gram vådvægt væv (fig. 4), idet de fleste værdier (6/7) falder i området fra 10 og 35 pmol acetone per gram vådvægt væv. Disse data antyder, at millimolære mængder af acetone er forbundet med muse gastriske væv og kunne være til rådighed som en potentiel carbon- eller energikilde for H. pylori
. Dette niveau af acetone associeret med musen gastrisk væv var højere end hvad vi forventet siden niveauer af serum ketonstoffer varierer i mennesker og andre pattedyr generelt fra < 0,5 mM til nogle få millimolær [23]. Acetone der fremstilles i pattedyr ved spontan decarboxylering af acetoacetat og denne decarboxylering forstærkes ved lav pH, og så acetone kan ophobes i maven på grund af mavesyre. Figur 4 Acetone niveauer associeret med muse gastriske væv. Mave acetone niveauer blev bestemt for tre mus efter at ofre dyrene og straks fjerne deres maver (post mortem), og for fire mus, der blev bedøvet, hvorefter deres maver blev fjernet (pre-mortem). Udskårne mus maver blev anbragt umiddelbart i forseglede hætteglas, som derefter blev anbragt på is i mindst 30 minutter for at tillade acetone forbundet med den gastriske væv ækvilibrere med gasfasen. Acetone niveauer på gas- faser hætteglassene blev målt ved gaschromatografi og estimeret fra standardkurver genereret for hvert hætteglas. Hver værdi repræsenterer gennemsnittet af mindst tre målinger og fejl søjler indikerer standardafvigelserne for hver prøve.
Diskussion
Vi leverer bevis for, at H. pylori
besidder en funktionel acetone carboxylase som postuleret tidligere af Ensign og co -workers [15]. Den H. pylori acxABC
operon er nær scoAB
og fadB
gener, der koder for enzymerne SCOT og acetoacetyl-CoA thiolase. Således er denne genklynge koder for et sæt af enzymer, der kan metabolisere acetone til acetyl-CoA. Acetyl-CoA fremstillet af acetone og acetoacetat kunne indgå i TCA cyklus for at give energi til H. pylori
. Som observeret af Pflock og medarbejdere den acxABC
operonet og andre gener, der er forbundet med acetone stofskifte er til stede i H. acinonychis
[24]. Disse gener er fraværende, men i den anden nært beslægtet ε-Proteobacteria hvis genomer hidtil er blevet sekventeret, som omfatter Helicobacter hepaticus
, Campylobacter jejuni
, Thiomicrospira denitrificans
, og Wolinella succinogenes
. Anskaffelse og vedligeholdelse af acetonen metabolisme-genklyngen i H. pylori
og H. acinonychis
kan være relateret til den kendsgerning, at i modsætning disse andre relaterede ε-Proteobacteria, de koloniserer maveslimhinden. Den gruppering af disse gener og fraværet af ortologe gener i andre nært beslægtede ε-Proteobacteria kunne indikere mulig overtagelse af disse gener af H. pylori
og H. acinonychus
gennem lateral genoverførsel. G + C indholdet i denne klynge acetone metabolisme gener i H. pylori
er lidt højere end gennemsnittet for hele genomet, men dette synes grundet produkterne af disse gener er meget rig på glycin (~ 10% sammenligne til 6% genom gennemsnit). Desuden kompositoriske egenskaber af disse gener, såsom dinukleotid relative mængder og codon bias, er ikke udtryk for nylig lateral overførsel af denne region [25] (J. Mrazek, personlig kommunikation).
Jungblut og medarbejdere rapporterede, at H . pylori
AcxC (HP0698) krydsreagerede med antistoffer fra en adenocarcinom patient, hvilket indikerer, at H. pylori acxABC
operon udtrykkes i værten [26]. Desuden viser vi her, at H. pylori
kan støde signifikante niveauer af acetone i musen maven og så dette stof kan tjene som en vigtig respiratorisk elektron donor for bakterien i værten. I overensstemmelse med denne hypotese blev H. pylori acxB
mutant signifikant reduceret i sin evne til at kolonisere mus maven, som vi udlede resultater fra den manglende evne af mutant at anvende acetone som energikilde. Den manglende evne acetone til at stimulere væksten af ​​H. pylori
SS1 i flydende kultur kan skyldes svigt i væksten medier, der anvendes til at efterligne vækstbetingelserne stødt af bakterien, når koloniserer maveslimhinden. En alternativ hypotese for kolonisering defekt af acxB
mutant er, at der er behov for acetone carboxylase til afgiftning af acetone. Men vores manglende evne til at observere nogen hæmning i væksten af ​​acxB
mutant ved tilsætning af acetone i dyrkningsmediet taler imod sidstnævnte hypotese. En anden mulighed er, at produkterne af acxABC
operonen katalysere en ukendt reaktion, der er vigtig for overlevelse eller cellevækst af H. pylori
i maveslimhinden. Yderligere biokemisk karakterisering af produkterne fra H. pylori acxABC
operon skal bidrage til at skelne mellem disse possibililties.
En nylig transkriptom analyse af H. pylori
26.695 ved hjælp af en hel genom microarray foreslog, at svaret regulator HP1021 stærkt aktiveret transskription af acxABC
og scoAB
, og aktiveret transskription af Fada
hp0693 i mindre omfang [24]. Forfatterne til denne undersøgelse viste, at HP1021 binder promotoren regulatoriske region af acxABC
, antyder, at denne responsregulatorprotein direkte medierer sine virkninger på transkription af acxABC
og at generne i acetone metabolisme klynge er en del af en regulon kontrolleret af HP1021. Pflock og kolleger identificeret 79 gener i H. pylori
26695 hvis udtryk blev ændret i HP1021 mutant - 51 gener blev transkriberet på lavere niveauer i mutant mens 28 gener blev udtrykt ved højere niveauer [24]. HP1021 adskiller sig fra de fleste andre respons regulatorer i, at det mangler den højt konserveret fosfat-accepterende aspartat rest, og en beslægtet histidin kinase for HP1021 er ikke blevet identificeret. Der er modstridende rapporter om transkriptionen af ​​HP1021 som reaktion på sur pH, samt på transkriptionen af ​​H. pylori acxABC Salg som reaktion på lavere pH [27-29]. Disse forskelle kan skyldes den måde, hvorpå bakterierne blev dyrket. Selv om disse rapporter konflikt med hensyn til transkription af HP1021 som respons på sur pH, resultater fra begge undersøgelser viser, at betingelser, der fører til nedregulering af HP1021 resultere i forøget ekspression af acxABC
. Dette synes ulogisk givet den tilsyneladende rolle HP1021 i aktivering transskription af acxABC
.
Den eneste anden bakterie, for hvilken regulering af acxABC
operonet er blevet undersøgt, er X. autotrophicus
. Transkriptionskontrol af acxABC
i X. autotrophicus
adskiller sig fra i H. pylori
. X. autotrophicus
mangler en homolog af HP1021, men regulerer transkription af acxABC
via σ 54 (RpoN) og σ 54-afhængige aktivator AcxR [15]. Selvom H. pylori
besidder σ 54, den acxABC
operonet er ikke en del af H. pylori
RpoN regulon [30].
Trods vores observation, at afbrydelse af acxB
negativ indvirkning kolonisering af mus ved H. pylori
SS1, seneste hele genom microarray studier med halvtreds-seks globalt repræsentativt stammer af H. pylori
og fire H. acinonychis
stammer indikerede, at acxABC
gener ikke forekommer i alle H. pylori
stammer [31]. Det ville være interessant at bestemme, om isolaterne mangler acxABC
er mindre konkurrencedygtige i kolonisere deres naturlige værter end stammer, der besidder disse gener. Alternativt stammer mangler acxABC
kan have tilpasninger, der kompenserer for den manglende acetone carboxylase aktivitet. Resultater fra microarray undersøgelser af Gressmann og kolleger viste, at scoAB
, Fada
, HP0693 og HP0694 var til stede i alle H. pylori
og H. acinonychis
stammer undersøgte [31]. Således selektivt tryk for at opretholde evnen til at udnytte acetoacetat som en potentiel elektrondonor i H. pylori
og H. acinonychis
synes at være større end for acetone metabolisme.
Konklusion
H . pylori acxABC
operon sandsynligvis koder acetone carboxylase, der katalyserer omdannelsen af ​​acetone til acetacetat og er tæt forbundet med gener, hvis produkter er forudsagt at katalysere den sekventielle omdannelse af acetoacetat til acetyl-CoA. Inspektion af genomer fra andre nært beslægtede ε-Proteobacteria antyder, at gener involveret i acetone metabolisme er kun til stede i bakterier i denne subphylum at kolonisere maveslimhinden. Den acxABC
operon var ikke afgørende for mus kolonisering af H. pylori
SS1, men det ser ud til at forbedre kolonisering. Yderligere karakterisering af den formodede H. pylori
acetone carboxylase og produkterne af de andre gener i acetone stofskifte genklynge bør give indsigt i, hvordan ketonstoffer fra værten bidrager til metaboliske økonomier H. pylori
og H . acinonychis
og hvordan disse forbindelser påvirker evnen af ​​disse bakterier til at kolonisere deres værter. Salg Metoder
Bakteriestammer og medier
Plasmidkonstruktion og kloning blev udført i E. coli
stamme DH5a som blev dyrket i Luria-Bertani-medium ved 37 ° C. H. pylori
stamme 26.695 blev anvendt som skabelon for polymerasekædereaktion (PCR). H. pylori
SS1 blev anvendt som vildtypestammen for alle eksperimenter og var dyrket på enten blod agar eller tryptisk soja-agar suppleret med 5% hesteserum (TSA-serum) ved 37 ° C under en atmosfære af 4% O 2, 5% CO 2 og 91% N 2. Når de dyrkes i flydende medium, blev H. pylori
kulturer dyrket i Mueller-Hinton-bouillon suppleret med 5% hesteserum og 30 ug /ml bacitracin eller det definerede vækstmedium beskrevet af Bruggrabber og medarbejdere [22]. Cultures (10-15 ml vokset medium) blev dyrket i 150 ml serum hætteglas forseglet med 20 mm Teflon /silikone diske og aluminium hætter og under en atmosfære af 4% O 2, 5% CO 2, 10 % H 2, 81% N 2. Medmindre andet er angivet, når antibiotika blev inkluderet i mediet de blev sat til følgende koncentrationer: 100 ug /ml ampicillin, 30 ug /ml chloramphenicol, 200 ug /ml bacitracin 10 ug /ml vancomycin, og 10 ug /ml amphotericin B.
Inaktivering af acxB
(HP0696) i H. pylori
SS1
En 2,3 kb DNA-fragment, der udføres acxB
blev opformeret ved PCR fra H. pylori
stamme 22.695 og klonet i pGEM-T (Promega). En kat
kassette blev indført i dette plasmid ved et Eco
47III lokaliseret omtrent i midten af ​​det klonede acxB
. Det resulterende plasmid blev anvendt som en selvmordsvektor til inaktivering af kromosomale kopi af acxB
i H. pylori
SS1. Det selvmord vektor blev indført i H. pylori
stammer ATCC 43504 og SS1, en stamme, der kan kolonisere mus. Fordi gentagen passage af H. pylori
stammen SS1 på medium er blevet rapporteret at resultere i tab af infektivitet i mus, blev acxB
mutant konstrueret på en frisk isolat af stammen SS1 genvundet fra en inficeret mus. Antallet af passager af acxB
mutant i SS1 stammen var begrænset og registreres, og mutanten blev opbevaret nedfrosset ved -80 ° C. Den parentale SS1 stamme blev opretholdt og opbevaret frosset på en identisk måde. Vi bekræftet ved PCR at den kromosomale kopi af acxB
blev sprængt ved allel udskiftning med det plasmidbårne kopi af genet under anvendelse af et sæt primere, der flankerede stedet for forstyrrelser. Salg Vækstkurver for H. pylori
stammer
H. pylori
celler fra TSA-serum plader, hvor stammerne var blevet udstrøget på den foregående dag blev suspenderet i phosphatbufret saltvand (PBS) og anvendt til inokulering flydende medium ved en OD 600 på 0,03. Hvor angivet, blev acetone tilsættes aseptisk til mediet. Prøver blev udtaget på forskellige tidspunkter og celledensiteter blev målt ved lysspredning ved OD 600. Alternativt blev levedygtige celletal bestemt efter seriel fortynding af prøverne og plating på TSA-serum. Efter 4 til 5 dage inkubation blev antallet af kolonidannende enheder (CFU) bestemt for pladerne.
Mus kolonisering
mus kolonisering assays blev udført i det væsentlige som beskrevet tidligere [32]. Disse procedurer overholdt de relevante føderale retningslinjer og institutionelle politikker for pleje og håndtering af forsøgsdyr. Kort fortalt blev H. pylori
celler høstet efter 48 timers vækst på blodagarplader og suspenderet i PBS til en OD 600 på 1,7. Headspace i røret blev gennemboblet med argon for at minimere eksponering oxygen.

• Healing potentiale Picrorhiza kurroa (Scrofulariaceae) jordstængler mod indomethacin-induceret gastrisk ulcus:. En mekanistisk udforskning
• Dosisafhængig hæmning af gastrisk skade ved brint i alkalisk elektrolyserede drikkeri water