Ihmisen mahalaukun taudinaiheuttaja Helicobacter pylori on potentiaalia asetonia boksylaasia joka parantaa sen kyvystä kolonisoida mice

ihmisen mahalaukun taudinaiheuttaja helikobakteeri
on potentiaalia asetonia boksylaasia joka parantaa sen kyvystä kolonisoida hiiriä
tiivistelmä
tausta
Helicobacter pylori
colonizes ihmisen vatsassa ja on etiologinen ulkustauti. Kaikki kolme H. pylori
kantoja, jotka on sekvensoitu tähän mennessä sisältää mahdollisen operonin, jonka tuotteet homologia kanssa alayksiköiden asetonia karboksylaasin (koodaa acxABC
) päässä Xanthobacter autotrophicus
kanta PY2 ja Rhodobacter capsulatus
-kanta B10. Asetoni-karboksy- katalysoi asetonia asetoasetaatiksi. Geenien ylävirtaan oletetun acxABC
operoni koodaavat entsyymejä, jotka muuntavat etyyliasetoasetaatti asetoasetyyli-CoA, joka metaboloituu edelleen tuottaa kaksi molekyyliä asetyyli-CoA.
Tulokset
Sen määrittämiseksi, H. pylori acxABC
operonin on rooli isännän kolonisaation acxB
homologi hiiren sopeutettuja helikobakteeri
SS1 kanta inaktivoitiin kanssa kloramfenikolin-vastus (cat
) kasetti. Hiiren kolonisaatiota tutkimuksissa numerot H. pylori
talteen hiiristä, jotka oli ympätty acxB: kissa
mutantti oli yleensä viisikymmentäyhdeksän yli yksi kertaluokkaa pienempi kuin talteen hiiristä, jotka oli inokuloitu emokantaan. Tilastollinen analyysi tiedoista käyttäen Wilcoxin Rank testi osoitti eroja numerot helikobakteeri
eristettiin hiiristä ympätty kaksi kannat olivat merkitsevä 99%: n luotettavuustasolla. Tasot asetonia liittyvä mahalaukun kudosta poistettu infektoimattomilta hiiret mitattu ja vaihtelevat 10-110 μmols per gramma märkäpainoa kudosta.
Päätelmä
siirtokuntien vika on acxB: kissa
mutantti viittaa rooli että acxABC
operoni eloonjäännin bakteerin vatsassa. Tuotteet on H. pylori acxABC
operoni voi toimia ensisijaisesti asetoniin käyttöasteen tai voi katalysoida liittyvä reaktio, joka on tärkeä selviytymisen tai kasvun isännässä. H. pylori
kohtaa merkittäviä määriä asetonia vatsaan, jossa se voisi käyttää mahdollisena elektronin luovuttaja mikroaerobisissa hengitystä.
Tausta
Helicobacter pylori
on mikroaerofiilisessä, gram-negatiivinen bakteeri, joka on merkittävä taudinaiheuttaja ihmisen mahalaukun limakalvon [1, 2]. Kolonisaatiota mahan limakalvon H. pylori
johtaa krooniseen tulehdukseen, joka voi edetä erilaisia ​​sairauksia, mukaan lukien krooninen gastriitti, mahahaava, mahasyöpä ja limakalvojen liittyvä lymfooma [3-5]. Koska Mikrobilääkehoidossa isäntä on todennäköisesti kärsivät eliniän helikobakteeri
infektio mahalaukun limakalvon.
Kyky Helikobakteeri
sinnikkäästi ihmisen mahalaukussa pitkäksi aikaa osoittaa, että se soveltuu hyvin hankkimaan tarvitsemansa ravintoaineet kasvua tämän ainutlaatuisen kapealla. Esimerkiksi limakalvojen kerros hiiren vatsan sisältää merkittäviä määriä molekulaarista vetyä (17-93 uM), jotka ovat peräisin metabolista aktiivisuutta mikrobikasvuston paksusuolessa [6]. Helikobakteeri
pystyy hyödyntämään tätä molekyyli vedyn elektronin luovuttajana mikroaerobisen hengityksen ja toiminnallinen hydrogenase tarvitaan onnistuneen kolonisaatiota hiirillä helikobakteerin
[6, 7]. Toisin kuin monet vety-hapettavat bakteerit kuitenkin helikobakteeri
ei kykene autotrophic CO 2 kiinnitystä.
Useat tutkimukset ovat tutkineet kykyä H. pylori
käyttää erilaisia ​​hiililähteitä. Helikobakteeri
on rajallinen kyky hankkia ja aineenvaihdunta sokereita, havainto, joka on yhdenmukainen analyysi geenisekvenssejä H.pylorin
kannat 22695 ja J99 [8]. Glukoosi on ainoa hiilihydraatti, että H. pylori
pystyy hyödyntämään minkä se tekee kautta Entner-Doudoroff reitti [9, 10]. Aminohapot toimivat myös hiilen lähteinä H. pylori
ja niitä käytetään edullisesti H. pylori
kasvun elatusaineessa, joka sisälsi seosta, jossa oli glukoosia ja aminohappoja [9, 11]. Pyruvaattia, joka on keskeinen välituote keskustassa aineenvaihduntaa, näyttää syntyvän pääasiassa laktaatti, alaniini ja seriini, mieluummin kuin glukoosin H. pylori
[12, 13]. Pyruvaatti muunnetaan asetyyli-CoA pyruvaattimäärityksellä: flavodoxin oksidoreduktaasi H. pylori
, jota voidaan sitten syöttää suoraan trikarboksyylihappo (TCA) kierto [14]. Lisäksi, alaniini, laktaatti, asetaatti, formiaatti ja sukkinaattia voidaan valmistaa H. pylori
soluja inkuboitiin aerobisesti [12]. Tuotannon asetaattia ja formiaattia aineenvaihduntatuotteiden ehdottaa, että on olemassa sekoitetun happo käyminen väylän H. pylori
, vaikka happi on välttämätöntä bakteerin kasvuun [12].
Analyysi genomin sekvenssit H . pylori
-kantoja 26695, J99 ja HPAG1 paljasti mahdollisen operonin kolme geeniä (nimetty HP0695, HP0696 ja HP0697 H. pylori
26695), joiden tuotteita jaetun 50-63%: n aminohapposekvenssi-identtisyys β , α, ja γ alayksiköiden asetonia boksylaasia peräisin Xanthobacter autotrophicus
rasitusta PY2 ja Rhodobacter capsulatus
-kannan B10 [15]. Homologit asetonia karboksylaasi löytyy useita bakteereja, mutta X. autotrophicus
ja R. capsulatus
entsyymejä parhaiten karakterisoitu. Asetoni-karboksy- katalysoi ATP-riippuvainen karboksylaatio asetonia asetoasetaatiksi ja tarvitaan kasvuun X autotrophicus
ja R. capsulatus
asetonilla ainoana hiilen lähteenä ja elektronidonorin hengitystä [15-17]. X. autotrophicus
asetonia boksylaasia on suuri affiniteetti asetonilla (Km = 8 uM), mutta kiertonopeus entsyymi on hyvin hidasta (~ 45 per min) [15]. Kompensoida alhainen vaihtuvuus asetonia boksylaasia, X. autotrophicus
tuottaa suuria määriä entsyymin (17-25% koko liukoista), kun kasvatetaan asetonia [15]
Geenit lähellä helikobakteerin
HP0695-HP0696-HP0697 operoni koodaa entsyymejä esitetty muuntaa etyyliasetoasetaatti asetoasetyyli-CoA, joka metaboloituu edelleen asetyyli-CoA [8, 18]. Asetoni, asetoasetaatin ja 3-β-hydroksibutyraatti ovat ketoaineita tuotetaan nisäkkään perivenous maksasolujen aikana rasvahappojen hajoamisen ja niitä käytetään elektroninluovuttajina hengitystä kun hiilihydraatit eivät ole helposti saatavilla [19]. Aivan kuten ketoaineita ovat tärkeitä energianlähteitä ihmiselle kun hiilihydraatit eivät ole käytettävissä, nämä yhdisteet voivat olla hengityksen elektronin luovuttajia varten helikobakteeri
asettumaan mahalaukun limakalvon. Sen määrittämiseksi, HP0695-HP0696-HP0697 operoni on rooli isännän kolonisaation me inaktivoitu HP0696 H. pylori
rasitusta SS1. HP0696 mutantti on vaarantunut sen kyvystä kolonisoida hiiriä viittaa siihen, että asetonia karboksyloimalla tai siihen liittyvää entsymaattista aktiivisuutta katalysoi tuotteet HP0695-HP0696-HP0697-operoni on merkittävä vaikuttava tekijä isäntä kolonisaation.
Tulokset
H. pylori
sisältää joukon geenejä ennustetaan olla mukana asetonia aineenvaihduntaan
kolme helikobakteeri
kantoja, joiden genomit on sekvensoitu sisältää klusterin kahdeksan säilyneitä geenien sisällä ~ 10 kb DNA-sekvenssi, joista kuusi koodaavat entsyymejä ennustettu aineenvaihdunta asetonia ja asetoasetaatiksi asetyyli-CoA (kuviot. 1 ja 2). Helicobacter acinonychis
, läheistä sukua olevan lajin, joka tartuttaa suuri kissaeläimiä, myös hallussaan tämän geenin klusterin. Kuten edellä on esitetty, kolme näistä geeneistä homologiaa acxABC
, vaikka kaksi ensimmäistä geenien operoni on merkitty geenejä, jotka koodaavat hydantoiini käyttöä proteiini-A ja methylhydantoinase, vastaavasti, selityksin H. pylori
genomeja. Hydantoinases katalysoivat hydrolyysiä 5-jäsenisiä renkaita hydrolyysin kautta sisäisen imidisidoksen ja usein on varsin laaja substraattispesifisyys. Proteiinien tietokantaan, jonka biokemiallisia tehtävät on osoitettu, BLAST-analyysi paljasti, että ennustettu tuotteet helikobakteerin
geenit parhaiten vastaavat samat kuin Xanthobacter
sp. PY2 acxABC
operonin (59-68% aminohappojen identtisyys koko pituudeltaan kolmen ennustetun alayksiköstä). Jotta viimeksi sekvensoitu helikobakteeri
ja H. acinonychis
genomien viimeinen geeni operonin on annotoitu acxC
[20, 21]. Siten helikobakteeri
HP0695-HP0696-HP0697 operonin todennäköisesti koodaa asetonia boksylaasia sijasta hydantoinase, ja me siis viitata tähän operonin acxABC
. Kuvio 1 järjestön geenien asetonissa aineenvaihduntaa helikobakteeri ja H. acinonychus kantoja. Gene nimitykset on esitetty alla kunkin nuolen (ei piirretty mittakaavaan). Avoimet lukukehykset jotka eivät saaneet geenin nimityksen selityksin genomin sekvenssit on merkitty joko hp nimitys (H. pylori
26695), joka on JHP nimitys (H. pylori
J99), tai ainoastaan avoimen lukukehyksen numero (H. pylori
HPAG1 ja A. acinonychis
-kanta Sheeba). Ortologiset geenit neljän kannat ovat samanvärisiä. Geenit jhp0628 vuonna helikobakteeri
J99 ja 0671 vuonna Helikobakteeri
HPAG1 vastaavat fuusio hp0688 ja hp0689 Helikobakteeri
26695. helikobakteeri
J99 ja HPAG1 on kaksi geeniä tällä alueella, jhp0629 (HPAG1_0672) ja jhp0630 (HPAG1_0672), jotka koodaavat tyypin II DNA-metyylitransferaasia, ja tyypin II restriktioentsyymiä, vastaavasti, ja joita ei löydy H. pylori
26695. toiminnot tuotteiden geenien sisällä asetonia aineenvaihduntaa klusterin kuvataan tekstissä. Ehdotetun toiminnot tuotteiden ympäröivän geenit ovat: fecA
, rauta (III) dicitrate liikenteen proteiini; feoB
, rauta (II) liikenne-proteiinia; dgkA
, diasyyliglyseroli kinaasi; gyrA
, alayksikkö A DNA-gyraasin; dcuA
, anaerobiset C4-dikarboksylaatti transporter; ja ansB
, asparaginaasi II.
Kuva 2 Ehdotetut koulutusjakson asetonia hyödyntämiseen helikobakteeri. Ehdotettu polku muuntamiseksi asetonia asetyyli-CoA: n helikobakteeri
ja H. acinonychis
näkyy. Reaktioita ja geenit, jotka koodaavat entsyymit, jotka vastaavat katalysoimaan kunkin reaktion on osoitettu.
Kaksi muuta geenien geenin klusterin, SCoA
(HP0691) ja scoB
(HP0692), koodata sukkinyyli-CoA: asetoasetaatiksi CoA-transferaasi ( SCOT), joka katalysoi asetoasetaatin ja sukkinyyli-CoA: n asetoasetyyli-CoA-plus-sukkinaatti [18]. Asetoasetyyli- CoA tuotettu SCOT metaboloituu edelleen asetoasetyyli- CoA tiolaasi, jota koodaa Fada
(HP0690; geeni selityksin kuin THL
vuonna helikobakteeri
J99 ja atoB
H. pylori
HPAG1 ja H. acinonychis
), tuottaa kaksi molekyyliä asetyyli-CoA asetoasetyyli-CoA-plus koentsyymi A: n (CoA) [8]. Kaksi jäljellä geenit tämän klusterin, HP0693 ja HP0694, ennustetaan koodaavan lyhytketjuisen rasvahapon permease ja ulkokalvon proteiini, vastaavasti, ja se voi toimia kuljetuksen asetoasetaattia.
Kahdeksan geenit tämän oletetun asetonia aineenvaihduntaa klusterin on järjestetty samaan toistensa suhteen kolmen H. pylori
kantoja, mutta klusteri on suunnattu joko kahdesta mahdollisesta suuntaan (Fig. 1), joka osoittaa esiintyminen DNA-inversion tällä alueella evoluution aikana helikobakteeri
. Rinnastukset DNA-sekvenssit kolmessa kannassa kaventunut sivuston inversio ~ 40 bp alavirtaan acxC
homologi ja ~ 160 bp ylävirtaan aloituskodonista ja Fada
(tuloksia ei ole esitetty). Ei suuria suora tai käänteinen toistoja löytyy lähellä näitä alueita, jotka ovat saattaneet ollut mukana inversio, joten emme voi spekuloida, mekanismi tämän käännellen. H. pylori
-kantojen J99 ja HPAG1, mutta ei 26695, on ennustettu tyypin II DNA-metyylitransferaasia (jhp0629 ja HPAG1_0673) ja tyypin II restriktioentsyymiä (jhp0630 ja HPAG1_0672) vieressä oletetun asetoni aineenvaihduntaa geeniklusterista.
H. acinonychis
hallussaan oletetun asetonilla aineenvaihduntaa geenin klusterin ja geenien klusterissa ovat samansuuntaisesti kuin vuonna helikobakteeri
J99. H. acinonychis
nämä geenit ovat lähellä dgkA
ja gyrA
kuin ne ovat H. pylori
, mutta reunustavat vastakkaiseen päähän, jonka dcuA
ja ansB
. FecA
ja feoB
geenejä, jotka sijaitsevat lähellä asetonilla aineenvaihdunnan geeni klusteri helikobakteerin
kannat, ovat ~ 69 kb tästä geenistä klusteri H. acinonychis
. Näin ollen, suhteellinen järjestely geenien asetonin aineenvaihduntaa klusteri on pysynyt erittäin konservoitunut evoluution aikana H. pylorin
ja H. acinonychis
huolimatta siitä, että viereisen alueen genomien näiden kahden lajin on tehty laaja uudelleenjärjestelyjä.
helikobakteeri acxB: kissa
mutantti on puutteellinen sen kyvystä kolonisoida hiiriä
acxB
geeni H. pylori
SS1, joka on hiiren mukautettu kannan , hajotettiin kanssa kloramfenikoliresistenssi (kissa
) kasetti. Viljelmät villityypin H. pylori
SS1 ja acxB: kissa
mutantti kasvatettiin Mueller-Hinton-liemessä, johon hevosen seerumia tai aiemmin kuvattu määritellyssä alustassa [22]. Vaihtelevia määriä asetonia vaihtelevat 1,3 mM 26 mM sisällytettiin kasvualustan onko asetonia vaikutti kasvuun kummankaan kannan. Solujen kasvua seurattiin elinkykyisten solujen määrää sekä absorbanssit kulttuureissa eri aikoina. Sisältää asetonia joko elatusaineeseen ei ollut vaikutusta kasvu tai lopullinen -solusaaliiseen H.pylorin
SS1 tai acxB: kissa
mutantti (tuloksia ei ole esitetty). Epäonnistuminen asetonia kasvun edistämiseksi H.pylorin
SS1 testiolosuhteissa ei ole odottamatonta, koska kasvualustan H. pylori
on erittäin ravinteikasta. Nämä havainnot viittaavat siihen, että acxABC
ei tarvita asetonia vieroitus.
Kyky acxB: kissa
mutantti asuttaa hiiriä verrattiin kuin vanhempien H. pylori
SS1 kannan kahdessa erillisiä kokeita. Kussakin tutkimuksessa yksitoista hiiriin istutettiin kanssa villikannan ja yksitoista istutettiin acxB: kissa
mutantti. Kolme viikkoa ymppäyksen jälkeen hiirten kanssa H. pylori
kantoja, hiiret tapettiin ja niiden lukumäärää H. pylori
vatsasta eläinten määritettiin. Hiirillä, jotka oli inokuloitu villityypin kanta, useimmat eläimet (19/22 eläimet) oli H. pylori
määrä, jotka olivat selvästi määritysrajan, joka oli 500 pmy grammaa kohti vatsaan (Fig. 3). Määrä H. pylori
näytteissä, jotka olivat yli määritysrajan vaihteli 10 4-10 6 pesäkkeitä muodostavaa yksikköä grammassa vatsaan. Useimmat hiiret inokuloitiin acxB: kissa
mutantti oli myös mitattavia määriä H. pylori
(15/22 eläintä), mutta määrä H. pylori
liittyvät nämä hiiret olivat yleensä yksi kaksi suuruusluokkaa pienempi kuin hiirillä, jotka oli inokuloitu villityypin kannasta. Tilastollinen analyysi tiedoista käyttäen Wilcoxin Rank testi varmistanut, että erot numerot helikobakteeri
eristettiin hiiristä ympätty kaksi kannat olivat merkitsevä 99%: n luottamustasolla, mikä osoittaa, että asetonia boksylaasia parantaa kykyä helikobakteeri
SS1 asuttaa hiiren vatsan. Koska emme kyenneet kloonata acxABC
operonin emme pystyneet vahvistamaan täydentämisen että acxB
mutaatio oli vastuussa vika kolonisaation. On kuitenkin epätodennäköistä, että kolonisaation fenotyypin acxB
mutantti johtui polaarisia vaikutuksia, koska ei ole olemassa muita geenejä acxABC
operonin tahansa kolmesta H. pylori
kantoja, joiden genomit ovat olleet sekvensoitu tähän mennessä (Fig. 1). Lisäksi kolonisaatio vika ei ole todennäköistä, koska vaimennus tai toissijainen mutaatio koska olemme rakennettu acxB
mutantti tuoreen eristää kannan SS1 toipunut tartunnan hiiren. Kuvio 3 Mouse asuttaminen määritys helikobakteeri SS1 ja isogeenisistä acxB: kissa mutanttikanta. Tiedot esitetään hajontakuvio pesäkettä muodostavaa yksikköä grammaa kohti vatsan määritettynä maljalukumäärät. Jokainen paikka edustaa cfu laskea yhdestä hiiren ilmaistuna arvo log10 (pmy /g maha) Y-akselilla. Pohja rivi [log10 (pmy /g maha) = 2.7] on toteamisraja määrityksen, joka edustaa määrä alle 500 pmy /g vatsaan.
Asetoni tasot hiiren vatsassa
Koska tietoja hiiri kolonisaatio määrityksissä viittasi siihen, että kyky hyödyntää asetonia helikobakteeri
oli tärkeää tehokas isäntä kolonisaation, halusimme onko helikobakteeri
havaitsi merkittäviä asetonia tasot hiiren vatsassa. Vaikka asetonia tasoja on raportoitu eri kehon nesteitä, olimme tietoisia raportteja asetonia tasoilla liittyy mahanesteen tai kudosta. Siksi mittasimme asetonia tasoihin, jotka liittyvät hiiren mahan kudoksen jälkeen nopeasti poistamalla mahat hiiriltä ja välittömästi sijoittamalla vatsat suljetuissa seerumilääkepulloihin. Koska halusimme arvioida asetonia tasolle, että helikobakteeri
voisi kohdata aikana pysyvän infektion, käytettyjen eläinten Tässä tutkimuksessa pidettiin säännöllisin ruokinta aikataulu ja uhrattiin aamulla ennen saavat normaalia päivittäistä ruokaa siirtolapuutarha. Suljettu seerumilääkepullot sisältävät hiiret mahat inkuboitiin jäillä, jotta asetonia, joka liittyy mahan kudoksen tasapainottua kaasufaasin pulloissa, jonka jälkeen kaasufaasi analysoitiin kaasukromatografialla. Tämä menettely tehtiin aluksi uhraamalla eläimiä ja poistamalla niiden vatsat. Samanlaisia ​​tuloksia on kuitenkin saatu poistamalla vatsat elävistä eläimistä, jotka oli nukutettu. Asetonin määrä liittyy mahan kudoksen kunkin yksittäisen hiiren vaihdella välillä ~ 10-110 μmols asetonia per gramma märkäpainoa kudosta (Fig. 4), jossa on suurin arvo (6/7), jotka kuuluvat alueella 10 ja 35 μmols asetonia per gramma märkäpainoa kudosta. Nämä tiedot viittaavat siihen, että millimolaarista määriä asetonia liittyy hiiren mahalaukun kudosta ja voi olla käytettävissä mahdollisena hiilen tai energian lähteenä H. pylori
. Tämä taso asetonia, joka liittyy hiiren mahalaukun kudosta oli suurempi kuin mitä odotimme, koska seerumin ketoaineiden vaihtelevat ihmisillä ja muilla nisäkkäillä vaihtelee yleensä välillä < 0,5 mM muutaman millimoolia [23]. Asetonia tuotetaan nisäkkäissä spontaani dekarboksylaatio asetoasetaattia ja tämä dekarboksylaatio on parannettu alhaisessa pH: ssa, ja niin asetonia voi kerääntyä mahassa, koska mahan happamuutta. Kuva 4 Asetoni tasoihin, jotka liittyvät hiiren mahan kudosta. Vatsa asetonia tasot määritettiin kolmelle hiirillä uhraamalla eläimiä ja heti poistamalla niiden vatsat (post mortem), ja neljä hiirillä, jotka nukutettiin, jonka jälkeen niiden vatsat poistettiin (pre-mortem). Irrotettiin hiiren mahat pantiin välittömästi suljetuissa ampulleissa, jotka laitettiin sitten jäihin vähintään 30 minuutin ajan, jotta asetonia liittyy mahalaukun kudoksen tasapainottua kaasufaasissa. Asetoni tasot kaasufaasien ampullien mitattiin kaasukromatografisesti ja arvioitu standardikäyristä generoidaan kullekin pulloon. Kukin arvo edustaa keskimäärin vähintään kolme mittausta ja virhe palkit osoittavat keskihajonta jokaisesta näytteestä.
Keskustelu
Tulosten mukaan helikobakteerin
hallussaan toiminnallinen asetonia boksylaasia kuin oletettu aikaisemmin Ensign ja co -workers [15]. H. pylori acxABC
operoni on lähellä scoAB
ja fadB
geenejä, jotka koodaavat entsyymejä, SCOT ja asetoasetyyli-CoA-tiolaasi. Siten tämä geeni klusterin koodaa joukko entsyymejä, jotka pystyvät metaboloiden asetonia asetyyli-CoA. Asetyyli-CoA tuotettu asetonia ja asetoasetaattia saataneen eväitä TCA sykli antaa energiaa helikobakteeri
. Havaittuna Pflock ja co-työntekijöille acxABC
operonin ja muita geenejä, jotka liittyvät asetonilla metabolia ovat läsnä H. acinonychis
[24]. Nämä geenit ovat poissa, mutta muiden läheistä sukua ε-proteobacteria joiden genomit on sekvensoitu tähän mennessä, joka sisältää Helicobacter hepaticus
, Campylobacter jejuni
, Thiomicrospira denitrificans
, ja Wolinella succinogenes
. Hankinta ja ylläpito asetonia aineenvaihdunnan geeniklusterin H. pylori
ja H. acinonychis
voi liittyä siihen, että toisin kuin nämä muut asiaan liittyvät ε-proteobacteria, ne asuttaa mahalaukun limakalvon. Klusterointi näiden geenien ja puuttuminen ortologiset geenien muissa läheisesti liittyviä ε-proteobacteria voisi osoittaa mahdollinen hankinta näistä geeneistä helikobakteerin
ja H. acinonychus
kautta sivusuunnassa geenisiirron. G + C-sisältö tämän klusterin asetonia aineenvaihdunnan geenien Helikobakteeri
on hieman korkeampi kuin keskimäärin koko genomin, mutta tämä näyttää johtuen tuotteita näiden geenien on hyvin paljon glysiini- (~ 10% vertailla 6% genomin keskiarvo). Lisäksi koostumusta koskevien ominaisuuksien näistä geeneistä, kuten dinukleotidi suhteellinen runsaus ja Kodonivääristymä, eivät osoita viime sivusuunnassa siirtäminen tällä alueella [25] (J. Mrázek, henkilökohtainen tiedonanto).
Jungblut ja työtoverit kertoi, että H . pylori
AcxC (HP0698) reagoi ristiin vasta-aineet adenokarsinooma potilaalle, joka osoittaa, että H. pylori acxABC
operoni ilmentyy isännän [26]. Lisäksi osoitamme tässä, että helikobakteeri
voi kohdata merkittäviä määriä asetonia hiiren vatsassa ja niin tämä yhdiste voi olla tärkeä hengitysteiden elektronidonorin varten bakteeri isännässä. Sopusoinnussa tämän hypoteesin H. pylori acxB
mutantti väheni merkittävästi sen kykyä kolonisoida hiiren vatsan jota päätellä tuloksia kyvyttömyys mutantin käyttää asetonia energialähteenä. Kyvyttömyys asetonia stimuloida kasvua helikobakteeri
SS1 liuosviljelmässä voi johtua epäonnistumisesta kasvualustan käytetään matkimaan kasvuolosuhteista kohtaamia bakteerin kun asettumaan mahalaukun limakalvon. Vaihtoehtoinen hypoteesi asuttaminen viasta acxB
mutantti on, että asetoni boksylaasia tarvitaan vieroitus asetonia. Kuitenkin meidän noudattamatta jättämisestä estoa kasvattanut acxB
mutantti lisäämällä asetonia kasvualustaan ​​puolla tätä jälkimmäistä hypoteesia. Toinen mahdollisuus on, että tuotteet acxABC
operonin katalysoivat tuntematon reaktion, joka on tärkeä eloonjäämiseen tai solun kasvua H. pylori
mahalaukun limakalvon. Lisäksi biokemiallisten luonnehdinta tuotteiden H. pylori acxABC
operonin pitäisi auttaa erottamaan nämä possibililties.
Äskettäin transcriptome analyysi H. pylori
26695 käyttämällä koko genomin mikrosirun ehdotti, että vastaus säädin HP1021 voimakkaasti aktivoitua transkriptiota acxABC
ja scoAB
, ja aktivoitu transkription Fada
ja hp0693 vähäisemmässä määrin [24]. Kirjoittajat Tämän tutkimus osoitti, että HP1021 sitoo promoottorisäätelyelementtiin alueella acxABC
, mikä viittaa siihen, että tämä vastaus säädin suoraan välittää sen vaikutuksista transkriptioon acxABC
ja että geenit sisällä asetonia aineenvaihduntaa klusterin ovat osa regulonin hallinnassa by HP1021. Pflock ja työtovereiden tunnistettu 79 geeniä helikobakteeri
26695, jonka ekspressio muutettiin vuonna HP1021 mutantti - 51 geenit transkriptoidaan alemmilla tasoilla mutantti taas 28-geenit ilmentyvät korkeammilla tasoilla [24]. HP1021 poikkeaa useimmista muista vastaus sääntelyviranomaiset että siitä puuttuu hyvin säilyneitä fosfaatti-hyväksymällä aspartaattitähteen, ja sukulais histidiini kinaasi HP1021 ei ole tunnistettu. On ristiriitaisia ​​raportteja transkription HP1021 vastauksena happamassa pH: ssa, sekä transkription H. pylori acxABC
vastauksena matalampi pH [27-29]. Nämä erot voivat johtua siitä, että tapa, jolla bakteerit viljeltiin. Vaikka nämä raportit ristiriita suhteessa transkription HP1021 vastauksena happamassa, tuloksia sekä tutkimukset osoittavat, että olosuhteet, jotka johtavat alas-säätely HP1021 johtaa lisääntyneen ilmentymisen acxABC
. Tämä näyttää counterintuitive annetaan näennäinen rooli HP1021 aktivoinnissa transkription acxABC
.
Ainoat muut bakteerin, jolle sääntelyn acxABC
operoni on tarkasteltu on X. autotrophicus
. Transkriptionaalisen säätelyn acxABC
X. autotrophicus
eroaa H. pylori
. X. autotrophicus
puuttuu homologia HP1021, vaan säätelee transkriptiota acxABC
kautta σ 54 (RpoN) ja σ 54-riippuvainen aktivaattori AcxR [15]. Vaikka helikobakteeri
hallussaan σ 54 acxABC
operonin ei ole osa helikobakteerin
RpoN regulonissa [30].
Huolimatta havainto, että häiriöt acxB
vaikuttaa haitallisesti kolonisaatio hiirten helikobakteerin
SS1, viimeaikainen koko genomin microarray tutkimuksia kuusikuudettakymmentä edustava kokonaismyynti kannat helikobakteeri
ja neljä H. acinonychis
kantoihin että acxABC
geenit eivät ole läsnä kaikissa helikobakteeri
kantoja [31]. Olisi mielenkiintoista selvittää, onko isolaattien puuttuu acxABC
ovat vähemmän kilpailukykyisiä kolonisoitumaan luonnollisessa isännät kuin kannat, jotka omistavat nämä geenit. Vaihtoehtoisesti kannat puuttuu acxABC
voi olla muutoksia, jotka kompensoivat puuttuminen asetonia boksylaasia toimintaa. Tulokset microarray tutkimuksia Gressmann ja kollegat osoittivat, että scoAB
, Fada
, HP0693 ja HP0694 oli läsnä kaikissa helikobakteeri
ja H. acinonychis
kantoja tutkitaan [31]. Näin ollen selektiivinen paine säilyttää kyky käyttää etyyliasetoasetaatti mahdollisena elektronin luovuttaja H. pylori
ja H. acinonychis
näyttää olevan suurempi kuin asetonin aineenvaihduntaa.
Päätelmä
H . pylori acxABC
operonin todennäköisesti koodaa asetonia karboksylaasi, että katalysoi asetonia asetoasetaatiksi ja läheisesti liittyvät geenit, joiden tuotteet ennustetaan katalysoimaan peräkkäinen muuttuminen asetoasetaatin asetyyli-CoA. Tarkastus genomien muiden läheistä sukua ε-proteobacteria viittaa siihen, että geenit osallistuvat asetonia aineenvaihduntaan ovat läsnä vain bakteerien tässä alajaksoon että asuttaa mahalaukun limakalvon. AcxABC
operoni ollut välttämätöntä hiiren kolonisaatio helikobakteerin
SS1, mutta se ei näytä parantaa kolonisaatio. Edelleen luonnehdinta oletetun H. pylori
asetonia boksylaasia ja tuotteet muiden geenien sisällä asetonia aineenvaihdunnan geeni klusterin olisi annettava tietoa siitä, miten ketoaineita isännältä edistää metabolisen talouksien helikobakteeri
ja H . acinonychis
ja miten nämä yhdisteet vaikuttavat kykyyn näiden bakteerien asuttaa niiden isännät. Tool menetelmät
bakteerikannat ja median
Plasmidi rakentaminen ja kloonaus tehtiin E. coli
-kanta DH5a, joka viljeltiin Luria-Bertani-väliaineessa 37 ° C: ssa. Helikobakteeri
-kanta 26695 käytettiin mallina polymeraasiketjureaktio (PCR). H. pylori
SS1 käytettiin villityypin kannan kaikissa kokeissa ja viljeltiin joko veriagarissa tai trypsiinisoija-soija-agaria, jota oli täydennetty 5% hevosen seerumia (TSA-seerumia), 37 ° C: ssa ilmakehässä 4% O 2, 5% CO 2 ja 91% N 2. Kun viljellään nestemäisessä väliaineessa, H. pylori
kasvatettiin Mueller-Hinton-liemessä, johon on 5% hevosen seerumia ja 30 ug /ml basitrasiinia tai määritelty kasvualusta kuvanneet Bruggrabber ja työtoverit [22]. Cultures (10-15 ml kasvatettu väliaineessa) kasvatettiin 150 ml: n seerumilääkepulloja sinetöity 20 mm Teflon /silikoni levyjä ja alumiinikorkki sekä atmosfäärissä 4% O 2, 5% CO 2, 10 % H 2, 81% N 2. Ellei toisin mainita, kun antibiootteja sisällytettiin keskipitkällä ne lisättiin seuraavat pitoisuudet: 100 ug /ml ampisilliinia, 30 ug /ml kloramfenikolia, 200 ug /ml basitrasiinia 10 ug /ml vankomysiiniä, ja 10 ug /ml amfoterisiini B:
inaktivointi acxB
(HP0696) vuonna helikobakteeri
SS1
2,3 kb DNA-fragmentti, joka suorittaa acxB
monistettiin PCR helikobakteeri
rasittaa 22695 ja kloonattu pGEM-T (Promega). Kissa
kasetti otettiin tämän plasmidin Eco
47III päällä sijaitsee noin puolivälissä kloonatun acxB
. Saatu plasmidi käytettiin itsemurhavektorin inaktivoimiseksi kromosomaalisen kopion acxB
H. pylori
SS1. Itsemurhavektori tuotiin helikobakteeri
kannat ATCC 43504 ja SS1, kanta, joka voi asuttaa hiirillä. Koska toistuva kulku helikobakteeri
rasitusta SS1 keskipitkän on raportoitu johtaa menetykseen infektiivisyyttä hiirissä acxB
mutantti konstruoitiin tuoreen eristää kannan SS1 toipunut tartunnan hiiren. Määrä kohtia acxB
mutanttihahmosta SS1 kanta oli rajallinen ja kirjataan, ja mutantti säilytettiin jäädytettynä -80 ° C: ssa. Vanhempien SS1 kanta säilyi ja varastoitu jäädytetty samalla tavalla. Olemme vahvistaneet PCR, että kromosomaalisen kopion acxB
hajotettiin alleelinen vaihto plasmidissa oleva kopio geenistä käyttämällä erilaisia ​​alukkeita, jotka reunustivat paikalle häiriöitä.
Kasvukäyrät helikobakteeri
kannat
H. pylori
soluja TSA-seerumia levyt, jotka kannat oli siveltiin edellisenä päivänä suspendoitiin fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS), ja siirrostetaan nestemäiseen väliaineeseen on OD 600 0,03. Milloin on osoitettu, asetonia lisättiin aseptisesti alustaan. Näytteitä otettiin eri aikoina ja solujen tiheydet mitattiin valon sironnan OD 600. Vaihtoehtoisesti elävien solujen lukumäärät selvitettiin seuraavia sarjalaimennokselle näytteiden ja maljaamalla TSA-seerumi. Seuraavat 4-5 päivää inkuboinnin, numerot pesäkkeitä muodostavien yksiköiden (cfu) määritettiin levyjen.
Mouse kolonisaatiota
Mouse kolonisaation kokeet suoritettiin oleellisesti, kuten aiemmin on kuvattu [32]. Nämä menettelyt noudattaneet asiaa liittovaltion suuntaviivoja ja institutionaalisten politiikan hoidosta ja käsittelystä koe-eläimiä. Lyhyesti, H. pylori
solut otettiin talteen 48 tunnin kuluttua kasvun veriagarmaljoilla ja suspendoitiin PBS: ään OD 600 1,7. Headspace putken johdettiin argonia minimoimiseksi happialtistuksen.

• Healing potentiaali Picrorhiza kurroa (Scrofulariaceae) juurakot vastaan ​​indometasiinia aiheuttamaa mahahaavan: mekanistinen etsintä.
• Annoksesta riippuvaa inhibitiota mahan vahinkoa vedyllä emäksinen elektrolysoidaan juomavesi