Ľudský patogén žalúdka Helicobacter pylori má potenciálny karboxylázy acetónu, ktorá zlepšuje jeho schopnosť kolonizovať myšou

Ľudský patogén žalúdka Helicobacter pylori
má potenciálny karboxylázy acetónu, ktorá zlepšuje jeho schopnosť kolonizovať myšou
abstraktné
pozadia
Helicobacter pylori kolonizuje
ľudský žalúdok a je pôvodcom vredovej choroby , Všetky tri H. pylori
kmene, ktoré boli radené tak, aby dáta obsahujú potenciálne operon, ktorého výrobky podiel homológie s podjednotky karboxylázy acetónu (kódovaný acxABC
) z Xanthobacter autotrophicus
kmeň py2 a Rhodobacter capsulatus
kmeň B10. Acetón karboxylázy katalyzuje konverziu acetónu acetoacetátu. Gény proti prúdu od domnelých acxABC
operon kódujú enzýmy, ktoré premieňajú acetoacetát k acetoacetyl-CoA, ktorý sa metabolizuje ďalej na generovanie dve molekuly acetyl-CoA.
Výsledky
na určenie, či H. pylori acxABC
operon hrá úlohu v hostiteľskej kolonizáciu na acxB
homolog v kmeni myší prispôsobenej H. pylori
SS1 sa vypína na chloramfenikol rezistencie (cat
) kazety. V myšiach štúdiách kolonizácie počty H. pylori
získané z myší naočkovaných acxB: cat
mutant boli všeobecne jeden až dva rády nižšie, ako sú získané z myší naočkovaných rodičovského kmeňa. Štatistická analýza dát pomocou Wilcoxin rank test je uvedené, že rozdiely v počte H. pylori
izolované z myší inokulovaných dvoma kmene boli významné na hladine spoľahlivosti 99%. Hladiny acetónu spojené s žalúdočnej tkaniva odobraté z neinfikovaných myší boli merané a bolo zistené, že v rozmedzí od 10-110 μmols na gram vlhkej hmotnosti tkaniva
Záver
kolonizácia defekt acxB: kat.
Mutant naznačuje úlohu pre The acxABC
operonu prežitie baktérie v žalúdku. Produkty z H. pylori acxABC
operonu môže fungovať predovšetkým vo využití acetón alebo môže katalyzovať reakciu súvisiace, ktoré sú dôležité pre prežitie alebo rast v hostiteľovi. H. pylori
narazí významné hladiny acetónu v žalúdku, ktoré mohol využiť ako potenciálny donor elektrónov pre mikroaerobní dýchanie.
Pozadie
Helicobacter pylori
je mikroaerofilní, gramnegatívne baktérie, ktorá je významným patogénom človeka žalúdočnej sliznice [1, 2]. Kolonizácia žalúdočnej sliznice H. pylori
vedie k chronickému zápalu, ktoré môže viesť rôznych ochorení, vrátane chronickej gastritídy, žalúdočného vredu, karcinómu žalúdka a slizničnej lymfóm súvisiace s [3-5]. V neprítomnosti antimikrobiálne terapii, hostiteľ je pravdepodobné, že utrpia celoživotné H. pylori
infekciu žalúdočnej sliznice.
Schopnosť H. pylori
pretrvávať v ľudskom žalúdku po dlhšiu dobu je zrejmé, že to je dobre prispôsobený na získanie živiny, ktoré potrebuje k rastu v tomto jedinečnom výklenku. Napríklad, slizničnej vrstva myši žalúdka obsahuje významné množstvo molekulárneho vodíka (17 až 93 um) s pôvodom v metabolickej aktivity mikrobiálnej flóry v hrubom čreve [6]. H. pylori
je schopné využívať tento molekulárnej vodík ako donor elektrónov pre mikroaerobní dýchanie a funkčné hydrogenase pre úspešnú kolonizáciu myší je vyžadované H. pylori
[6, 7]. Na rozdiel od mnohých vodíka baktérií oxidujúcich však H. pylori
nie je schopný autotrofné CO 2 fixácie.
Niekoľko štúdií skúmalo schopnosť H. pylori
využívať rôzne zdroje uhlíka. H. pylori
má obmedzenú schopnosť získavať a metabolizovať cukry, pozorovanie, ktorý je v súlade s analýzou genomových sekvenciou baktérie H. pylori kmeňov
22695 a J99 [8]. Glukóza je jediný sacharid, že H. pylori
je schopné využívať, ktoré robí prostredníctvom Entner-Doudoroff dráhy [9, 10]. Aminokyseliny tiež slúžiť ako zdroj uhlíka pre H. pylori stroje a sú využívané prednostne H. pylori
v rastovom médiu obsahujúcom zmes glukózy a aminokyselín [9, 11]. Pyruvát, čo je kľúčový medziprodukt v centre metabolizmu, sa zdá byť vytvorené predovšetkým z laktátu, alanín a serín, skôr než glukózy v H. pylori
[12, 13]. Pyruvát je premenený na acetyl-CoA od Pyruvate: flavodoxin oxidoreduktázy v H. pylori
, ktorý potom môže podať do trikarboxylová kyseliny (TCA) cyklus [14]. Okrem toho, alanín, laktát, acetát, Formia a sukcinát môžu byť produkované H. pylori
bunky boli inkubované aeróbne [12]. Produkcia acetátu a mravčanu ako produktov látkovej výmeny naznačuje existenciu zmiešané kyseliny fermentačnej cesty v H. pylori
, keď kyslík je nevyhnutný pre rast baktérie [12].
Analýza genomových sekvencií H . pylori
kmeňov 26695, J99 a HPAG1 odhalila potenciálne operon z troch génov (označované ako HP0695, HP0696 a HP0697 v H. pylori
26695) výrobky pochádzajúce z ktorých zdieľanú 50-63% identitu aminokyselín s beta , α, a gama podjednotky karboxylázy acetón z Xanthobacter autotrophicus
kmeňa py2 a Rhodobacter capsulatus
kmeňa B10 [15]. Homológy karboxylázy acetónu sa nachádzajú v počte baktérií, ale X. autotrophicus stroje a R. capsulatus
enzýmy sú najlepšie charakterizované. Acetón karboxylázy katalyzuje ATP-dependentný karboxylácia acetónu sa acetoacetátu a je nutná pre rast X. autotrophicus stroje a R. capsulatus
s acetónom ako jediný zdroj uhlíka a donor elektrónov pre dýchanie [15-17]. X. autotrophicus
acetón karboxylázy má vysokú afinitu k acetónu (Km = 8 um), ale rýchlosť obratu enzýmu je veľmi pomalé (~ 45 za min) [15]. Pre kompenzáciu nízkej miery obratu karboxylázy acetón, X. autotrophicus
produkuje veľké množstvo enzýmu (17-25% z celkového rozpustného proteínu), keď rastú na acetónu [15]
génov sa nachádza v blízkosti H. pylori
HP0695-HP0696, HP0697 operon kódujú enzýmy preukázané, že prevod acetoacetát na acetoacetyl-CoA, ktorý je ďalej metabolizuje na acetyl-CoA [8, 18]. Acetón, acetoacetát a 3-β-hydroxybutyrát sú ketolátky produkované cicavcov perivenóznej hepatocyty pri rozklade mastných kyselín, a používajú sa ako donory elektrónov pre dýchanie, keď sacharidy nie sú ľahko dostupné [19]. Rovnako ako ketolátky sú dôležitým zdrojom energie pre človeka, keď sacharidy nie sú k dispozícii, tieto zlúčeniny môžu slúžiť ako respiračné donormi elektrónov pre H. pylori
kolonizovať žalúdočnú sliznicu. Ak chcete zistiť, či HP0695, HP0696, HP0697 operon hrá úlohu v hostiteľskom kolonizáciu sme vypína HP0696 v H. pylori
kmeňa SS1. HP0696 mutant bola ohrozená jeho schopnosť kolonizovať myšou čo naznačuje, že karboxylácia acetón alebo súvisiace enzymatickú aktivitu katalyzovanej produkty HP0695, HP0696, HP0697 operonu je významným faktorom prispievajúcim k hostiteľovi kolonizáciu.
Výsledky
H. pylori
obsahuje sadu génov predpokladaných byť zapojený do metabolizmu acetónu
troch H. pylori
kmeňov, ktorých genóm bol sekvenovania obsahujú zhluk ôsmich konzervovaných génov v rámci kb sekvencie DNA ~ 10, z ktorých šesť kódujú enzýmy, predpokladá sa, metabolizovať acetón a acetoacetát na acetyl-CoA (obr. 1 a 2). Helicobacter acinonychis
príbuzných druhov, ktorý infikuje veľkých mačkovitých šeliem, má tiež tento zhluk génov. Ako je uvedené vyššie, tri z týchto génov zdieľajú homológie s acxABC
, aj keď prvé dva gény v operonu sú označené ako gény, ktoré kódujú využitie hydantoín proteín A a methylhydantoinase, v tomto poradí, v anotovaných H. pylori
genómov. Hydantoinases katalyzovať hydrolýzu 5-tich člennej prostredníctvom hydrolýzy vnútorného imidové väzby a často majú pomerne širokú substrátovú špecifickosť. Proteínov v databáze, ktorej biochemická funkcia boli preukázané, analýza BLAST ukázala, že predpovedanej produkty H. pylori
génov najviac zhodujú Xanthobacter
sp. Py2 acxABC
operonu (59 až 68% identitu aminokyselín v priebehu celej dĺžky troch predpokladaných podjednotky). Za posledný sekvenované H. pylori stroje a H. acinonychis
genómov posledný gén operonu je komentovaný ako acxC
[20, 21]. To znamená, že H. pylori
HP0695-HP0696, HP0697 operon pravdepodobne kóduje karboxylázy acetón, skôr než hydantoinase, a my teda vzťahujú k tomuto operonu ako acxABC
. Obrázok 1 Organizácia génov podieľajúcich sa na metabolizme acetónu v H. pylori a H. acinonychus kmeňov. Génové označenie uvedené pod každým šípkou (nie je v mierke). Otvorených čítacích rámcov, ktoré neboli uvedené označenie génu v anotovaných sekvencií genómu sú označené buď označením HP (H. pylori
26695), označenie, JHP (u H. pylori
J99), alebo iba open číslo čítací rámec (pre H. pylori
HPAG1 a A. acinonychis
kmeň Sheeby). Orthologní gény v štyroch kmene majú rovnakú farbu. Gény jhp0628 v H. pylori
J99 a 0671 v H. pylori
HPAG1 zodpovedajú fúziu hp0688 a hp0689 od H. pylori
26695. H. pylori
J99 a HPAG1 majú dva gény v tejto oblasti, jhp0629 (HPAG1_0672) a jhp0630 (HPAG1_0672), ktoré kódujú typu II DNA metyltransferázy a reštrikčné enzým typu II, v uvedenom poradí, a nie sú nájdené v H. pylori
26695. Funkcia produktov génov v klastri metabolizmus acetón sú popísané v texte. Navrhované funkcie produktov okolitých génov sú: fecA
, železo (III) dicitrate transportný proteín; feoB
, železo (II) transportný proteín; dgkA
, používanie diacyglycerolového kináza; Gyra
, podjednotky A DNA gyrázy; dcuA
, anaeróbne C4-dikarboxylát transportér; a ansB
, asparagináza II.
Obrázok 2 Navrhol dráhu pre využitie v acetónu H. pylori. The navrhuje cesta pre konverziu acetónu na acetyl-CoA na H. pylori a H.
acinonychis
je znázornené na obrázku. sú uvedené reakcie a gény kódujúce enzýmy zodpovedné za katalyzovať každú reakciu
Ďalšie dva gény v rámci klastra génov, SCoA
(HP0691) a SCOBY
(HP0692), kódovanie sukcinylkoenzym a :. acetoacetát-CoA-transferázy ( SCOT), ktorý katalyzuje premenu acetoacetátu a sukcinyl-CoA na acetoacetyl-CoA a sukcinát [18]. Acetoacetyl-CoA produkovaný SCOT sa ďalej metabolizuje acetoacetyl-CoA thiolázy, ktorý je kódovaný fada
(HP0690; gén je poznámka, THL
v H. pylori
J99 a atoB
v H. pylori
HPAG1 a H. acinonychis
), pre generovanie dve molekuly acetyl-CoA z acetoacetyl-CoA a navyše koenzýmu a (CoA) [8]. Dve zvyšné gény vnútri tejto skupiny, HP0693 a HP0694, sa predpokladá, že kódujú permeázu mastné kyseliny s krátkym reťazcom a vonkajšie membránový proteín, v danom poradí, a môžu pracovať pri preprave kyseliny acetoctové.
Osem génov v rámci tohto domnelého klastra metabolizmus acetónu sú usporiadané na rovnakej vzájomne voči sebe v troch kmeňov H. pylori
, ale klastra je orientovaná v jednom z dvoch možných smerov (obr. 1), čo ukazuje na výskyt DNA inverzie v tejto oblasti v priebehu vývoja H. pylori
. Zoradenie sekvencií DNA z troch kmeňov zúžil miesto inverzie na ~ 40 bp po smere od acxC
homológov a ~ 160 bp v protismere od štart kodónu pre fada
(dáta nie sú uvedené). Žiadne veľké priame či obrátené repetície sa nachádzajú v blízkosti týchto regiónoch, ktoré by mohli byť zapojené do inverzie, a tak nemôžeme špekulovať o mechanizme tohto inverzie. Pre H. pylori kmeňov
J99 a HPAG1, ale nie 26695, existuje predpokladaná typu II DNA metyltransferázy (jhp0629 a HPAG1_0673) a typu II reštrikčné enzým (jhp0630 a HPAG1_0672) v blízkosti predpokladaného zhluku génov metabolizmu acetónu.
H. acinonychis
má domnelú zhluk génov metabolizmu acetón a gény vnútri klastra sú v rovnakej orientácii ako tie v H. pylori
J99. V H. acinonychis
tieto gény sú priľahlé k dgkA stroje a Gyra
tak, ako sú v H. pylori
, ale sú lemované na opačnom konci od dcuA stroje a ansB
. FecA stroje a feoB
gény, ktoré sú umiestnené v blízkosti génového klastra metabolizmus acetón v kmeňoch H. pylori
sú ~ 69 kb z tohto zhluku génov v H. acinonychis
. To znamená, že relatívna usporiadanie génov v klastri metabolizmus acetón zostalo pozoruhodne konzervovať počas evolúcie H. pylori a H.
acinonychis
napriek skutočnosti, že najbližšia oblasť v genómoch týchto dvoch druhov prešlo . rozsiahle prestavby
H. pylori acxB: cat
mutant je deficitný v jeho schopnosti kolonizovať myšou
acxB
gén H. pylori
SS1, čo je kmeň myší upravený , bol narušený s rezistencie voči chloramfenikolu (cat
) kazety. Kultúry divokého typu H. pylori
SS1 a acxB: cat
mutant boli pestované v Mueller-Hinton bujónu s prídavkom konského séra, alebo skôr popísaného definovaného média [22]. Rôzne množstvo acetónu v rozmedzí od 1,3 mm do 26 mm boli zahrnuté do rastového média pre určenie, či acetón ovplyvnený rast oboch kmeňov. Rast buniek bol monitorovaný pomocou životaschopných buniek sa počíta, ako aj optická hustota kultúry v rôznych časoch. Vrátane acetónu v každom rastovom médiu nemá žiadny vplyv na rýchlosť rastu alebo výťažku konečného buniek H. pylori
SS1 alebo acxB: cat
mutant (údaje nie sú uvedené). Zlyhanie acetónu k stimulácii rastu H. pylori
SS1 za testovaných podmienok nie je neočakávané, pretože rast médiá pre H. pylori
je veľmi bohaté na živiny. Tieto zistenia tiež naznačujú, že nie je požadované pre detoxikáciu acetón acxABC
schopnosti acxB: kat.
Mutantné kolonizovať myší bola porovnávaná s rodičovského H. pylori
SS1 kmeňa v dvoch samostatné procesy. V každej štúdii jedenásť myši boli Inokulované kmeňom divokého typu a jedenásť boli vrúbľovať s acxB: mačka
mutant. Tri týždne po inokulácii myší s kmeňov H. pylori
, boli myši usmrtené a počty H. pylori
v žalúdkoch zvierat boli stanovené. U myší, ktoré boli naočkovaného kmeňom divokého typu, väčšina zvierat (19/22), zvieratá mali H. pylori
počty, ktoré boli výrazne vyššie ako detekčný limit, ktorý bol 500 cfu na gram žalúdka (Obr. 3). Počet H. pylori
vo vzorkách, ktoré boli nad detekčným limitom pohybovali v rozmedzí od 10 4-10 6 CFU na gram žalúdka. Väčšina myší naočkovaných acxB: mačky
mutant mal tiež merateľné hladiny H. pylori
(15/22) zvieratá, ale množstvo H. pylori
spojené s týchto myší boli všeobecne jeden na o dva rády nižšia ako u myší, ktoré boli vrúbľovať s kmeňom divokého typu. Štatistická analýza dát pomocou Wilcoxin rank test overené, že rozdiely v počte H. pylori
izolované z myší inokulovaných dvoma kmene boli významné na hladine spoľahlivosti 99%, čo naznačuje, že karboxylázy acetón zvyšuje schopnosť H. pylori
SS1 kolonizovať myši žalúdok. Pretože sme neboli schopní klonovať acxABC
operon sme nemohli overiť doplnením, že v acxB
mutácie bol zodpovedný za chyby v kolonizácii. Je však nepravdepodobné, že kolonizácia fenotyp v acxB
zmutovaného bol kvôli polárne účinky, pretože nie sú k dispozícii žiadne ďalšie gény v operonu acxABC
v žiadnej z troch kmeňov H. pylori
, ktorých genóm bol radené tak, aby dáta (obr. 1). Okrem toho je vada kolonizácia nie je pravdepodobné, že v dôsledku útlmu alebo sekundárne mutáciu, pretože sme zostrojil acxB
mutanta v čerstvom izoláte kmeňa SS1 získaného z infikovanej myši. Obrázok 3 Mouse kolonizácie testu H. pylori SS1 a isogenní acxB: cat mutovaný kmeň. Údaje sú prezentované ako bodovom diagrame kolónie tvoriacich jednotiek na gram žalúdka, ako je stanovené podľa počtu dosiek. Každý bod reprezentuje počet cfu z jedného myší, vyjadrená ako hodnota log 10 (CFU /g žalúdka) v osi Y. Základné línie [log10 (KTJ /g žalúdok) = 2,7] je detekčný limit testu, ktorý predstavuje počet nižší ako 500 KTJ /g žalúdka.
Hladiny acetónu v myšiam žalúdku
Vzhľadom k tomu, dáta z myšou testy kolonizácia naznačujú, že schopnosť využívať acetónu H. pylori
bolo dôležité pre účinnú kolonizáciu hostiteľa, sme chceli zistiť, či H. pylori
narazil na významné množstvo acetónu v myšiam žalúdku. Hoci sa úrovne acetón boli hlásené z rôznych telesných tekutinách, sme boli vedomí akýchkoľvek správ o úrovni acetónu spojených s žalúdočnej šťavy alebo tkanivá. Preto sme merali hladiny acetónu spojené s myšou žalúdočné tkaniva po rýchle odstránenie žalúdok myšou a okamžite umiestnením žalúdky v uzavretých fľaštičkách sére. Vzhľadom k tomu, sme chceli odhadnúť množstvo acetónu, že H. pylori
mohlo dôjsť pri pretrvávajúcej infekcie, zvieratá použitá pre túto štúdiu boli udržiavané v pravidelných kŕmení rozvrhu a boli usmrtení ráno pred obdržaním ich normálne denný prídel potravín. Uzavreté fľaštičky séra obsahujúce myšky žalúdky boli inkubované na ľade, aby sa acetón spojené s žalúdočnej tkaniva do rovnováhy s plynovou fázou v fľaštičkách, a po tejto dobe boli vzorky v plynnej fáze analyzovaný pomocou plynovej chromatografie. Tento postup bol vykonaný na začiatku obetovaním zvierat a odstránenie ich žalúdky. Podobné výsledky však boli získané odstránením žalúdky zo živých zvierat, ktoré boli v narkóze. Množstvo acetónu spojené s žalúdočnej tkaniva pre každú jednotlivú myš pohybovala v rozmedzí od -10 do 110 μmols acetónu na gram mokrej hmotnosti tkaniva (obr. 4), s väčšinou hodnôt (6/7), ktoré spadajú do rozmedzia od 10 a 35 μmols acetón na gram mokrej hmotnosti tkaniva. Tieto údaje naznačujú, že milimolární množstvo acetónu sú spojené s myšou žalúdočné tkaniva a môže byť k dispozícii ako potenciálny uhlíka alebo zdroj energie pre H. pylori
. Táto úroveň acetónu spojené s myšou žalúdočnej tkanive bola vyššia, než to, čo sme očakávať, pretože hladiny sérových ketolátok sa líši u ľudí a iných cicavcov všeobecne pohybovať v rozmedzí od < 0,5 mm do niekoľkých mM [23]. Acetón sa produkovaný v tele cicavcov spontánnym dekarboxyláciou acetoacetátu a to dekarboxylácie sa zvyšuje pri nízkych hodnotách pH, ​​a tak acetón sa môžu hromadiť v žalúdku v dôsledku kyslosti žalúdka. Obrázok 4 úrovne Acetón spojená s myšou žalúdočné tkaniva. Hladiny žalúdočné acetón sa stanovili po dobu troch myší po obetovanie zvierat a okamžite odstraňovať ich žalúdky (post-mortem) a pre štyri myší, ktoré boli v narkóze, po ktorej ich žalúdky boli odstránené (pre-mortem). Vyrezané žalúdky myší boli okamžite umiestnené do uzavretých fľaštičkách, ktoré boli potom umiestnené na ľade po dobu aspoň 30 minút, aby acetón spojené s žalúdočnej tkaniva do rovnováhy s plynovou fázou. hladiny acetónu v plynnými fázami fľaštičiek boli merané pomocou plynovej chromatografie a odhadnúť zo štandardných kriviek vytvorených na každej fľaši. Každá hodnota predstavuje priemer z minimálne troch meraní a chybové úsečky ukazujú štandardnú odchýlku pre každú vzorku.
Diskusia
sme predložiť dôkazy, že H. pylori
majú funkčný karboxylázy acetónu, ako predpokladal predtým podľa Ensign a spol -workers [15]. H. pylori acxABC
operon je blízko scoAB stroje a fadB
gény, ktoré kódujú enzýmy Škót a acetoacetyl-CoA thiolázy. Tak, tento gén kóduje zhluk sadu enzýmov schopných metabolizovať acetón na acetyl-CoA. Acetyl-CoA vyrobené z acetónu a acetoacetátu by mohli byť zaradené do TCA cyklu na zabezpečenie energie pre H. pylori
. Ako uviedla Pflock a spolupracovníkov zamestnanca, acxABC
operon a iné gény spojené s metabolizmom acetónu sú prítomné v H. acinonychis
[24]. Tieto gény nie sú prítomné, avšak v ďalších úzko súvisiacich s-Proteobacteria, ktorého genóm boli doteraz sekvenovania, ktorého súčasťou je Helicobacter hepaticus
, Campylobacter jejuni
Thiomicrospira denitrificans stroje a Wolinella succinogenes
. Obstaranie a údržbu acetónu metabolizmu génového klastra v H. pylori a H.
acinonychis
môže súvisieť s tým, že, na rozdiel od týchto ďalších súvisiacich s-Proteobacteria, že kolonizovať žalúdočnú sliznicu. Zhlukovaniu týchto génov a neprítomnosť orthologní gény v iných úzko súvisiace s-Proteobacteria môže znamenať možné získanie týchto génov H. pylori a H.
acinonychus
cez bočné prenosu génov. Obsah G + C tohto zhluku metabolizmu acetón génov v H. pylori
je o niečo vyššia, ako je priemer za celú genómu, ale toto sa zdá kvôli produktov týchto génov je veľmi bohatý na glycín (~ 10% porovnať až 6% genómu priemeru). Navyše zloženie charakteristiky týchto génov, ako je napríklad dinukleotidových relatívnej hojnosti a kodónov skreslenie, neindikuje nedávne bočné prevodu tejto oblasti [25] (J. Mrázek, osobné oznámenie).
Jungblut a spolupracovníci uvádzajú, že H . pylori
AcxC (HP0698) skrížene reagovali s protilátkami od pacienta o adenokarcinóm, čo znamená, že H. pylori acxABC
operon je vyjadrená v hostiteľskom [26]. Okrem toho ukazujeme tu, že H. pylori
môžu stretnúť významné množstvo acetónu v myšiam žalúdku, a tak sa táto zlúčenina môže slúžiť ako dôležitý respiračné donor elektrónov pre baktérie v hostiteľovi. V súlade s touto hypotézou, na H. pylori acxB
mutant bola významne znížená vo svoje schopnosti kolonizovať žalúdok myší, ktoré usudzujeme výsledky z neschopnosť zmutovaného využiť acetónu ako zdroja energie. Neschopnosť acetónu k stimulácii rastu H. pylori
SS1 v kvapalnej kultúre môžu byť výsledkom zlyhania rastových médií používaných pre napodobenie rastových podmienok, s ktorými sa baktérie pri kolonizovať žalúdočnú sliznicu. Alternatívne hypotéza pre kolonizáciu vadou acxB
mutanta je, že karboxylasa acetón je potreba pre detoxikáciu acetónu. Avšak, naše nedodržanie žiadnu inhibíciu v raste na acxB
zmutovaného pridaním acetónu v médiu kultúry, hovoria proti tento druhý prípad. Ďalšou možnosťou je, že výrobky z acxABC
operonu katalyzujú neznáme reakcie, ktoré sú dôležité pre prežitie alebo rast buniek H. pylori
v žalúdočnej sliznici. Ďalšie biochemická charakterizácia produktov H. pylori acxABC
operonu by mala prispieť k odlíšeniu medzi týmito possibililties.
Nedávna analýza transcriptome H. pylori
26695 za použitia celého genómu microarray navrhol, že regulačné odozva HP1021 silne aktivuje transkripciu acxABC stroje a scoAB
, a aktivovaným transkripcie fada stroje a hp0693 v menšej miere [24]. Autori tejto štúdie ukázali, že HP1021 sa viaže na regulačné oblasť promotora acxABC
, čo naznačuje, že tento regulátor reakcie priamo sprostredkováva svoje účinky na transkripciu acxABC stroje a že gény v klastri metabolizmus acetón sú súčasťou regulonu riadeného podľa HP1021. Pflock a kolegovia identifikovať 79 génov v H. pylori
26695, ktorého expresia bola zmenená v HP1021 zmutovaného - 51 génov bolo prepísané v nižších úrovniach v mutanta, zatiaľ čo 28 gény boli exprimované na vyššej úrovni [24]. HP1021 sa líši od väčšiny iných regulátorov odozvy v tom, že nie je vysoko konzervatívny fosfátu prijatie aspartát zvyšok, a nebola zistená príbuzný histidín kináza pre HP1021. Tam sú konfliktné správy o transkripciu HP1021 v reakcii na kyslom pH, ako aj na transkripcie H. pylori acxABC
v reakcii na nižšie pH [27-29]. Tieto rozdiely môžu byť vzhľadom na spôsob, akým boli kultivované baktérie. Aj keď sú tieto správy v rozpore s ohľadom na transkripciu HP1021 v reakcii na kyslom pH, výsledky z oboch štúdií ukazujú, že podmienky, ktoré vedú k down-regulácii výsledku HP1021 vo zvýšenej expresiu acxABC
. To sa zdá neintuitívne Vzhľadom k zjavnému úlohu HP1021 pri aktivácii transkripcie acxABC
.
Jediný ďalšie baktérie, pre ktoré bola skúmaná reguláciu acxABC
operonu je X. autotrophicus
. Transkripční kontrolou acxABC
v X. autotrophicus
sa líši od toho v H. pylori
. X. autotrophicus
chýba homológov HP1021, ale skôr reguluje transkripciu acxABC
cez σ 54 (RpoN) a σ 54 závislú aktivátor AcxR [15]. Aj keď H. pylori
má σ 54, na acxABC
operon nie je súčasťou H. pylori
RpoN regulonu [30].
Napriek nášmu pozorovanie, že narušenie acxB
nepriaznivo ovplyvňuje kolonizáciu myší H. pylori
SS1, nedávne celú dobu štúdia genóm mikročipu s päťdesiatimi šiestich po celom svete reprezentatívnych kmeňov H. pylori stroje a štyri H. acinonychis
kmene naznačil, že acxABC
gény nie sú prítomné vo všetkých H. pylori
kmeňov [31]. Bolo by zaujímavé zistiť, či izoláty chýba acxABC
sú menej konkurencieschopné v kolonizácii svoje prirodzené hostiteľa ako kmeňov, ktoré sú držiteľmi týchto génov. Alternatívne kmeňov chýba acxABC
môžu mať úpravy, ktoré kompenzujú nedostatok acetón karboxylázového činnosti. Vyplýva to z microarray štúdiami Gressmann a jeho kolegovia uviedli, že scoAB
, Fada
, HP0693 a HP0694 boli prítomné vo všetkých H. pylori stroje a H. acinonychis
kmene skúmali [31]. To znamená, že selekčný tlak udržiavať možnosť využiť acetoacetát ako potenciálny donor elektrónov v H. pylori a H.
acinonychis
zdá byť vyššia, než je pre metabolizmus acetón.
Záver
H . pylori acxABC
operon kóduje pravdepodobne karboxylázy acetón, ktorý katalyzuje konverziu acetónu acetoacetátu a je úzko spojený s génmi, ktorých produkty sa predpokladá, že katalyzujú postupné premenu acetoacetátu na acetyl-CoA. Kontrola genómov ďalšie úzko súvisiace s-Proteobacteria naznačuje, že gény podieľajúce sa na metabolizme acetónu sú prítomné iba u baktérií v tomto subphylum že kolonizovať žalúdočnú sliznicu. V acxABC
operon nebolo nevyhnutné pre myš kolonizáciu H. pylori
SS1, ale to sa zdá na zvýšenie kolonizácii. Ďalšie charakterizácia domnelého H. pylori
acetón karboxylázového a produktov z iných génov v rámci klastra acetón metabolizmus génu by mala poskytnúť vhľad do toho, ako ketolátky od hostiteľa prispieva k metabolickej ekonomiky H. pylori
a H . acinonychis stroje a ako tieto zlúčeniny vplyv na schopnosť týchto baktérií kolonizovať svojho hostiteľa.
Metódy
bakteriálnych kmeňov a mediálneho
plazmidovej konštrukcie a klonovanie bolo vykonané v E. coli kmeňa DH5a
ktoré bola kultivovaná v Luria-Bertani pri teplote 37 ° C. H. pylori kmeň 26695
bola použitá ako templát na polymerázovú reťazovú reakciu (PCR). H. pylori
SS1 bol použitý ako divokého typu kmeňa pre všetky experimenty a sa kultivuje buď na krvný agar alebo Tryptický sójový agar doplnenom 5% konského séra (TSA-sérum) pri teplote 37 ° C v atmosfére 4% O 2, 5% CO 2 a 91% N 2. Keď sú kultivované v kvapalnom médiu, H. pylori
kultúry boli pestované v Mueller-Hinton bujónu s prídavkom 5% konským sérom a 30 ug /ml bacitracínu alebo definovaného rastového média popísaného Bruggrabber a spolupracovníkmi [22]. Kultúry (10-15 ml pestované médium) boli pestované v 150-ml sérových fľaštičiek uzavretých s 20 mm teflónovými /silikónových diskov a hliníkovými uzávermi a v atmosfére 4% O 2, 5% CO 2, 10 % H 2, 81% N 2. Ak nie je uvedené inak, keď sa antibiotiká zahrnuté v médiu, ktoré boli pridané do nasledujúcej koncentrácie: 100 ug /ml ampicilínu, 30 ug /ml chloramfenikolu, 200 ug /ml bacitracínu 10 mg /ml vankomycín, a 10 ug /ml amfotericínu B.
Inaktivácia acxB
(HP0696) v H. pylori
SS1
2,3-kb fragment DNA, ktorý niesol acxB
bol amplifikovaný pomocou PCR z H. pylori kmeň 22695
a klonovaný do pGEM-T (Promega). Mačacie
kazeta bola zavedená do tohto plazmidu v eko
47III miesta nachádzajúce sa približne v polovici klonovaného acxB
. Výsledný plazmid bol použitý ako samovražedný vektor pre inaktiváciu chromozomálne kópiu acxB
v H. pylori
SS1. Samovražedný vektor bol zavedený do H. pylori
kmene ATCC 43504 a SS1, kmeň, ktorý môže kolonizovať myšou. Vzhľadom k tomu, opakované priechod H. pylori kmeňa
SS1 na médiu bola označená za následok stratu infekčnosti u myší, na acxB
mutant bol konštruovaný v čerstvom izoláte kmeňa SS1 získaného z infikovanej myši. Počet priechodov acxB
mutant v kmeni SS1 bola obmedzená a zaznamenaný a mutant bol uložený pri teplote -80 ° C. Rodičovského kmeňa SS1 bol udržiavaný a skladované zmrazené v rovnakým spôsobom. Potvrdilo sa, že PCR chromozomálne kópia acxB
bola narušená výmenou alelickou s plazmidmi nesie kópiu génu za použitia sady primérov, ktoré lemovanými miesto narušenia.
Rastové krivky pre H. pylori
kmene boli
H. pylori
bunky z TSA-séra dosky, na ktoré boli kmene pruhovaný z predchádzajúceho dňa suspendované vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS) a použité na naočkovanie kvapalného média pri oD 600 0,03. Ak nie je uvedené inak, acetón bol asepticky pridaný do média. Vzorky boli odobraté v rôznych časoch a bunkovej hustoty boli merané metódou rozptylu svetla pri OD 600. Alternatívne, životaschopné počty buniek sa stanovili po sériového riedenia vzoriek a nanesenie na TSA-séra. Po 4 až 5 dňoch inkubácie počty jednotiek tvoriacich kolónie (CFU), boli stanovené pre doskami.
Mouse kolonizácie
myš testy kolonizácie boli vykonávané v podstate ako bolo opísané skôr [32]. Tieto postupy v súlade s príslušnými federálnymi pokynov a inštitucionálnej politiky pre starostlivosť a zaobchádzanie s laboratórnymi zvieratami. Stručne povedané, H. pylori
bunky boli zozbierané po 48 hodinách rastu na krvné agarové dosky a suspendované v PBS na OD 600 1,7. Headspace v skúmavke bol prebublávania argónom sa minimalizovala expozícia kyslíka.

• Liečebný potenciál z Picrorhiza kurroa (Scrofulariaceae) odnože proti indometacínu indukované žalúdočné vredy: a mechanistické exploration.
• Dávke závislé inhibícia žalúdočnej zranenia vodíkom v alkalickom elektrolyzovanou pitnej vode