Желудочный патоген Helicobacter Pylori человек имеет потенциал ацетон карбоксилазы, что повышает его способность колонизировать mice

Человеческий желудочный патоген Helicobacter Pylori
имеет потенциал ацетон карбоксилазы, что повышает его способность колонизировать мышами
Аннотация
фона
Helicobacter Pylori
колонизирует человеческого желудка и является этиологическим агентом язвенной болезни. Все три H. Pylori
штаммы, которые были секвенированы на сегодняшний день содержат потенциальную оперон, продукция которой доля гомологии с субъединицами ацетона карбоксилазы (кодируемый acxABC
) от Xanthobacter autotrophicus
штамма py2 и Rhodobacter capsulatus <бр> штамм В10. Ацетон карбоксилазы катализирует превращение ацетона в эфир ацетоуксусной кислоты. Гены, вверх по течению от предполагаемого acxABC
оперон кодируют ферменты, которые преобразовывают ацетоацетатом к ацетоуксусными-КоА, который метаболизируется дополнительно генерировать две молекулы ацетил-КоА.
Результаты
Чтобы определить, является ли антихеликобактерную acxABC <бр> оперон играет определенную роль в принимающей колонизации acxB
гомологов в мыши адаптированный H. Pylori
SS1 штамма инактивированный с хлорамфеникол сопротивлением (кат
) кассеты. В исследованиях колонизация мыши числа хеликобактерной
оправился от мышей, привитых с acxB: кошка
мутант, как правило, от одного до двух порядков ниже, чем те оправились от мышей, привитых родительского штамма. Статистический анализ данных с использованием теста Wilcoxin ранг указал различия в количестве хеликобактерной
изолированы от мышей, привитых двумя штаммами были значимыми на уровне достоверности 99%. Уровни ацетона, связанные с желудочной ткани, удаленных из неинфицированных мышей были измерены и найдены в диапазоне от 10-110 μmols на грамм сырого веса ткани
Заключение
Колонизация дефект acxB:. Кошки
мутант предполагает роль для acxABC
оперона выживаемости бактерии в желудке. Продукты в H. Pylori acxABC
оперона может функционировать в основном в использовании ацетона или могут катализировать реакцию, связанную, что имеет важное значение для выживания или роста в хозяине. H. пилори
встречает значительные уровни ацетона в желудке, которые он мог бы использовать в качестве потенциального донора электронов для микроаэробной дыхания.
Фон
хеликобактерной
является микроаэрофильный, грамотрицательная бактерия, которая является значительное патоген слизистой оболочки желудка человека [1, 2]. Колонизация слизистой оболочки желудка с помощью H. Pylori
приводит к хроническим воспалением, которое может прогрессировать к различным заболеваниям, в том числе хронический гастрит, язвенная болезнь, рак желудка и слизистой оболочки-ассоциированной лимфомы [3-5]. При отсутствии антибактериальной терапии, хозяин, скорее всего, страдать всю жизнь H. Pylori
инфекции слизистой оболочки желудка.
Способность антихеликобактерной
упорствовать в человеческом желудке в течение длительных периодов времени, что указывает на он хорошо приспособлен получать питательные вещества, необходимые для роста в этой уникальной нише. Например, слизистый слой желудка мыши содержит значительное количество молекулярного водорода (17-93 мкМ), происходящих из метаболической активности микрофлоры в толстой кишке [6]. H. пилори
способен использовать этот молекулярный водород в качестве донора электронов для микроаэробной дыхания и функционального гидрогеназой требуется для успешной колонизации мышей H. Pylori
[6, 7]. В отличие от многих водородных бактерий, окисляющих, однако, H. Pylori
не способен автотрофного CO <югу> 2 фиксации.
Несколько исследований исследовали способность H. Pylori
чтобы использовать различные источники углерода. Антихеликобактерную
имеет ограниченную способность приобретать и усваивать сахара, наблюдение, которое согласуется с анализом геномных последовательностей антихеликобактерной
штаммов 22695 и J99 [8]. Глюкоза является единственным углеводом, что H. пилори
способен использовать которые он делает через Энтнер-Дудорова пути [9, 10]. Аминокислоты также служат в качестве источников углерода для антихеликобактерную
и используются преимущественно по антихеликобактерную
в ростовой среде, содержащей смесь глюкозы и аминокислот [9, 11]. Пируват, ключевым промежуточным в центре обмена веществ, по-видимому, генерируется в основном из лактата, аланина и серина, а не глюкозы в H. Pylori
[12, 13]. Пируват превращается в ацетил-КоА пирувата: флаводоксина оксидоредуктазой в H. Pylori
, который затем может кормить в трикарбоновых кислот (TCA) цикла [14]. Кроме того, аланин, лактат, ацетат, формиат и сукцинат, может быть получено антихеликобактерную
клеток инкубируют в аэробных условиях [12]. Производство ацетата и формиата в качестве продуктов обмена веществ предполагает существование смешанной кислоты брожения пути в H. Pylori
, хотя кислород необходим для роста бактерий [12].
Анализ последовательностей генома Н . пилори
штаммы 26695, J99 и HPAG1 выявили потенциальную оперон трех генов (обозначенный как HP0695, HP0696 и HP0697 в хеликобактерной
Результаты 26695) продукты которых общая 50-63% идентичность аминокислотной с р , α, и у субъединиц ацетона карбоксилазы из Xanthobacter autotrophicus
штамма py2 и Rhodobacter capsulatus
штамма В10 [15]. Гомологи ацетона карбоксилазы встречаются в ряде бактерий, но X. autotrophicus
и Р. capsulatus
ферменты лучше характеризует. Ацетон карбоксилазы катализирует АТФ-зависимое карбоксилирование ацетона и ацетоуксусной кислоты необходим для роста X. autotrophicus
и Р. capsulatus
с ацетоном в качестве единственного источника углерода и донора электронов для дыхания [15-17]. X. autotrophicus
ацетон карбоксилазы имеет высокое сродство к ацетоне (Km = 8 мкм), но скорость оборота фермента происходит очень медленно (~ 45 в мин) [15]. Для того, чтобы компенсировать низкую скорость оборота ацетона карбоксилазы, X. autotrophicus
производит большое количество фермента (17-25% от общего растворимого белка) при выращивании на ацетоне [15]
генов, расположенных рядом с H. Pylori
HP0695-HP0696-HP0697 оперон кодируют ферменты показали, конвертировать ацетоацетатом в ацетоуксусными-КоА, который метаболизируется далее в ацетил-КоА [8, 18]. Ацетон, ацетоуксусной кислоты и 3-β-гидроксибутирата являются кетоновые тела, производимые млекопитающих перивенозной гепатоцитов в процессе деградации жирных кислот и могут быть использованы в качестве доноров электронов для дыхания, когда углеводы не легко доступны [19]. Так же, как кетоновые тела являются важными источниками энергии для человека, когда углеводы не доступны, эти соединения могут служить в качестве респираторные доноры электронов для хеликобактерной
колонизировать слизистую оболочку желудка. Для того, чтобы определить, является ли HP0695-HP0696-HP0697 оперон играет определенную роль в принимающей колонизации мы инактивированный HP0696 в H. Pylori
штамма SS1. HP0696 мутант был скомпрометирован в его способности колонизировать мышей предполагая, что ацетон карбоксилирования или связанный ферментативной активностью, катализируемой продуктами HP0695-HP0696-HP0697 оперона является важным фактором, способствующим провести колонизацию.
Результаты
хеликобактерной
содержит набор генов, предсказанных быть вовлечены в ацетоне метаболизма
три H. Pylori
штаммов, чьи геномы были секвенированы содержат кластер из восьми консервативных генов в последовательности ДНК ~ 10 кб, шесть из которых кодируют ферменты предсказывал метаболизировать ацетон и ацетоуксусной кислоты в ацетил-КоА (рис. 1 и 2). Хеликобактер acinonychis
, близкородственных видов, который заражает большие кошачьих, также обладает этим кластер генов. Как было указано выше, три из этих генов имеют гомологичные с acxABC
, хотя первые два гена в опероне обозначены как гены, кодирующие белок утилизации гидантоина А и methylhydantoinase, соответственно, в аннотированных антихеликобактерную
геномов. Hydantoinases катализируют гидролиз 5-членных колец с помощью гидролиза внутренней имида связи и часто имеют довольно широкой субстратной специфичностью. Из белков в базе данных, чьи биохимические функции были продемонстрированы, анализ BLAST показал, что предсказанные продукты в H. Pylori
генов наиболее близко соответствуют значениям Xanthobacter
зр. Py2 acxABC
оперона (59-68% идентичность аминокислотной над всей длине трех предсказанных субъединиц). Для получения наиболее недавно секвенировали H. Pylori
и H. acinonychis
геномов последний ген оперона аннотированный, как acxC
[20, 21]. Таким образом, H. Pylori
HP0695-HP0696-HP0697 оперон, вероятно, кодирует ацетон карбоксилазы, а не hydantoinase, и мы, следовательно, относятся к этому оперона как acxABC
. Рисунок 1 Организация генов, участвующих в обмене веществ в ацетоне H. пилори и H. acinonychus штаммы. Генные обозначения указаны ниже каждой стрелки (не в масштабе). Открытые рамки считывания, которые не были даны обозначение гена в аннотированных последовательностей генома указаны либо с сильным обозначением (для H. Pylori
26695), A JHP обозначение (для хеликобактерной
J99) или только открытая рамка считывания номер (для H. Pylori
HPAG1 и А. acinonychis
штамма Sheeba). Ортологичных гены в четырех штаммов имеют тот же цвет. Гены jhp0628 в хеликобактерной
J99 и 0671 в хеликобактерной
HPAG1 соответствуют слиянию hp0688 и hp0689 от хеликобактерной
26695. H. Pylori
J99 и HPAG1 имеют два гена в этом регионе, jhp0629 (HPAG1_0672) и jhp0630 (HPAG1_0672), которые кодируют ДНК метилтрансферазы типа II и рестриктазы типа II, соответственно, и не будут найдены в хеликобактерной
26695. функции продуктов генов в ацетоне метаболизма кластера описаны в тексте. Предлагаемые функции продуктов окружающих генов: FECA
, железа (III) дицитрата транспортный белок; feoB
, железа (II), транспортный белок; dgkA
, диацилглицеринацилтрансферазы киназы; GYRA
, субъединицу А ДНК-гиразы; dcuA
, анаэробная C4-дикарбоксилат транспортером; и ansB
, аспарагиназа II. Рисунок 2
Предлагаемый путь для использования ацетона в H.pylori. Предлагаемый путь для превращения ацетона в ацетил-КоА в хеликобактерной
и H. acinonychis
показано. Реакции и гены, кодирующие ферменты, ответственные за каждую катализировать реакцию указаны
двух других генов в кластере генов, SCOA
(HP0691) и scoB
(HP0692), сукцинил-СоА закодировать:. Ацетоуксусной кислоты CoA-трансферазы ( SCOT), которая катализирует превращение ацетоацетатные плюс сукцинил-КоА в ацетоуксусными-СоА плюс сукцината [18]. Ацетоуксусными-КоА производства SCOT метаболизируется далее ацетоуксусными-СоА тиолаза, который кодируется Фада
(HP0690, ген помечается, как THL
в хеликобактерной
J99 и atoB
в H. пилори
HPAG1 и Х. acinonychis
), чтобы генерировать две молекулы ацетил-КоА из ацетоацетил-СоА плюс кофермента а (КоА) [8]. Два оставшихся генов в пределах этого кластера, HP0693 и HP0694, прогнозируются для кодирования пермеазы жирных кислот с короткой цепью и внешний мембранный белок, соответственно, и могут функционировать в перевозке ацетоуксусной кислоты.
Восьми генов в пределах этого предполагаемого ацетона метаболизма кластера расположены один и тот же по отношению друг к другу в трех антихеликобактерную
штаммов, но кластер ориентирован в любом из двух возможных направлений (рис. 1), что указывает на возникновение инверсии ДНК в этой области в ходе эволюции H. пилори
. Выравниваний последовательностей ДНК из трех штаммов суженный участок инверсии до ~ 40 пар оснований ниже по потоку от acxC
гомолога и ~ 160 п.н. выше стартового кодона для Фадаи
(данные не показаны). Нет больших прямых или инвертированные повторы не находятся вблизи этих регионов, которые, возможно, были вовлечены в инверсии, и поэтому мы не можем предположить, как к механизму для этой инверсии. Для хеликобактерной
штаммов J99 и HPAG1, но не 26695, есть предсказанный тип II ДНК метилтрансферазы (jhp0629 и HPAG1_0673) и фермента рестрикции типа II (jhp0630 и HPAG1_0672), прилегающих к предполагаемому ацетона генов метаболизма кластера.
H. acinonychis
обладает предположительного ацетон метаболизма кластер генов и генов в кластере находятся в той же ориентации, что и в H. Pylori
J99. В H. acinonychis
эти гены находятся рядом с dgkA
и GYRA
как они находятся в H. Pylori
, но примыкают на противоположном конце по dcuA
и ansB
. FECA
и feoB
гены, которые расположены вблизи кластера генов ацетона метаболизма в штаммов H. Pylori
, составляют ~ 69 кб из этого кластера генов в H. acinonychis
. Таким образом, относительное расположение генов в Ацетон метаболизма кластера оставалась удивительно консервативны в процессе эволюции антихеликобактерной
и Х. acinonychis
несмотря на то, что соседняя область в геномах этих двух видов подвергшегося . обширные перегруппировки
The H. Pylori acxB: кошки
мутант испытывает дефицит в его способности колонизировать мышей
The acxB
ген хеликобактерной
SS1, что мышь адаптированный штамм , был нарушен с сопротивлением хлорамфеникол (кат
) кассеты. Культуры дикого типа H. Pylori
SS1 и acxB: кошка
мутант выращивали в бульона Мюллера-Хинтона с добавлением лошадиной сыворотки или описанной ранее определенной среде [22]. Варьируя количество ацетона в диапазоне от 1,3 мм до 26 мм, были включены в ростовой среде, чтобы определить, является ли ацетон повлияло на рост либо деформации. Рост клеток контролировали с помощью жизнеспособных клеток, а также оптических плотностей культур в разное время. В том числе ацетон в любом средах роста не оказывает влияния на скорость роста или конечный выход клеток хеликобактерной
SS1 или acxB: кошка
мутанта (данные не показаны). Провал ацетона, чтобы стимулировать рост хеликобактерной
SS1 при условиях испытания не является неожиданным, так как питательная среда для H. Pylori
очень богатая питательными веществами. Эти данные также свидетельствуют о том, что acxABC
не требуется для ацетона детоксикации
Способность acxB:. Кошки
мутантный колонизировать мышей сравнивали с родительской хеликобактерной
штамма SS1 в двух отдельные испытания. В каждом испытании, одиннадцать мышей заражают штаммом дикого типа и одиннадцать были привиты с acxB: кошка
мутанта. Через три недели после инокуляции мышей с штаммов H. Pylori
мышей умерщвляли и определяли число антихеликобактерной
в желудках животных. Для мышей, которые были инокулированы штамма дикого типа, большинство животных (19/22 животных) были H.pylori,
отсчеты, которые были значительно выше предела обнаружения, что составляло 500 CFU на грамм желудка (рис. 3). Число H. Pylori
в образцах, которые были выше предела обнаружения в диапазоне от 10 4 - 10 6 КОЕ на грамм желудка. Большинство мышей, привитых с acxB: кошки
мутант также имели измеримые уровни антихеликобактерной
(15/22 животных), но числа хеликобактерной
связанные с этими мышами, как правило, к одному два порядка ниже, чем у мышей, которые были привиты штаммом дикого типа. Статистический анализ данных с использованием теста Wilcoxin Rank проверить, что различия в численности антихеликобактерной
выделенных из мышей, привитых двумя штаммами были значимыми на уровне достоверности 99%, что свидетельствует о том, что ацетон карбоксилазы расширило возможности H. пилори
SS1 колонизировать желудок мыши. Так как нам не удалось клонировать acxABC
оперон мы не смогли проверить путем комплементации, что acxB
мутация была ответственна за дефект в колонизации. Тем не менее, маловероятно, что колонизация фенотип acxB
мутанта был обусловлен полярных эффектов, так как нет никаких дополнительных генов в acxABC
оперона в любом из трех H. Pylori
штаммов, чьи геномы были секвенировали на сегодняшний день (рис. 1). Кроме того, колонизация дефект не вероятно, из-за ослабления или вторичной мутации, так как мы строили acxB
мутанта в свежем изолята штамма SS1, извлеченного из зараженной мыши. Рисунок 3 Mouse колонизация анализ антихеликобактерной SS1 и изогенная acxB: мутантный штамм кошки. Данные представлены в виде диаграммы рассеяния колониеобразующих единиц на грамм желудка, как определено подсчетом плит. Каждое пятно представляет КОЕ отсчет от одной мыши, выраженное как значение log10 (КОЕ /г желудка) в Y-оси. Базовая линия [log10 (КОЕ /г желудка) = 2,7] является предел обнаружения анализа, который представляет количество ниже 500 КОЕ /г желудка.
Уровни Ацетон в желудке мыши
Поскольку данные из мыши колонизация анализы предположили, что способность использовать ацетон по хеликобактерной
имеет важное значение для эффективной колонизации хозяина, мы хотели, чтобы определить, является ли H. Pylori
обнаружены значительные уровни ацетона в желудке мыши. Хотя уровни ацетона было зарегистрировано для различных телесных жидкостей, мы не знали о каких-либо сообщений о уровнях ацетона, связанных с желудочным соком или ткани. Таким образом, мы измерили уровни ацетона, связанные с мышиной желудка ткани после быстрого удаления желудки от мышей и немедленно помещая желудки в запечатанных ампул сыворотки. Так как мы хотели бы оценить уровень ацетона, что H. Pylori
может столкнуться во время хронической инфекции, животные, используемые для этого исследования были сохранены на регулярной график кормления и были умерщвлены в первой половине дня до получения их нормальной повседневной пищи земельный надел. Запечатанные сывороточные флаконы, содержащие Мышей желудки инкубировали на льду, чтобы ацетон, связанный с желудочной ткани уравновешиваться с газовой фазой в ампулах, после чего в газовой фазе образцы анализировали с помощью газовой хроматографии. Эта процедура была сделана первоначально умерщвления животных и удаление их желудки. Аналогичные результаты, однако, были получены путем удаления желудков у живых животных, которые были под наркозом. Количество ацетона, связанный с желудочной ткани для каждой отдельной мыши разнообразны, начиная от ~ 10 до 110 μmols ацетона на грамм сырого веса ткани (рис. 4), при этом большинство значений (6/7) падает в диапазоне от 10 до 35 μmols ацетона на грамм сырого веса ткани. Эти данные свидетельствуют о том, что миллимолярных количества ацетона связаны с мышиной желудочной ткани и могут быть доступны в качестве потенциального углерода или источника энергии для H. Pylori
. Этот уровень ацетона, связанный с мышиным желудочной ткани была выше, чем то, что мы ожидали, так как уровни сывороточных кетоновых тел изменяются в организме человека и других млекопитающих, как правило, в пределах от &ЛТ; 0,5 мМ до нескольких миллимолей [23]. Ацетон продуцируетс у млекопитающих путем спонтанного декарбоксилирования ацетоуксусной кислоты и эта декарбоксилирование усиливается при низком рН, и таким образом ацетон может накапливаться в желудке из-за кислотности желудочного сока. Рисунок 4 Уровни Ацетон связаны с мышиной желудка ткани. Уровни ацетона с желудком были определены для трех мышей после умерщвления животных и немедленно удаляя их желудки (посмертные), и в течение четырех мышей, которые были под наркозом, после чего их желудки были удалены (предсмертного). Вырезанные желудки мышь помещали непосредственно в закупоренные флаконы, которые затем помещали на лед в течение не менее 30 мин, чтобы позволить ацетон, связанный с желудочной ткани уравновешиваться с газовой фазой. Уровни Ацетон в газовой фазах ампул были измерены с помощью газовой хроматографии и оценивается из стандартных кривых, полученных для каждого флакона. Каждое значение представляет собой среднее по меньшей мере трех измерений и Столбики ошибок указывают на стандартные отклонения для каждого образца.
Обсуждение
Мы предоставляем доказательства того, что H. пилори
обладают функциональной ацетон карбоксилазы, как постулировал ранее Ensign и сотрудничества -workers [15]. The H. Pylori acxABC
оперон рядом с scoAB
и FADB
гены, которые кодируют ферменты, Scot и ацетоуксусными-КоА тиолаза. Таким образом, этот кластер генов кодирует набор ферментов, способных метаболизировать ацетон в ацетил-КоА. Ацетил-CoA получают из ацетона и ацетоуксусной кислоты может подаваться в ЦТК, чтобы обеспечить энергию для H. Pylori
. Как отмечает Pflock и сотрудниками acxABC
оперон и другие гены, связанные с ацетоном метаболизма присутствуют в H. acinonychis
[24]. Эти гены отсутствуют, однако, в других тесно связанных с е-протеобактерий, чьи геномы были секвенированы до сих пор, которая включает в себя хеликобактера hepaticus
, Campylobacter jejuni
, Thiomicrospira denitrificans
и Wolinella succinogenes
. Приобретение и содержание ацетона метаболизма кластера генов в хеликобактерной
и Х. acinonychis
может быть связано с тем, что, в отличие от этих других связанных с е-протеобактерий, они колонизировать слизистую оболочку желудка. Кластеризация этих генов и отсутствие ортологичных генов в других тесно связанных с е-протеобактерий может указывать на возможное приобретение этих генов с помощью антихеликобактерную
и H. acinonychus
через боковой перенос генов. Содержание G + C этого кластера генов ацетона метаболизма в хеликобактерной
немного выше, чем в среднем для всего генома, но это возникает из-за продуктов этих генов является очень богата глицина (~ 10% по сравнению до 6% в среднем генома). Кроме того, композиционные характеристики этих генов, такие как динуклеотидных относительных содержаний и смещение кодонов, не свидетельствуют о недавнем латерального переноса этой области [25] (J. Mrázek, личное сообщение).
Юнгблут с соавторами сообщили, что Н . пилори
AcxC (HP0698) кросс-реакцию с антителами от пациента с аденокарциномой, указывая, что H. Pylori acxABC
оперон выражается в хозяине [26]. Кроме того, показано, что здесь антихеликобактерную
может столкнуться значительные уровни ацетона в желудке мыши и таким образом это соединение может служить в качестве важного респираторного донора электронов для бактерии в хозяине. В соответствии с этой гипотезе, H. Pylori acxB
мутант был значительно уменьшен в его способности колонизировать желудок мыши, который мы выводим результаты из-за неспособности мутантного использовать ацетон в качестве источника энергии. Неспособность ацетона, чтобы стимулировать рост хеликобактерной
SS1 в жидкой культуре может возникнуть в результате отказа средств массовой информации роста, используемых для имитации условий роста, с которыми сталкиваются бактерии при колонизировать слизистую оболочку желудка. Альтернативная гипотеза для колонизации дефекта acxB
мутанта является то, что ацетон карбоксилазы необходим для детоксикации ацетона. Тем не менее, наша неспособность наблюдать любое ингибирование роста acxB
мутанта путем добавления ацетона в культуральной среде приводит доводы против этой последней гипотезы. Другая возможность состоит в том, что продукты в acxABC
оперона катализируют неизвестная реакция, которая имеет важное значение для роста выживаемости клеток или антихеликобактерной
в слизистой оболочке желудка. Далее биохимические характеристики продуктов в H. Pylori acxABC
оперона должно помочь провести различие между этими possibililties.
Недавний анализ транскриптом антихеликобактерной
26695 с использованием целого генома микрочипов предположил, что регулятор ответа HP1021 сильно активируется транскрипцию acxABC
и scoAB
и активированной транскрипции Фада
и hp0693 в меньшей степени [24]. Авторы этого исследования показали, что HP1021 связывает промотор регуляторную область acxABC
, предполагая, что этот регулятор ответ непосредственно опосредует свои эффекты на транскрипцию acxABC
и что гены внутри ацетона метаболизма кластера являются частью регулона контролируемой на HP1021. Pflock и его коллеги определили 79 генов в хеликобактерной
26695, экспрессия которого была изменена в HP1021 мутанта - 51 генов были расшифрованы на более низких уровнях в мутанта в то время как 28 генов были выражены на более высоких уровнях [24]. HP1021 отличается от большинства других регуляторов ответа в том, что ему не хватает высоко консервативными фосфатом принимая аспартат остатка и родственно гистидинкиназа для HP1021 не был идентифицирован. Есть противоречивые сообщения о транскрипции HP1021 в ответ на кислом рН, а также на транскрипция хеликобактерной acxABC
в ответ на снижение рН [27-29]. Эти различия могут быть обусловлены тем, как культивировали бактерии. Хотя эти доклады конфликта в отношении транскрипции HP1021 в ответ на кислом рН, результаты обоих исследований указывают на то, что условия, которые приводят к понижающей регуляции результата HP1021 в повышенной экспрессии acxABC
. Это, кажется, противоречит здравому смыслу, учитывая очевидную роль HP1021 в активации транскрипции acxABC
.
Единственная другая бактерия, для которой регуляции acxABC
оперона был исследованный X. autotrophicus
. Транскрипционная контроль acxABC
в X. autotrophicus
отличается от таковой в H. Pylori
. X. autotrophicus
отсутствует гомолог HP1021, а регулирует транскрипцию acxABC
через σ 54 (RpoN) и σ 54-зависимый активатор AcxR [15]. Хотя антихеликобактерную
обладает σ 54, в acxABC
оперон не является частью H. Pylori
RpoN Регулон [30].
Несмотря на наше наблюдение, что нарушение acxB
отрицательно сказывается на колонизацию мышей хеликобактерной
SS1, недавние исследования генома целых микрочипов с пятидесяти шести глобально репрезентативных штаммов H. пилори
и четыре H. acinonychis
штаммы показали, что гены acxABC
нет в штаммы H. Pylori все
[31]. Было бы интересно, чтобы определить, является ли изоляты, не имеющие acxABC
являются менее конкурентоспособными в колонизацию их природных хозяев, чем штаммы, которые обладают этими генами. В качестве альтернативы, штаммы отсутствуют acxABC
может иметь приспособления, которые компенсируют за отсутствие ацетона карбоксилазы деятельности. Результаты исследований микрочипов по Gressmann и его коллеги показали, что scoAB
, Фадаи
, HP0693 и HP0694 присутствовали во всех H. Pylori
и H. acinonychis
штаммы рассмотрены [31]. Таким образом, селективное давление поддержания способность использовать ацетоуксусной кислоты в качестве потенциального донора электронов в антихеликобактерную
и Х. acinonychis
по-видимому, больше, чем для ацетона метаболизма.
Заключение
Н . пилори acxABC
оперон вероятно кодирует ацетон-карбоксилазы, который катализирует превращение ацетона в эфир ацетоуксусной кислоты и тесно связаны с генами, продукты которых, по прогнозам, катализируют последующее превращение ацетоуксусной кислоты в ацетил-КоА. Осмотр геномов других тесно связанных с е-протеобактерий позволяет предположить, что гены, участвующие в метаболизме ацетон присутствуют только у бактерий в пределах этого подтипа, что колонизировать слизистую оболочку желудка. В acxABC
оперон не имеет важное значение для колонизации мыши Г. пилори
SS1, но это, по всей видимости повышения колонизацию. Дальнейшая характеристика предполагаемому H. Pylori
ацетон карбоксилазы и продуктами других генов в пределах ацетона метаболизма кластера генов должен дать представление о том, как кетоновые тела от хозяина способствуют метаболическим экономике антихеликобактерной
и H . acinonychis
и как эти соединения влияют на способность этих бактерий колонизировать их хозяев.
Методы
Бактериальные штаммы и СМИ
Плазмида строительство и клонирование было сделано в E.coli штамма DH5 &alpha
которой культивировали в Лурии-Бертани при 37 ° с. H. Pylori
штамм 26695 использовали в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР). Г. пилори
SS1 был использован в качестве штамма дикого типа во всех экспериментах, и культивировали на любой кровяной агар или трипсином соевом агаре с добавлением 5% лошадиной сыворотки (ТСА-сыворотка) при 37 ° С в атмосфере, содержавшей 4% O <суб> 2, 5% CO <югу> 2 и 91% N <югу> 2. При культивировании в жидкой среде, H. Pylori
культуры выращивали в Мюллера-Хинтона с добавлением 5% лошадиной сыворотки и 30 мкг /мл бацитрацин или определенной среде роста, описываемого Bruggrabber и его сотрудниками [22]. Культуры (10-15 мл выращены среда), выращивали в 150-мл сыворотки флаконы залиты 20 мм тефлоновых /силиконовыми дисками и алюминиевыми колпачками и в атмосфере, содержавшей 4% O <суб> 2, 5% СО <югу> 2, 10 % Н <югу> 2, 81% N <югу> 2. Если не указано иначе, когда антибиотики были включены в среду они были добавлены в следующих концентрациях: 100 мкг /мл ампициллина, 30 мкг /мл хлорамфеникола, 200 мкг /мл бацитрацин 10 мкг /мл ванкомицина, и 10 мкг /мл амфотерицина В.
Инактивация acxB
(HP0696) в H. Pylori
SS1
2,3 т.п.н. фрагмент ДНК, который нес acxB
амплифицировали с помощью ПЦР из H. Pylori
штамма 22695 и клонировали в pGEM-T (Promega). Кошачья
кассета была введена в эту плазмиду в эко
47III сайт, расположенный примерно в середине клонированного acxB
. Полученную плазмиду использовали в качестве вектора для самоубийства инактивировать хромосомный копию acxB
в H. Pylori
SS1. Вектор самоубийства был введен в H. Pylori
штаммы АТСС 43504 и SS1, штамм, который может колонизировать мышей. Поскольку повторил прохождение H. Pylori
штамма SS1 на среде, как сообщается, привести к потере инфекционности у мышей, в acxB
мутант был построен в свежем изолята штамма SS1, извлеченного из зараженной мыши. Количество прохождений acxB
мутанта в штамме SS1 был ограничен, и записаны, и мутант хранили в замороженном состоянии при -80 ° С. Родительский штамм SS1 поддерживалось и хранили в замороженном состоянии идентичным образом. Мы подтвердили с помощью ПЦР, что хромосомная копия acxB
была нарушена обмена аллельного с плазмидой переносимых копии гена с использованием набора праймеров, которые фланкированные сайт срыва.
Кривые роста для хеликобактерной <бр> штаммы
антихеликобактерную
клетки из АСП-сывороточных пластин, на которых штаммы были штрихом на предыдущий день суспендировали в фосфатно-солевом буфере (PBS) и использовали для инокуляции жидкой среды при ОП <суб> 600 0,03. Там, где указано, добавл ли ацетон асептически в среду. Образцы были взяты в разное время и плотность клеток измеряли с помощью рассеяния света при OD <подразделам> 600. В качестве альтернативы, жизнеспособных клеток определяли следующие серийные разведения образцов и посеве на АСП-сывороткой. После 4 до 5 дней инкубации, количество колониеобразующих единиц (КОЕ) определяли для пластин.
Колонизация Мыши
мыши колонизация Анализы проводили, по существу, как описано ранее [32]. Эти процедуры выполнены соответствующими федеральными руководящими принципами и институциональной политики по уходу и обращению с лабораторными животными. В кратком изложении, H. Pylori
клетки собирали через 48 ч роста на чашках с агаром крови и суспендировали в PBS до OD <суб> 600 1.7. Свободное пространство в трубке продувают аргоном, чтобы свести к минимуму воздействие кислорода.

• Целебные Потенциал Picrorhiza kurroa (Scrofulariaceae) корневищ против индометацин-индуцированной язвой желудка:. Механисти…
• Зависимое от дозы ингибирование повреждения желудка с помощью водорода в щелочной электролизованной питьев…