El patógeno gástrico humano Helicobacter pylori tiene un potencial carboxilasa acetona que mejora su capacidad para colonizar ratones

El patógeno humano gástrica por Helicobacter pylori
tiene un potencial carboxilasa acetona que mejora su capacidad para colonizar ratones
Resumen Antecedentes

Helicobacter pylori coloniza
el estómago humano y es el agente etiológico de la enfermedad de úlcera péptica . Las tres cepas de H. pylori
que se han secuenciado hasta la fecha contienen un operón potencial cuyos productos comparten homología con las subunidades de carboxilasa acetona (codificada por acxABC
) de Xanthobacter autotrophicus
cepa Py2 y Rhodobacter capsulatus
cepa B10. acetona carboxilasa cataliza la conversión de acetona a acetoacetato. Genes aguas arriba de la putativo acxABC
enzimas operón codifican que convierten acetoacetato de acetoacetilo CoA, que se metaboliza además para generar dos moléculas de acetil-CoA.
Resultados
Para determinar si el H. pylori acxABC
operón tiene un papel en la colonización de acogida la acxB
homólogo en la cepa de H. pylori SS1
adaptada a ratón se inactivó con una casete de resistencia al cloranfenicol (cat
). En los estudios de colonización de ratones el número de H. pylori
recuperados de los ratones inoculados con la acxB: Gato
mutante eran generalmente de una a dos órdenes de magnitud más bajos que los recuperados de los ratones inoculados con la cepa parental. Un análisis estadístico de los datos utilizando una prueba de Wilcoxin Rango indica las diferencias en el número de H. pylori
aislados de los ratones inoculados con las dos cepas fueron significativas al nivel de confianza del 99%. Los niveles de acetona asociados con tejido gástrico eliminado a partir de ratones no infectados se midieron y se encontró que variar de 10-110 μmols por gramo de tejido de peso en húmedo
Conclusión comentario El defecto de colonización de la acxB: Cat.
Mutante sugiere un papel para la acxABC
operón en la supervivencia de la bacteria en el estómago. Productos de la H. pylori acxABC
operón pueden funcionar principalmente en la utilización de acetona o pueden catalizar una reacción relacionada con la que es importante para la supervivencia o el crecimiento en el huésped. H. pylori
encuentra con niveles significativos de acetona en el estómago que se podría utilizar como un donador de electrones potencial para la respiración microaeróbica.
Antecedentes
Helicobacter pylori
es un microaerophilic, bacteria gram-negativa que es una patógeno significativa de la mucosa gástrica humana [1, 2]. La colonización de la mucosa gástrica por H. pylori
conduce a la inflamación crónica que puede progresar a una variedad de enfermedades, incluyendo gastritis crónica, úlcera péptica, cáncer gástrico y la mucosa asociada a linfoma [3-5]. En ausencia de una terapia antimicrobiana, el anfitrión es probable que sufra una vida H. pylori Red de la mucosa gástrica. México La capacidad de H. pylori
a persistir en el estómago humano durante períodos prolongados indica que está bien adaptado para adquirir los nutrientes que necesita para el crecimiento en este nicho único. Por ejemplo, la capa mucosa del estómago de ratón contiene cantidades significativas de hidrógeno molecular (17-93 M) procedentes de la actividad metabólica de la flora microbiana en el intestino grueso [6]. H. pylori
es capaz de utilizar este hidrógeno molecular como un donador de electrones para la respiración microaeróbica y una hidrogenasa funcional se requiere para la colonización exitosa de ratones por H. pylori
[6, 7]. A diferencia de muchas bacterias oxidantes de hidrógeno, sin embargo, la H. pylori
no es capaz de CO autótrofos 2 fijación.
Varios estudios han examinado la capacidad de H. pylori
de utilizar diversas fuentes de carbono. H. pylori
tiene una capacidad limitada para adquirir y metabolizar azúcares, una observación que es coherente con el análisis de las secuencias genómicas de H. pylori
cepas 22695 y J99 [8]. La glucosa es el único hidrato de carbono que H. pylori
es capaz de utilizar que lo hace a través de la vía de Entner-Doudoroff [9, 10]. Los aminoácidos también sirven como fuentes de carbono para H. pylori
y se utilizan preferentemente por H. pylori
en medio de crecimiento que contiene una mezcla de glucosa y aminoácidos [9, 11]. El piruvato, un intermedio clave en el metabolismo central, parece ser generada principalmente de lactato, alanina y serina, en lugar de la glucosa en H. pylori
[12, 13]. El piruvato se convierte en acetil-CoA por la piruvato: flavodoxina oxidorreductasa en H. pylori
, que luego puede alimentar en el ácido tricarboxílico (TCA) del ciclo [14]. Además, alanina, lactato, acetato, formiato y succinato pueden ser producidas por H. pylori
células incubadas aeróbicamente [12]. La producción de acetato y formiato como productos metabólicos sugiere la existencia de una vía de fermentación de ácido mixto en H. pylori
, aunque el oxígeno es esencial para el crecimiento de la bacteria [12].
Análisis de las secuencias del genoma de H . pylori
cepas 26695, J99 y HPAG1 revelaron un operón potencial de tres genes (designados como HP0695, HP0696 y HP0697 en H. pylori
26695) los productos de los cuales comparte una identidad de aminoácidos 50 a 63% con la β , α, y subunidades gamma carboxilasa de acetona de Xanthobacter autotrophicus
cepa Py2 y Rhodobacter capsulatus
cepa B10 [15]. Los homólogos de acetona carboxilasa se encuentran en una serie de bacterias, pero la X. autotrophicus
y R. capsulatus
enzimas son la mejor caracterizados. acetona carboxilasa cataliza la carboxilación dependiente de ATP de acetona a acetoacetato y es necesario para el crecimiento de X. autotrophicus
y R. capsulatus
con acetona como única fuente de carbono y donador de electrones para la respiración [15-17]. X. autotrophicus
acetona carboxilasa tiene una alta afinidad por acetona (Km = 8 M), pero la tasa de rotación de la enzima es muy lento (~ 45 min) [15]. Para compensar la baja tasa de rotación de la carboxilasa acetona, X. autotrophicus
produce altas cantidades de la enzima (17-25% de la proteína soluble total) cuando se cultivan en acetona [15]
genes situados cerca de la H. pylori
HP0695-HP0696 HP0697-enzimas operón codifican muestran para convertir acetoacetato de acetoacetil.CoA, que se metaboliza a acetil-CoA [8, 18]. La acetona, acetoacetato y 3-β-hidroxibutirato son cuerpos cetónicos producidos por los hepatocitos de mamífero perivenosos durante la degradación de ácidos grasos y se utilizan como donadores de electrones para la respiración cuando los carbohidratos no están fácilmente disponibles [19]. Del mismo modo que los cuerpos cetónicos son importantes fuentes de energía para los seres humanos cuando los carbohidratos no están disponibles, estos compuestos pueden servir como donadores de electrones respiratorios para H. pylori
colonizar la mucosa gástrica. Para determinar si el operón-HP0695 HP0696 HP0697-tiene un papel en la colonización de acogida Estamos inactivado HP0696 en H. pylori
cepa SS1. El mutante HP0696 se vio comprometida en su capacidad para colonizar ratones que sugieren que la carboxilación acetona o una actividad enzimática relacionada catalizada por los productos del operón HP0695-HP0696-HP0697 es un factor importante que contribuye a la sede de la colonización.
Resultados
H. pylori
contiene un conjunto de genes predichos estar involucrado en el metabolismo de acetona
Las tres cepas de H. pylori
cuyos genomas han sido secuenciados contener un grupo de ocho genes conservados dentro de una secuencia de ADN kb ~ 10, seis de los cuales codifican enzimas predijeron para metabolizar acetona y acetoacetato a acetil-CoA (. Figs 1 y 2). Helicobacter acinonychis
, una especie vecina que infecta grandes felinos, también posee este grupo de genes. Como se indicó anteriormente, tres de estos genes comparten homología con acxABC
, aunque los dos primeros genes en el operón se indican como genes que codifican proteínas utilización hidantoína A y methylhydantoinase, respectivamente, en el H. pylori
genomas anotados. Hidantoinasas catalizar la hidrólisis de anillos de 5 miembros a través de hidrólisis de un enlace imida interna y con frecuencia tienen bastante amplia especificidad de sustrato. De las proteínas en la base de datos cuyas funciones bioquímicas se ha demostrado, el análisis BLAST reveló que los productos predichos de la H. pylori
genes más se acerquen a las de la Xanthobacter
sp. Py2 acxABC
operón (identidad de aminoácidos 59 a 68% sobre la totalidad de las longitudes de las tres subunidades predicho). Para los más recientemente secuenciado H. pylori y H.
acinonychis
genomas del último gen del operón está anotado como acxC
[20, 21]. Por lo tanto, el H. pylori
operón HP0695-HP0696 HP0697-probablemente codifica la carboxilasa de acetona en lugar de hidantoinasa, y que, por tanto, se refiere a este operón como acxABC
. Figura 1 Organización de los genes implicados en el metabolismo de acetona en H. pylori y H. acinonychus cepas. denominaciones de genes se indican a continuación cada flecha (no está dibujado a escala). marcos de lectura abiertos que no se les dio una designación de genes en el genoma secuencias anotadas se indican, ya sea con una designación de CV (para H. pylori
26695), una designación JHP (por H. pylori
J99), o sólo el número de marco de lectura abierto (para H. pylori
HPAG1 y A. acinonychis
cepa Sheeba). genes ortólogos en las cuatro cepas son del mismo color. Los genes jhp0628 en H. pylori J99
y 0671 en H. pylori
HPAG1 corresponden a una fusión de hp0688 hp0689 y de H. pylori
26695. H. pylori J99
y HPAG1 tienen dos genes dentro de esta región, jhp0629 (HPAG1_0672) y jhp0630 (HPAG1_0672), que codifican una ADN metiltransferasa tipo II y una enzima de restricción de tipo II, respectivamente, y no se encuentran en H. pylori
26695. las funciones de los productos de los genes dentro de la agrupación metabolismo acetona se describen en el texto. Las funciones propuestas de los productos de los genes de los alrededores son: FECA
, proteína transportadora de hierro dicitrato (III); FEOB
, hierro (II) proteína de transporte; dgkA
, diacilglicerol quinasa; gyrA
, la subunidad A de la ADN girasa; DCUA
, anaeróbico C4-dicarboxilato transportador; y ANSB
, asparaginasa II.
Figura 2 vía propuesta para la utilización de acetona en H. pylori. La vía propuesta para la conversión de acetona a acetil-CoA en H. pylori y H.
acinonychis
se muestra. Reacciones y genes que codifican las enzimas responsables de catalizar cada reacción se indican en otras dos genes dentro de la agrupación de genes, Scoa
(HP0691) y SCOB
(HP0692), codificar succinil CoA:. Acetoacetato CoA-transferasa ( SCOT), que cataliza la conversión de acetoacetato más succinil-CoA a acetoacetil-CoA más succinato [18]. Acetoacetil.CoA producido por SCOT es metabolizado aún más por acetoacetil.CoA tiolasa, que está codificada por fadA gratis (HP0690; gen está anotado como THL Hoteles en H. pylori J99
y atoB Hoteles en H. pylori
HPAG1 y H. acinonychis
), para generar dos moléculas de acetil-CoA a partir de acetoacetil-CoA más coenzima a (CoA) [8]. Los dos genes restantes dentro de este cluster, HP0693 y HP0694, se prevé para codificar una permeasa de ácidos grasos de cadena corta y una proteína de la membrana externa, respectivamente, y pueden funcionar en el transporte de acetoacetato.
Los ocho genes dentro de este grupo el metabolismo acetona putativo están dispuestas de la misma respecto a la otra en las tres cepas de H. pylori
, pero la agrupación está orientada en cualquiera de las dos direcciones posibles (Fig. 1) que indica la ocurrencia de una inversión de ADN en esta región durante la evolución de H. pylori
. Alineaciones de secuencias de ADN de las tres cepas se estrecharon el sitio de la inversión a ~ 40 pb aguas abajo de la acxC
homólogo y ~ 160 pb aguas arriba del codón de inicio para Fada
(datos no mostrados). No hay grandes repeticiones directas o invertidas se encuentran cerca de estas regiones que podrían haber estado involucrados en la inversión, por lo que no puede especular sobre el mecanismo para esta inversión. Para H. pylori
cepas J99 y HPAG1, pero no 26695, hay un tipo II metiltransferasa predicho ADN (jhp0629 y HPAG1_0673) y una enzima de tipo II de restricción (jhp0630 y HPAG1_0672) adyacente a la acetona grupo de genes de metabolismo putativo.
H. acinonychis
posee el grupo de genes del metabolismo acetona putativo y los genes dentro de la agrupación están en la misma orientación que los de H. pylori
J99. En H. acinonychis
estos genes son adyacentes a dgkA Opiniones y gyrA
ya que están en H. pylori
, pero están flanqueados en el extremo opuesto por DCUA Opiniones y ANSB
. La FECA Opiniones y FEOB
genes, que se encuentran cerca del grupo de genes del metabolismo de acetona en el H. pylori
cepas, son ~ 69 kb de este grupo de genes en H. acinonychis
. Por lo tanto, la disposición relativa de los genes dentro de la agrupación metabolismo acetona se ha mantenido muy conservado durante la evolución de H. pylori y H.
acinonychis
a pesar del hecho de que la región adyacente en los genomas de estas dos especies ha sido objeto de . extensos reordenamientos comentario El H. pylori acxB: gato
mutante es deficiente en su capacidad para colonizar ratones Francia El acxB
gen en H. pylori SS1
, que es una cepa adaptada a ratón , fue interrumpido con un cassette de resistencia a cloranfenicol (cat
). Los cultivos de tipo salvaje H. pylori SS1
y la acxB: gato
mutante se cultivó en caldo Mueller-Hinton suplementado con suero de caballo o de un medio definido previamente descrito [22]. cantidades variables de acetona que van desde 1,3 mM a 26 mM se incluyeron en el medio de crecimiento para determinar si acetona afectado el crecimiento de cualquiera de las cepas. El crecimiento celular se controló por recuento de células viables, así como densidades ópticas de los cultivos en diversos momentos. Incluyendo acetona, ya sea en medios de crecimiento no tuvo efecto sobre la tasa de crecimiento o el rendimiento final de células de H. pylori SS1 o
acxB: Gato
mutante (datos no mostrados). El fracaso de acetona para estimular el crecimiento de H. pylori SS1
en las condiciones ensayadas no es inesperado ya que los medios de crecimiento para H. pylori
es rica muy nutriente. Estos resultados también sugieren que acxABC
no es necesario para la desintoxicación acetona
La capacidad de la acxB: Cat.
Mutante para colonizar ratones se comparó con la de la H. pylori SS1
cepa parental en dos ensayos separados. En cada ensayo, once ratones fueron inoculados con la cepa de tipo salvaje y once fueron inoculados con la acxB: Gato
mutante. Tres semanas después de la inoculación de los ratones con el H. pylori
cepas, los ratones se sacrificaron y se determinó el número de H. pylori
en los estómagos de los animales. Para los ratones que habían sido inoculados con la cepa de tipo salvaje, la mayoría de los animales (19/22 animales) tenían H. pylori
recuentos que eran muy por encima del límite de detección, lo cual fue 500 ufc por gramo de estómago (Fig. 3). El número de H. pylori en muestras
que estaban por encima del límite de detección varió de 10 4 - 10 6 ufc por gramo de estómago. La mayoría de los ratones inoculados con la acxB: Gato
mutante también tenían niveles mensurables de H. pylori gratis (15/22 animales), pero el número de H. pylori servicios asociados con estos ratones eran generalmente de uno a dos órdenes de magnitud inferior a los de los ratones que habían sido inoculados con la cepa de tipo salvaje. Un análisis estadístico de los datos utilizando una prueba de Wilcoxin Rango verificó que las diferencias en los números de H. pylori
aisladas de ratones inoculados con las dos cepas fueron significativas al nivel de confianza 99%, lo que indica que carboxilasa acetona mejorado la capacidad de H. pylori SS1
para colonizar el estómago del ratón. Dado que no hemos podido clonar el acxABC
operón que no podemos verificar por complementación que el acxB
mutación fue responsable del defecto en la colonización. Sin embargo, es poco probable que el fenotipo de la colonización de la acxB
mutante era debido a los efectos polares ya que no hay genes adicionales en el acxABC
operón en cualquiera de las tres cepas de H. pylori
cuyos genomas han sido secuenciado hasta la fecha (Fig. 1). Además, el defecto de colonización no es probable debido a la atenuación o una mutación secundaria desde construimos la acxB
mutante en un aislado fresco de la cepa SS1 se recuperó de un ratón infectado. Figura 3 ensayo de colonización del ratón de H. pylori SS1 y un isogénica acxB: cepa mutante gato. Los datos se presentan como un gráfico de dispersión de unidades formadoras de colonias por gramo de estómago como se determina por el recuento por placa. Cada punto representa el recuento de ufc de un ratón, expresado como el valor de log10 (ufc /g estómago) en el eje y. La línea de base [log10 (ufc /g estómago) = 2,7] es el límite de detección del ensayo, que representa el recuento por debajo de 500 ufc /g de estómago.
Niveles de acetona en el estómago de ratón
Puesto que los datos de la los ensayos de colonización de ratones sugirieron que la capacidad de utilizar la acetona por H. pylori
era importante para la colonización de acogida efectiva, hemos querido determinar si H. pylori
encontró niveles significativos de acetona en el estómago del ratón. Aunque los niveles de acetona se ha informado de varios fluidos corporales, nos eran conscientes de todos los informes de los niveles de acetona asociados con jugo o tejido gástrico. Por lo tanto, hemos medido los niveles de acetona asociados con tejido gástrico de ratón después de eliminar rápidamente los estómagos de los ratones y colocar inmediatamente los estómagos de los viales de suero sellados. Puesto que deseábamos para estimar los niveles de acetona que H. pylori
podría encontrar durante la infección persistente, los animales utilizados para este estudio se mantuvieron en un horario de alimentación regular y se sacrificaron por la mañana antes de recibir su asignación diaria de alimentos normales. Los viales de suero sellados que contienen los estómagos ratones se incubaron en hielo para permitir que la acetona asociado con el tejido gástrico se equilibre con la fase de gas en los viales, después de lo cual las muestras de fase gaseosa se analizaron por cromatografía de gases. Este procedimiento se realizó inicialmente a costa de sacrificar los animales y la eliminación de sus estómagos. Resultados similares, sin embargo, se obtuvieron mediante la eliminación de los estómagos de los animales vivos que habían sido anestesiados. La cantidad de acetona asociados con el tejido gástrico para cada ratón individual variado, que van desde ~ 10-110 μmols acetona por gramo de tejido de peso en húmedo (Fig. 4), con la mayoría de los valores (6/7) que cae en el rango de 10 y 35 μmols acetona por gramo de peso húmedo de tejido. Estos datos sugieren que cantidades milimolares de acetona se asocian con el tejido gástrico de ratón y podrían estar disponibles como fuente de carbono o la energía potencial de H. pylori
. Este nivel de acetona asociado con el tejido gástrico de ratón era más alto de lo que esperábamos ya que los niveles de cuerpos cetónicos en suero varían en los seres humanos y otros mamíferos varían generalmente de < 0,5 mM a unos pocos milimolar [23]. La acetona se produce en los mamíferos por la descarboxilación espontánea de acetoacetato y esta descarboxilación se mejora a un pH bajo, y así acetona pueda acumularse en el estómago debido a la acidez gástrica. Figura 4 niveles de acetona asociadas con tejido gástrico ratón. los niveles de acetona estómago se determinaron para tres ratones después de sacrificar a los animales e inmediatamente retirar sus estómagos (post-mortem), y durante cuatro ratones que fueron anestesiados después de lo cual sus estómagos fueron retirados (pre-mortem). estómagos de ratón escindidos se colocaron inmediatamente en viales sellados que a continuación se colocaron en hielo durante al menos 30 minutos para permitir la acetona asociado con el tejido gástrico se equilibre con la fase gas. los niveles de acetona en las fases de gas de los viales se midieron por cromatografía de gases y estimaron a partir de curvas estándar generadas para cada vial. Cada valor representa un promedio de al menos tres mediciones y las barras de error indican la desviación estándar para cada muestra.
Discusión
Ofrecemos pruebas de que H. pylori
poseen una carboxilasa acetona funcional como postulado previamente por Ensign y co -los trabajadores [15]. El H. pylori acxABC
operón está cerca de la scoAB Opiniones y fadB
los genes que codifican las enzimas SCOT y acetoacetil.CoA tiolasa. Por lo tanto, este grupo de genes codifica un conjunto de enzimas capaces de metabolizar acetona a acetil-CoA. Acetil-CoA producido a partir de acetona y acetoacetato podría alimentar en el ciclo de Krebs para proporcionar energía para H. pylori
. Como se observa por Pflock y compañeros de trabajo la acxABC
operón y otros genes asociados con el metabolismo acetona están presentes en H. acinonychis
[24]. Estos genes están ausentes, sin embargo, en la otra estrechamente relacionada ε-Proteobacteria cuyos genomas han sido secuenciados hasta el momento, que incluye Helicobacter hepaticus
, Campylobacter jejuni
, Thiomicrospira denitrificans
, y Wolinella succinogenes
. La adquisición y el mantenimiento de la agrupación de genes del metabolismo de acetona en el H. pylori y H.
acinonychis
puede estar relacionado con el hecho de que, a diferencia de estos otros relacionados ε-Proteobacteria, que colonizan la mucosa del estómago. La agrupación de estos genes y la ausencia de genes ortólogos en otras estrechamente relacionadas ε-Proteobacteria podrían indicar la posible adquisición de estos genes por H. pylori y H.
acinonychus
a través de la transferencia de genes lateral. El contenido de G + C de este grupo de genes del metabolismo de acetona en H. pylori
es ligeramente superior a la media de todo el genoma, pero esto parece debido a los productos de estos genes es muy rica en glicina (~ 10% comparar al 6% media del genoma). Por otra parte, las características de composición de dichos genes, como dinucleótidos abundancias relativas y el sesgo de codones, no son indicativos de transferencia lateral reciente de esta región [25] (J. Mrázek, comunicación personal).
Jungblut y compañeros de trabajo informó de que H . pylori
AcxC (HP0698) reacción cruzada con anticuerpos de un paciente con adenocarcinoma, lo que indica que el H. pylori acxABC
operón se expresa en el huésped [26]. Por otra parte, se muestra aquí que H. pylori
puede encontrar niveles significativos de acetona en el estómago del ratón y por lo que este compuesto puede servir como un importante donante de electrones respiratoria para la bacteria en el huésped. Consistente con esta hipótesis, la H. pylori acxB
mutante se redujo significativamente en su capacidad para colonizar el estómago de ratón que inferimos resulta de la incapacidad del mutante de utilizar acetona como fuente de energía. La incapacidad de acetona para estimular el crecimiento de H. pylori SS1
en cultivo líquido pueda resultar de la insuficiencia de los medios de cultivo utilizados para imitar las condiciones de crecimiento encontradas por la bacteria colonizar la mucosa gástrica. Una hipótesis alternativa para el defecto de colonización de la acxB
mutante es que se necesita carboxilasa acetona para la desintoxicación de acetona. Sin embargo, nuestra incapacidad de observar ninguna inhibición en el crecimiento de la acxB
mutante mediante la adición de acetona en el medio de cultivo argumenta en contra de esta última hipótesis. Otra posibilidad es que los productos de la acxABC
operón catalizan una reacción desconocida que es importante para la supervivencia o crecimiento de células de H. pylori
en la mucosa gástrica. Además de la caracterización bioquímica de los productos de la H. pylori acxABC
operón debe ayudar a distinguir entre estos possibililties.
Un análisis del transcriptoma reciente de H. pylori
26695 utilizando toda una microarrays genoma sugiere que el regulador de la respuesta HP1021 activado fuertemente la transcripción de acxABC
y scoAB
, y la transcripción activada de fadA
y hp0693 en menor medida [24]. Los autores de este estudio mostraron que HP1021 une la región reguladora del promotor de acxABC
, lo que sugiere que este regulador de la respuesta media directamente sus efectos sobre la transcripción de acxABC
y que los genes dentro de la agrupación metabolismo acetona son parte de un regulón controlada por HP1021. Pflock y sus colegas identificaron 79 genes en H. pylori
26695, cuya expresión se modificó en el mutante HP1021 - 51 genes fueron transcritas en los niveles más bajos en el mutante, mientras que 28 genes se expresaron en niveles superiores [24]. HP1021 difiere de la mayoría de los reguladores de respuesta en que carece del residuo de aspartato de aceptación de fosfato altamente conservada, y una histidina quinasa afín para HP1021 no ha sido identificado. Existen informes contradictorios sobre la transcripción de HP1021 en respuesta a pH ácido, así como en la transcripción de H. pylori acxABC
en respuesta a bajar el pH [27-29]. Estas diferencias pueden deberse a la forma en que se cultivaron las bacterias. Aunque estos informes conflicto con respecto a la transcripción de la HP1021 en respuesta a un pH ácido, los resultados de ambos estudios indican que las condiciones que conducen a la baja regulación de la HP1021 resultado un aumento de la expresión de acxABC
. Esto parece contrario a la intuición le dio el papel aparente de HP1021 en la activación de la transcripción de acxABC
. México La única otra bacteria para los que se ha examinado la regulación del operón acxABC
es X. autotrophicus
. control transcripcional de acxABC
en X. autotrophicus
difiere de la de H. pylori
. X. autotrophicus
carece de un homólogo de HP1021, sino más bien regula la transcripción de acxABC
través σ 54 (RpoN) y el activador 54 dependiente de σ AcxR [15]. Aunque H. pylori posee
σ 54, el acxABC
operón no es parte de la H. pylori
RpoN regulon [30].
A pesar de nuestra observación de que la interrupción de acxB
afecta negativamente a la colonización de los ratones por H. pylori SS1
, estudios recientes genoma de microarrays enteros con cincuenta y seis cepas representativas a nivel mundial de H. pylori
y cuatro H. acinonychis
cepas indicaron que el acxABC
genes no están presentes en todas las cepas de H. pylori
[31]. Sería interesante determinar si las cepas que carecen de acxABC ¿Cuáles son menos competitivos en la colonización de sus huéspedes naturales que las cepas que poseen estos genes. Alternativamente, cepas que carecen de acxABC
puede tener adaptaciones que compensan la falta de actividad carboxilasa acetona. Los resultados de los estudios de microarrays por Gressmann y sus colegas indicaron que scoAB
, fadA
, HP0693 y HP0694 estaban presentes en todo el H. pylori y H.
acinonychis
cepas examinadas [31]. De este modo, la presión selectiva de mantener la capacidad de utilizar acetoacetato como un donador de electrones potencial en H. pylori y H.
acinonychis
parece ser mayor que para el metabolismo de acetona.
Conclusión comentario El H . pylori acxABC
operón probable codifica la carboxilasa de acetona que cataliza la conversión de acetona a acetoacetato y está íntimamente asociada con los genes cuyos productos se predice para catalizar la conversión secuencial de acetoacetato a acetil-CoA. Inspección de los genomas de otros estrechamente relacionados ε-Proteobacteria sugiere que los genes implicados en el metabolismo de acetona sólo están presentes en las bacterias dentro de este subfilo que colonizan la mucosa gástrica. El acxABC
operón no era esencial para la colonización del ratón por H. pylori SS1
, pero si pareció aumentar la colonización. Además de la caracterización de la putativo H. pylori
acetona carboxilasa y los productos de los otros genes dentro del grupo de genes del metabolismo acetona debe dar una idea de cómo los cuerpos cetónicos desde el host contribuyen a las economías del metabolismo de H. pylori y H
. acinonychis
y cómo estos compuestos impacto de la capacidad de estas bacterias para colonizar sus anfitriones.
Métodos
cepas bacterianas y medios
plásmido construcción y la clonación se realizó en E. coli cepa DH5
que se cultivaron en medio Luria-Bertani a 37 ° C. H. pylori cepa 26695
se utilizó como molde para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). H. pylori SS1
se utilizó como la cepa de tipo salvaje para todos los experimentos y se cultivó en cualquiera de agar sangre o agar de soja tríptico suplementado con 5% de suero de caballo (TSA de suero) a 37 ° C bajo una atmósfera de 4% O 2, 5% de CO 2 y el 91% de N 2. Cuando se cultivan en un medio líquido, el H. pylori
cultivos se hicieron crecer en caldo de Mueller-Hinton suplementado con 5% de suero de caballo y 30 mg /ml de bacitracina o el medio de crecimiento definido descrito por Bruggrabber y compañeros de trabajo [22]. Culturas (10-15 ml cultivan medio) se cultivaron en 150 ml viales de suero sellados con teflón discos 20 mm /silicona y tapas de aluminio y bajo una atmósfera de 4% O 2, 5% de CO 2, 10 % H 2, 81% N 2. A menos que se indique lo contrario, cuando los antibióticos se incluyeron en el medio se añadieron a las concentraciones siguientes: 100 g /ml de ampicilina, 30 mg /ml de cloranfenicol, 200 mg /ml de bacitracina 10 mg /ml de vancomicina, y 10 mg /ml de anfotericina B. La inactivación de
acxB gratis (HP0696) en H. pylori SS1

Un fragmento de ADN de 2,3 kb que lleva acxB
se amplificó por PCR a partir de H. pylori cepa 22695
y clonado en pGEM-T (Promega). Un gato
casete se introdujo en este plásmido en un sitio Eco
47III situado aproximadamente en el centro de la clonado acxB
. El plásmido resultante se utilizó como un vector suicida para la inactivación de la copia cromosómica de acxB
en H. pylori SS1
. El vector suicida se introdujo en H. pylori
cepas ATCC 43504 y SS1, una cepa que puede colonizar ratones. Debido a que el paso repetido de H. pylori cepa SS1
en medio se ha informado a resultar en la pérdida de la infectividad en ratones, la acxB
mutante se construyó en un aislado fresco de la cepa SS1 se recuperó de un ratón infectado. El número de pasajes de acxB
mutante en la cepa SS1 era limitada y registrada, y el mutante se almacenó congelado a -80 ° C. La cepa SS1 parental se mantuvo y se almacena congelado de una manera idéntica. Se confirmó por PCR que la copia cromosómica de acxB
fue interrumpido por intercambio alélico con la copia por plásmido del gen usando un conjunto de cebadores que flanqueaban el sitio de la interrupción. Las curvas de crecimiento
para H. pylori
cepas
se suspendieron H. pylori
células de placas TSA de suero en el que las cepas habían sido rayas en el día anterior en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se utilizaron para inocular medio líquido a un OD 600 de 0,03. Donde se indique, se añadió acetona asépticamente al medio. Se tomaron muestras a los tiempos y las densidades de células diferentes se midieron mediante dispersión de luz a OD 600. Alternativamente, los recuentos de células viables se determinaron después de dilución en serie de las muestras y placas en TSA-suero. Después de 4-5 días de incubación, el número de unidades formadoras de colonias (CFU) se determinaron para las placas.
Ratón colonización
ensayos de colonización de ratón se realizaron esencialmente como se describe anteriormente [32]. Estos procedimientos cumplen con las directrices federales pertinentes y las políticas institucionales para el cuidado y manejo de animales de laboratorio. Brevemente, se recogieron H. pylori
células después de 48 h de crecimiento en placas de agar sangre y se suspendieron en PBS hasta una DO 600 de 1,7. Headspace en el tubo se purgó con argón para reducir al mínimo la exposición al oxígeno.

• Curación potencial de Picrorhiza kurroa (Scrofulariaceae) rizomas contra la úlcera gástrica inducida por indometacina: un exploration.
• la inhibición dependiente de la dosis de la lesión gástrica por hidrógeno en el agua potable electrolizada alcalina water