Det humane mage-patogen Helicobacter pylori har en potensiell aceton karboksylase som forbedrer dens evne til å kolonisere mus

Den menneskelige mage patogen Helicobacter pylori
har et potensial aceton karboksylase som forbedrer sin evne til å kolonisere mus
Abstract
Bakgrunn
Helicobacter pylori
koloniserer den menneskelige magen og er agens med mavesår . Alle tre H. pylori
stammer som har blitt sekvensert oppdatert inneholde en potensiell operon hvis produkter aksje homologi med subenheter aceton karboksylase (kodet av acxABC
) fra Xanthobacter autotrophicus
belastning Py2 og Rhodobacter capsulatus
belastning B10. Aceton karboksylase katalyserer omdannelsen av aceton for å acetoacetat. Gener oppstrøms av den antatte acxABC
operon koder enzymer som omdanner acetoacetate til Acetoacetyl-CoA, som metaboliseres ytterligere å generere to molekyler acetyl-CoA. Search Results
å finne ut om H. pylori acxABC
operonet har en rolle i verts kolonisering den acxB
homolog i musetilpasset H. pylori
SS1 stamme ble inaktivert med et kloramfenikol-resistens (katt
) kassett. I mus kolonisering studier antallet av H. pylori
utvunnet fra mus inokulert med den acxB: katt
mutant var generelt en til to størrelsesordener lavere enn de som utvinnes fra mus inokulert med foreldrestammen. En statistisk analyse av data ved hjelp av en Wilcoxin Rank test indikerte forskjellene i antall H. pylori
isolert fra mus inokulert med de to stammene var signifikante på 99% konfidensintervall. Nivåer av aceton forbundet med mage vev fjernet fra infiserte mus ble målt og funnet å variere fra 10-110 μmols per gram våtvekt vev
Konklusjon
kolonisering defekt i acxB. Katt
mutant antyder en rolle for acxABC
operonet i overlevelse av bakterien i magen. Produkter av H. pylori acxABC
operon kan fungere primært i aceton anvendelse eller kan katalysere en reaksjon relatert som er viktig for overlevelse eller vekst i verten. H. pylori
støter signifikante nivåer av aceton i magen som det kunne bruke som en potensiell elektrondonor for microaerobic åndedrett.
Bakgrunn
Helicobacter pylori
er en mikroaerofil, gram-negativ bakterie som er en betydelig patogen av human gastrisk mukosa [1, 2]. Kolonisering av gastrisk mucosa av H. pylori
fører til kronisk betennelse som kan utvikle seg til en rekke sykdommer, innbefattende kronisk gastritt, peptisk sår, mage cancer og slimhinneassosierte lymfom [3-5]. I fravær av antimikrobiell behandling, verten er utsatt for en levetid H. pylori
infeksjon i mageslimhinnen.
Evne H. pylori
å vedvare i magesekken hos mennesket i lengre perioder indikerer at det er godt tilpasset til å tilegne seg de næringsstoffene den trenger for vekst i denne unike nisje. For eksempel, slimete laget av musen magen inneholder betydelige mengder av molekylært hydrogen (17-93 pM) som stammer fra metabolsk aktivitet av mikrobielle floraen i tykktarmen [6]. H. pylori
er i stand til å utnytte denne molekylært hydrogen som en elektrondonor for microaerobic åndedrett og en funksjonell hydrogenase er nødvendig for vellykket kolonisering av mus av H. pylori
[6, 7]. I motsetning til mange hydrogen-oksiderende bakterier, imidlertid, H. pylori
er ikke i stand til å autotrofe CO 2 fiksering.
Flere studier har undersøkt muligheten av H. pylori
å utnytte ulike karbonkilder. H. pylori
har en begrenset evne til å tilegne seg og forbrenne sukkere, en observasjon som er i overensstemmelse med analysen av de genomiske sekvenser av H. pylori
-stammer 22695 og J99 [8]. Glukose er det eneste karbohydrat som H. pylori
er i stand til å benytte som den gjør gjennom Entner-Doudoroff veien [9, 10]. Aminosyrer også tjene som karbonkilder for H. pylori
og benyttes fortrinnsvis av H. pylori
i vekstmedium inneholdende en blanding av glukose og aminosyrer [9, 11]. Pyruvat, et nøkkelmellomprodukt i det sentrale metabolisme, ser ut til å bli generert hovedsakelig fra laktat, alanin og serin i stedet for glukose i H. pylori product: [12, 13]. Pyruvat omdannes til acetyl-CoA av pyruvat: flavodoxin oksidoreduktase i H. pylori
, som deretter kan mates inn i trikarboksylsyre (TCA) syklus [14]. I tillegg kan alanin, laktat, acetat, formiat og suksinat fremstilles ved H. pylori
celler inkubert aerobt [12]. Produksjonen av acetat og formiat som metabolske produkter antyder eksistensen av en blandet syre fermenteringsvei i H. pylori
, selv om oksygen er nødvendig for vekst av bakterien [12].
Analyse av genomsekvenser i H . pylori
stammer 26695, J99 og HPAG1 avslørte en potensiell operon av tre gener (utpekt som HP0695, HP0696 og HP0697 i H. pylori
26695) produktene som deles 50-63% aminosyre identitet med β , α, og y-subenheter aceton karboksylase fra Xanthobacter autotrophicus
belastning Py2 og Rhodobacter capsulatus
belastning B10 [15]. Homologer aceton karboksylase finnes i en rekke bakterier, men X. autotrophicus Kjøpe og R. capsulatus
enzymer er best karakterisert. Aceton karboksylase katalyserer ATP-avhengig karboksylering av aceton til acetoacetat og er nødvendig for vekst av X. autotrophicus
og R. capsulatus
med aceton som den eneste karbonkilde og elektrondonor for respirasjon [15-17]. X. autotrophicus
aceton karboksylase har en høy affinitet for aceton (Km = 8 uM), men omløpshastighet til enzymet er meget langsom (~ 45 per min) [15]. For å kompensere for den lave omsetningshastighet aceton karboksylase, X. autotrophicus
produserer høye mengder av enzymet (17-25% av total løselig protein) når de dyrkes på aceton [15]
Gener som ligger i nærheten av H. pylori
HP0695-HP0696-HP0697 operon koder for enzymer vist seg å konvertere acetoacetat til acetoacetyl-CoA, som metaboliseres videre til acetyl-CoA [8, 18]. Aceton, acetoacetat og 3-β-hydroksybutyrat er ketonlegemer som er produsert av pattedyr perivenøs hepatocytter i løpet av fettsyre nedbrytning og blir anvendt som elektrondonorer for respirasjon når karbohydrater ikke er lett tilgjengelige [19]. Akkurat som ketonlegemer er viktige energikilder for mennesker når karbohydrater ikke er tilgjengelige, kan disse forbindelsene tjene som luftveiselektrondonorer for H. pylori
kolonmageslimhinnen. For å finne ut om HP0695-HP0696-HP0697 operon har en rolle i verts kolonisering vi inaktivert HP0696 i H. pylori
belastning SS1. Den HP0696 mutant ble svekket i sin evne til å kolonisere mus tyder på at aceton carboxylation eller et beslektet enzymatisk aktivitet katalysert av produkter av HP0695-HP0696-HP0697 operon er en viktig medvirkende faktor til å være vert kolonisering
. Resultater
H. pylori
inneholder et sett av gener forutsagt å være involvert i metabolismen aceton
De tre H. pylori
stammer som genomer har blitt sekvensert inneholder en klynge av åtte konserverte gener innenfor et ~ 10 kb DNA-sekvens, hvorav seks koder for enzymer som anslås å forbrenne aceton og acetoacetat til acetyl-CoA (fig. 1 og 2). Helicobacter acinonychis
, et nært beslektede arter som infiserer store kattedyr, også besitter dette genet klyngen. Som angitt ovenfor, tre av disse genene deler homologi med acxABC
, selv om de første to genene i operonet er angitt som gener som koder for hydantoin utnyttelse protein A og methylhydantoinase, henholdsvis i den kommenterte H. pylori
genomer. Hydantoinases katalyserer hydrolysen av 5-leddede ringer via hydrolyse av en intern imid-binding og har ofte relativt bred substratspesifisitet. Av proteiner i databasen som biokjemiske funksjoner har blitt påvist, BLAST analyse viste at de forut produkter av H. pylori
gener tettest matche de av Xanthobacter
sp. Py2 acxABC
operonet (59-68% aminosyre identitet over hele lengden av de tre forutsagte subenheter). For det meste har blitt sekvensert H. pylori Hotell og H. acinonychis
genomer siste gen av operon er kommentert som acxC product: [20, 21]. Dermed H. pylori
HP0695-HP0696-HP0697 operon koder sannsynligvis aceton karboksylase snarere enn hydantoinase, og vi derfor henvise til dette operon som acxABC
. Figur 1 Organisering av de som er involvert i aceton metabolisme i H. pylori og H. gener acinonychus stammer. Gene betegnelser angis under hver pil (ikke trukket til skala). Åpne leserammer som ikke ble gitt et gen betegnelse på de kommenterte genomsekvenser er merket med enten en hp betegnelse (for H. pylori
26695), en JHP betegnelse (for H. pylori
J99), eller bare åpen leseramme nummer (for H. pylori
HPAG1 og A. acinonychis
belastning Sheeba). Ortologe gener i de fire stammer er de samme farge. Genene jhp0628 i H. pylori
J99 og 0671 i H. pylori
HPAG1 tilsvare en fusjon av hp0688 og hp0689 fra H. pylori
26695. H. pylori
J99 og HPAG1 har to gener innenfor dette området, jhp0629 (HPAG1_0672) og jhp0630 (HPAG1_0672), som koder for en type II-DNA metyltransferase og en type II-restriksjonsenzym, henholdsvis, og er ikke funnet i H. pylori
26695. Funksjonene til produktene av genene i aceton metabolismen klyngen er beskrevet i teksten. De foreslåtte funksjoner av produkter av de omkringliggende genene er: fecA
, jern (III) dicitrat transport protein; feoB
, jern (II) transport protein; dgkA
, diacylglycerol kinase; Gyra
, subenhet En av DNA gyrase; dcuA
, anaerob C4-dicarboxylate transporter; og ansB
, asparaginase II.
Figur 2 Forslag vei for aceton utnyttelse i H. pylori. Den foreslåtte vei for omdannelse av aceton til acetyl-CoA i H. pylori
og H. acinonychis
er vist. Reaksjoner og gener som koder for enzymer som er ansvarlig for kata hver reaksjon indikeres
To andre gener innenfor genet klyngen, SCoA plakater (HP0691) og scoB plakater (HP0692), kode succinyl CoA. Acetoacetat CoA-transferase ( SCOT), som katalyserer omdannelsen av acetoacetat pluss suksinyl-CoA til acetoacetyl-CoA-pluss-suksinat [18]. Acetoacetyl-CoA produsert av SCOT metaboliseres ytterligere ved acetoacetyl-CoA thiolase, som kodes av Fada plakater (HP0690; genet er kommentert som THL
i H. pylori
J99 og atoB
i H. pylori
HPAG1 og H. acinonychis
), for å generere to molekyler av acetyl-CoA fra acetoacetyl-CoA-pluss-koenzym A (CoA) [8]. De to gjenværende gener innenfor denne gruppen, HP0693 og HP0694, blir forutsagt å kode for et kortkjedet fettsyre permease og et ytre membranprotein, henholdsvis, og kan fungere i transport av acetoacetat.
De åtte gener innenfor dette antatte aceton metabolisme klynge er anordnet i samme forhold til hverandre i de tre H. pylori
stammer, men klyngen er orientert i en av de to mulige retninger (fig. 1) som indikerer forekomsten av en DNA-inversjon i dette område i løpet av utviklingen av H. pylori
. Innretning av DNA-sekvenser fra de tre stammene smalere området av inversjon til ~ 40 bp nedstrøms for acxC
homolog og ~ 160 bp oppstrøms for startkodonet for Fada
(data ikke vist). Ingen store direkte eller inverterte repetisjoner er funnet i nærheten av disse områdene som kan ha vært involvert i inversjon, og slik at vi ikke kan spekulere i mekanismen for denne inversjon. For H. pylori
stammer som J99 og HPAG1, men ikke 26 695, er det et forutsagt type II-DNA metyltransferase (jhp0629 og HPAG1_0673) og en type II-restriksjonsenzym (jhp0630 og HPAG1_0672) tilstøtende til den antatte aceton metabolisme-genklusteret.
H. acinonychis
besitter den antatte aceton metabolisme genet klynge og genene i klyngen er i samme retning som de i H. pylori
J99. I H. acinonychis
disse genene er i tilknytning til dgkA Hotell og Gyra
som de er i H. pylori
, men er flankert på den motsatte enden av dcuA Hotell og ansB
. Den fecA Hotell og feoB
gener, som er plassert i nærheten av aceton metabolisme genet klyngen i H. pylori
stammer, er ~ 69 kb fra dette genet klyngen i H. acinonychis
. Således har den relative anordning av genene innenfor aceton metabolismen klyngen forble bemerkelsesverdig konservert i løpet av utviklingen av H. pylori
og H. acinonychis
til tross for det faktum at det tilstøtende område i genomene til disse to artene har gjennomgått . omfattende rearrangements
H. pylori acxB: cat
mutant er mangelfull i sin evne til å kolonisere mus
acxB
genet i H. pylori
SS1, som er en mus-tilpasset belastning ble avbrutt med en kloramfenikol resistens (katt
) kassett. Kulturer av villtype H. pylori
SS1 og acxB: katt
mutant ble dyrket i Mueller-Hinton sjy supplert med hesteserum eller en tidligere beskrevet definert medium [22]. Varierende mengder av aceton i området fra 1,3 mM til 26 mM ble inkludert i dyrkningsmedier for å bestemme om aceton påvirket vekst av enten belastning. Cellevekst ble overvåket ved levedyktige celler, så vel som optiske densiteter av kulturer ved forskjellige tidspunkter. Inkludert aceton i enten vekstmedier hadde ingen effekt på veksten eller endelig celle utbyttet av H. pylori
SS1 eller acxB: cat
mutant (data ikke vist). Svikt i aceton for å stimulere veksten av H. pylori
SS1 på de vilkår som ble testet er ikke uventet ettersom vekstmedier for H. pylori
er svært næringsrikt. Disse funnene tyder også på at acxABC
ikke er nødvendig for aceton avgiftning
evne acxB. Katt
mutant å kolonisere mus ble sammenlignet med den foreldre H. pylori
SS1 belastning i to separate studier. I hvert forsøk ble elleve mus inokulert med vill-type-stammen og elleve ble inokulert med den acxB: katt
mutant. Tre uker etter inokulering av musene med H. pylori-
-stammer, ble musene avlivet, og antallet av H. pylori
i magen på dyrene ble bestemt. For mus som var blitt inokulert med vill-type stamme, de fleste av dyrene (19/22 dyr) var H. pylori
tellinger som var godt over påvisningsgrensen, som var 500 cfu per gram mage (fig. 3). Antallet av H. pylori
i prøver som var over deteksjonsgrensen varierte fra 10 4-10 6 cfu per gram mage. Mesteparten av musene inokulert med acxB: katt
mutant også hadde målbare nivåer av H. pylori plakater (15/22 dyr), men numrene på H. pylori
knyttet til disse musene var generelt en til to størrelsesordener lavere enn de i mus som var blitt inokulert med villtypestammen. En statistisk analyse av dataene ved hjelp av en Wilcoxin Rank test bekreftet at forskjellene i antallet av H. pylori
isolert fra mus som er inokulert med de to stammene var signifikant på 99% konfidensnivå, noe som indikerer at aceton karboksylase forbedret evne H. pylori
SS1 å kolonisere mus magen. Siden vi ikke var i stand til å klone acxABC
operon vi ikke kunne bekrefte ved komplemente at acxB
mutasjonen var ansvarlig for mangelen i kolonisering. Imidlertid er det usannsynlig at den kolonisering fenotypen til acxB
mutant skyldes polare effekter, ved at det ikke er noen ytterligere gener i acxABC
-operonet i noen av de tre H. pylori
stammer hvis genomer har vært sekvensert for å dato (fig. 1). Dessuten er den koloniser defekten ikke sannsynlig på grunn av dempning eller en sekundær mutasjon, siden vi konstruerte acxB
mutanten i en frisk isolat av stamme SS1 gjenvunnet fra en infisert mus. Figur 3 Mouse kolonisering analysen av H. pylori SS1 og en isogen acxB: katt mutant belastning. Data er presentert som et punktplott av kolonidannende enheter per gram av magen som bestemmes av platetellinger. Hver flekk representerer antall kolonidannende enheter fra en mus, uttrykt som den verdi av log10 (cfu /g mage) i Y-aksen. Grunnlinjen [log10 (cfu /g mage) = 2,7] er påvisningsgrensen for analysen, som representerer telleverdien er lavere enn 500 cfu /g mage.
Aceton nivåer i mus magen
Siden dataene fra mus kolonisering analyser antydet at evnen til å utnytte aceton av H. pylori
var viktig for effektiv vert kolonisering, ønsket vi å finne ut om H. pylori
oppstått betydelige aceton nivåer i musen magen. Selv aceton nivåer har blitt rapportert av ulike kroppsvæsker, var vi ikke klar over noen rapporter om aceton nivåer forbundet med magesaft eller vev. Derfor har vi målt aceton nivåer forbundet med mus mage vev etter raskt fjerne magene fra mus og umiddelbart plassere magen i forseglede serum ampuller. Siden vi ønsket å estimere aceton nivåer som H. pylori
kunne oppstå under vedvarende infeksjon ble dyrene anvendt for denne studien opprettholdt på en vanlig ernæringsplan og ble avlivet om morgenen før de får sin normale daglige mat tildeling. De forseglede ampuller inneholdende serum ble musene magene ble inkubert på is for å tillate aceton forbundet med gastrisk vev til likevekt med gassfasen i ampullene, hvoretter gassfase-prøver ble analysert ved gasskromatografi. Denne fremgangsmåten ble utført først ved å ofre dyrene og fjerning av magen. Lignende resultater ble imidlertid oppnådd ved å fjerne deres mager av levende dyr som var blitt bedøvet. Mengden av aceton i forbindelse med gastrisk vev for hver enkelt mus varierte, som strekker seg fra ~ 10-110 μmols aceton per gram våtvekt vev (Fig. 4), med de fleste verdier (6/7) som faller i området fra 10 og 35 μmols aceton per gram våtvekt vev. Disse dataene tyder på at millimolare mengder av aceton er forbundet med mus gastrisk vev og kan være tilgjengelig som en potensiell karbon eller energikilde for H. pylori
. Dette nivået av aceton forbundet med muse gastrisk vev var høyere enn hva vi forventet siden nivåene av serum ketonlegemer variere i mennesker og andre pattedyr generelt variere fra < 0,5 mM til noen få millimolar [23]. Aceton produseres i pattedyr ved spontan dekarboksylering av acetoacetat, og dette dekarboksylering er forbedret ved lav pH, og så aceton kan akkumuleres i magen på grunn av gastrisk surhet. Figur 4 Aceton nivåer forbundet med musen mage vev. Mage aceton-nivåer ble bestemt i tre mus etter å ofre dyrene og øyeblikkelig fjerning av magen (post mortem), og for fire mus som ble bedøvet, hvoretter maven ble fjernet (pre-inspeksjon). Skåret ut mus magene ble anbrakt umiddelbart i forseglede ampuller som deretter ble plassert på is i minst 30 min for å tillate aceton forbundet med gastrisk vev til likevekt med gassfasen. Aceton nivåer i gassfasene i ampullene ble målt ved gasskromatografi og beregnet fra standardkurver generert for hver ampulle. Hver verdi representerer et gjennomsnitt på minst tre målinger og feilfelt indikerer standardavvik for hver prøve.
Diskusjon
Vi gir bevis for at H. pylori
ha en funksjonell aceton karboksylase som tidligere postulert av Ensign og co -workers [15]. Den H. pylori acxABC
operon nær scoAB Hotell og FADB
gener som koder for enzymer SCOT og acetoacetyl-CoA thiolase. Således koder for dette genklusteret et sett av enzymer som er i stand til å omdanne aceton til acetyl-CoA. Acetyl-CoA produsert fra aceton og acetoacetate kunne mate inn i TCA syklus for å gi energi til H. pylori
. Som observert ved Pflock og medarbeidere den acxABC
operonet og andre gener assosiert med aceton metabolisme er tilstede i H. acinonychis product: [24]. Disse genene er fraværende, men i den andre nært beslektede ε-Proteobacteria hvis genomer har blitt sekvensert så langt, som inkluderer Helicobacter hepaticus
, Campylobacter jejuni
, Thiomicrospira denitrificans
, og Wolinella succinogenes
. Erverv og vedlikehold av aceton stoffskiftet clusteret i H. pylori Hotell og H. acinonychis
kan være relatert til det faktum at, i motsetning til disse andre relaterte ε-Proteobacteria, de kolonisere mageslimhinnene. Clustering av disse genene og fravær av ortologe gener i andre nært beslektede ε-Proteobacteria kan indikere mulig oppkjøp av disse genene av H. pylori Hotell og H. acinonychus
gjennom lateral genoverføring. G + C innholdet i denne klyngen av aceton metabolisme gener i H. pylori
er litt høyere enn gjennomsnittet for hele genomet, men dette synes grunn til produkter av disse genene er svært rik på glysin (~ 10% sammenligne til 6% genom gjennomsnitt). Videre komposisjons egenskapene til disse genene, slik som dinukleotidpolyfosfater relative hopetall og kodon bias, er ikke resultatet av siste lateral overføring av denne regionen [25] (J. Mrázek, personlig meddelelse).
Jungblut og medarbeidere rapporterte at H . pylori
AcxC (HP0698) kryss-reagerte med antistoffer fra en pasient adenokarsinom, noe som indikerer at H. pylori acxABC
operonet blir uttrykt i verts [26]. Dessuten, viser vi her at H. pylori
kan støte på betydelige nivåer av aceton i mus magen og så denne forbindelse kan fungere som en viktig respiratorisk elektrondonor for bakterien i verten. I overensstemmelse med denne hypotesen ble den H.pylori acxB
mutant signifikant redusert i sin evne til å kolonisere mus magen som vi slutte resultater fra manglende evne av det mutante å anvende aceton som energikilde. Manglende evne til aceton for å stimulere veksten av H. pylori
SS1 i flytende kultur kan skyldes svikt i vekstmedier som brukes til å etterligne vekstvilkår støtt av bakterien når kolonmageslimhinnen. En alternativ hypotese for kolonisering defekt i acxB
mutant er at aceton karboksylase er nødvendig for avgiftning av aceton. Imidlertid vår manglende evne til å observere noen inhibering i vekst av acxB
mutant ved tilsetning av aceton i kulturmediet argumenterer mot denne sistnevnte hypotesen. En annen mulighet er at produktene av den acxABC
operonet katalysere en ukjent reaksjon som er viktig for overlevelse eller cellevekst av H. pylori
i mageslimhinnen. Videre biokjemisk karakterisering av produktene av H. pylori acxABC
operon bør bidra til å skille mellom disse possibililties., En fersk transkriptomet analyse av H. pylori
26 695 ved hjelp av en hel genom microarray antydet at reaksjonen regulator HP1021 sterkt aktivert transkripsjon av acxABC Hotell og scoAB
, og aktivert transkripsjon av Fada Hotell og hp0693 i mindre grad [24]. Forfatterne av denne studien viste at HP1021 binder arrangøren regulatoriske regionen acxABC
, noe som tyder på at dette svaret regulator medierer direkte effektene på transkripsjon av acxABC Hotell og at genene innenfor aceton stoffskiftet klyngen er en del av en av vektorene kontrollert av HP1021. Pflock og kolleger identifisert 79 gener i H. pylori
26695 hvis uttrykket ble endret i HP1021 mutant - 51 gener ble transkribert på lavere nivåer i mutant mens 28 gener ble uttrykt på et høyere nivå [24]. HP1021 skiller seg fra de fleste andre respons regulatorer i at det mangler svært konservert fosfat akseptere aspartat rester, og en beslektet histidin kinase for HP1021 har ikke blitt identifisert. Det er motstridende rapporter om transkripsjon av HP1021 i respons til sur pH-verdi, samt på transkripsjonen av H. pylori acxABC
i respons for å senke pH-[27-29]. Disse forskjellene kan skyldes den måte på hvilken bakteriene ble dyrket. Selv om disse rapporter i konflikt med hensyn til transkripsjon av HP1021 i respons til sur pH, resultater fra begge studier indikerer at forhold som fører til nedregulering av HP1021 resultat i økt ekspresjon av acxABC
. Dette synes counterintuitive gitt tydelig rolle HP1021 i å aktivere transkripsjon av acxABC
.
Eneste bakterien som regulering av acxABC
operon har blitt undersøkt er X. autotrophicus
. Transkripsjonen kontroll av acxABC
i X. autotrophicus
forskjellig fra den i H. pylori
. X. autotrophicus
mangler en homolog av HP1021, men snarere regulerer transkripsjon av acxABC
via σ 54 (RpoN) og σ 54-avhengige aktivator AcxR [15]. Selv H. pylori
besitter σ 54, er den acxABC
operon ikke en del av H. pylori
RpoN vektorene [30].
Til tross for vår observasjon at forstyrrelse av acxB
påvirker kolonisering av mus av H. pylori
SS1, siste hele genomet microarray studier med femtiseks globalt representative stammer av H. pylori Hotell og fire H. acinonychis
stammer indikerte at acxABC
gener er ikke til stede i det hele tatt H. pylori
stammer [31]. Det ville være interessant å finne ut om de isolater mangler acxABC
er mindre konkurransedyktige i kolonisere deres naturlige verter enn stammer som besitter disse genene. Alternativt stammer som mangler acxABC
kan ha tilpasninger som kompenserer for mangelen på aceton karboksylase aktivitet. Resultater fra microarray studier av Gressmann og kolleger indikerte at scoAB
, Fada
, HP0693 og HP0694 var til stede i hele H. pylori Hotell og H. acinonychis
stammer undersøkt [31]. Således kan seleksjonspress for å opprettholde evnen til å utnytte acetoacetat som en potensiell elektrondonor i H. pylori
og H. acinonychis
ser ut til å være større enn den for aceton metabolisme.
Konklusjon
H . pylori acxABC
operon koder sannsynlig aceton karboksylase som katalyserer omdannelsen av aceton til acetoacetat og er intimt forbundet med gener hvis produkter er forutsagt for å katalysere omdannelsen av sekvensielle acetoacetat til acetyl-CoA. Inspeksjon av genomene til andre nært beslektede ε-Proteobacteria tyder på at gener som er involvert i aceton metabolisme er bare til stede i bakterier i denne underrekken som koloniserer den gastriske slimhinne. Den acxABC
operon var ikke avgjørende for mus kolonisering av H. pylori
SS1, men det synes å forbedre kolonisering. Ytterligere karakterisering av den antatte H. pylori
aceton karboksylase og produkter av andre gener innenfor aceton stoffskiftet clusteret skal gi innsikt i hvordan ketonlegemer fra verts bidra til metabolske stordrifts H. pylori Hotell og H . acinonychis Hotell og hvordan disse stoffene påvirker evnen av disse bakteriene å kolonisere sine verter.
Metoder
bakterie~~POS=TRUNC stammer~~POS=HEADCOMP og media
Plasmid konstruksjon og kloning ble gjort i E. coli
stamme DH5a som ble dyrket i Luria-Bertani-medium ved 37 ° C. H. pylori
-stamme 26695 ble anvendt som templat for en polymerasekjedereaksjon (PCR). H. pylori
SS1 ble anvendt som villtypestamme for alle forsøkene og ble dyrket enten på blodagar eller tryptisk soya-agar supplementert med 5% hesteserum (TSA-serum) ved 37 ° C under en atmosfære av 4% O 2, 5% CO 2 og 91% N 2. Når dyrket i et flytende medium, ble H. pylori
kulturer dyrket i Mueller-Hinton buljong supplert med 5% hesteserum og 30 ug /ml bacitracin eller den definerte vekstmediet beskrevet av Bruggrabber og medarbeidere [22]. Kulturer (10-15 ml dyrket medium) ble dyrket i 150 ml serum ampuller forseglet med 20 mm teflon /silikon plater og aluminiumskapsler og under en atmosfære av 4% O 2, 5% CO 2, 10 % H 2, 81% N 2. Dersom ikke annet er angitt, når antibiotika ble inkludert i mediet, ble de tilsatt til de følgende konsentrasjoner: 100 ug /ml ampicillin, 30 ug /ml kloramfenikol, 200 ug /ml bacitracin 10 ug /ml vancomycin, og 10 ug /ml amfotericin B.
Inaktivering av acxB plakater (HP0696) i H. pylori
SS1, En 2,3-kb DNA fragment som bar acxB
ble forsterket av PCR fra H. pylori
stamme 22695 og klonet inn i pGEM-T (Promega). En katt
kassett ble innført i dette plasmid i en Eco
47III området ligger omtrent i midten av klonet acxB
. Det resulterende plasmid ble brukt som en selvmordsvektor for inaktivering av den kromosomale kopi av acxB
i H. pylori
SS1. Selvmords vektor ble introdusert i H. pylori
stammene ATCC 43504 og SS1, en stamme som kan kolonisere mus. På grunn gjentatte passasje av H. pylori
belastning SS1 på medium har blitt rapportert å resultere i tap av infektivitet hos mus, ble acxB
mutanten konstruert på en ny isolat av stamme SS1 gjenvunnet fra en infisert mus. Antallet passeringer av acxB
mutant i SS1 stammen var begrenset og registrert, og det mutante ble lagret frosset ved -80 ° C. Foreldre SS1 stammen ble opprettholdt og lagret frosset på en identisk måte. Vi bekreftet ved PCR at den kromosomale kopi av acxB
ble avbrutt ved alleliske veksling med den plasmid-båret kopi av genet ved hjelp av et sett av primere som flankerte området av forstyrrelse.
Vekstkurver for H. pylori
stammer
H. pylori
celler fra TSA-serum platene som stammer var blitt strøket ut på den foregående dag ble suspendert i fosfat-bufret saltvann (PBS) og brukt for å inokulere flytende medium ved en OD 600 0,03. Hvor angitt, ble aceton tilsatt aseptisk til mediet. Prøver ble tatt ved forskjellige tider og celletettheter ble målt ved lysspredning ved OD 600. Alternativt ble det levedyktige celletall bestemt etter seriefortynning av prøvene og utsåing på TSA-serum. Etter 4 til 5 dager inkubasjon, ble antallet kolonidannende enheter (cfu) bestemt for platene.
Mus kolonisering
Musekoloniseringsanalyse ble utført i det vesentlige som beskrevet tidligere [32]. Disse prosedyrene holdt relevante føderale retningslinjer og institusjonelle retningslinjer for omsorg og behandling av forsøksdyr. Kort sagt ble H. pylori
cellene høstet etter 48 timers vekst på blodagarplatene og suspendert i PBS til en OD 600 1,7. Headspace i røret ble spylt med argon for å minimalisere eksponering oksygen.

• Healing Potensiale Picrorhiza kurroa (Scrofulariaceae) jordstengler mot indometacin-induserte magesår: a. Mekanistisk leting
• Doseavhengig hemming av gastrisk skade av hydrogen i alkalisk electrolyzed drikkevann water