L'agent pathogène gastrique humain Helicobacter pylori a une carboxylase acétone potentiel qui améliore sa capacité à coloniser souris

L'agent pathogène gastrique humain Helicobacter pylori
a une carboxylase acétone potentiel qui améliore sa capacité à coloniser Résumé
Contexte souris
Helicobacter pylori
colonise l'estomac humain et est l'agent étiologique de la maladie de l'ulcère peptique . Tous les trois souches de H. pylori
qui ont été séquencés à ce jour contiennent un opéron potentiel dont les produits partagent une homologie avec les sous-unités d'acétone carboxylase (codée par acxABC
) de Xanthobacter autotrophicus
souche py2 et Rhodobacter capsulatus
souche B10. carboxylase catalyse la conversion de l'acétone de l'acétone à acétoacétate. En amont de gènes putatifs acxABC les enzymes de l'opéron encodent qui convertissent acétoacétate à l'acétoacétyl-CoA réductase, qui est métabolisé en outre pour générer deux molécules d'acétyl-CoA réductase. Les résultats de ce membre Afin de déterminer si la bactérie H. pylori acxABC
opéron a un rôle dans la colonisation de l'hôte de l'homologue de la acxB dans la souche H. pylori
SS1 adaptée à la souris a été inactivé avec une cassette de résistance au chloramphénicol (cat
). Dans les études de colonisation de souris le nombre de H. pylori
récupérés à partir de souris inoculées avec le acxB: chat
mutant étaient généralement un à deux ordres de grandeur plus faible que ceux récupérés à partir de souris inoculées avec la souche parentale. Une analyse statistique des données à l'aide d'un test Wilcoxin Rank indique les différences dans le nombre de H. pylori
isolés à partir de souris inoculées avec les deux souches étaient significatives au niveau de confiance de 99%. Niveaux d'acétone associés avec le tissu gastrique retiré de souris non infectées ont été mesurées et jugées aller de 10-110 pmoles par tissu poids humide gramme
Conclusion
Le défaut de la colonisation de l'acxB:. Chat
mutant suggère un rôle pour l'opéron de la acxABC la survie de la bactérie dans l'estomac. Les produits de l'opéron du H. pylori acxABC peuvent fonctionner principalement dans l'utilisation de l'acétone ou peuvent catalyser une réaction associée qui est importante pour la survie ou la croissance de l'hôte. H. pylori
rencontre des niveaux significatifs de l'acétone dans l'estomac qu'il pourrait utiliser en tant que donneur d'électrons potentiel pour la respiration microaérobique.
Fond
Helicobacter pylori est une
microaérophile, bactérie gram-négative qui est pathogène important de la muqueuse gastrique humaine [1, 2]. La colonisation de la muqueuse gastrique par H. pylori
conduit à une inflammation chronique qui peut évoluer vers une variété de maladies, y compris la gastrite chronique, l'ulcère gastro-duodénal, un cancer gastrique et la muqueuse associée à un lymphome [3-5]. En l'absence de traitement antimicrobien, l'hôte est susceptible de souffrir d'un H. à vie de l'infection pylori
de la muqueuse gastrique.
La capacité de H. pylori
à persister dans l'estomac humain pendant de longues périodes indique que il est bien adapté pour acquérir les nutriments dont il a besoin pour la croissance dans ce créneau unique. Par exemple, la couche muqueuse de l'estomac de la souris contient des quantités significatives d'hydrogène moléculaire (17-93 uM) provenant de l'activité métabolique de la flore microbienne dans le gros intestin [6]. H.pylori
est capable d'utiliser cet hydrogène moléculaire en tant que donneur d'électrons pour la respiration et une hydrogénase microaérobique fonctionnelle est nécessaire pour la colonisation réussie de la souris par H.pylori
[6, 7]. Contrairement à de nombreuses bactéries d'hydrogène-oxydant, cependant, H. pylori
est pas capable de CO autotrophes 2 fixation.
Plusieurs études ont examiné la capacité de H. pylori
d'utiliser différentes sources de carbone. H. pylori
a une capacité limitée à acquérir et à métaboliser les sucres, une observation qui est compatible avec l'analyse des séquences génomiques de H. pylori
souches 22695 et J99 [8]. Le glucose est le seul glucide
que H. pylori est capable d'utiliser ce qu'elle fait par la voie d'Entner-Doudoroff [9, 10]. Les acides aminés servent également en tant que sources de carbone pour H. pylori et
sont utilisés préférentiellement par H. pylori dans un milieu
de croissance contenant un mélange de glucose et d'acides aminés [9, 11]. Pyruvate, un intermédiaire clé dans le métabolisme central semble être principalement générée à partir du lactate, de l'alanine et de la sérine, au lieu de glucose chez H. pylori
[12, 13]. Le pyruvate est converti en acétyl-CoA par le pyruvate: flavodoxine oxydoréductase chez H. pylori
, qui peut ensuite alimenter le cycle de l'acide tricarboxylique (TCA) [14]. En outre, l'alanine, le lactate, l'acétate, le formiate et le succinate peuvent être produites par H. pylori
cellules mises en incubation en aérobiose [12]. La production d'acétate et de formiate comme produits métaboliques suggère l'existence d'une voie de fermentation mixte d'acide chez H. pylori
, bien que l'oxygène est essentiel pour la croissance de la bactérie [12] de. L'analyse des séquences du génome de H? .
pylori des souches 26695, J99 et HPAG1 ont révélé un potentiel opéron de trois gènes (désignés comme HP0695, HP0696 et HP0697 chez H. pylori
26695) dont les produits partage une identité d'acides aminés 50-63% avec la β , α, et des sous-unités gamma d'acétone carboxylase de Xanthobacter autotrophicus
souche py2 et Rhodobacter capsulatus
souche B10 [15]. Les homologues de l'acétone carboxylase se trouvent dans un certain nombre de bactéries, mais les enzymes du X. autotrophicus
et R. capsulatus sont les mieux caractérisés. Acétone carboxylase catalyse la carboxylation dépendante de l'ATP de l'acétone à acétoacétate et est nécessaire pour la croissance de X. autotrophicus
et R. capsulatus
avec de l'acétone comme seule source de carbone et de donneur d'électrons pour la respiration [15-17]. X. autotrophicus
acétone carboxylase a une forte affinité pour l'acétone (Km = 8 uM) mais le taux de l'enzyme de rotation est très lente (~ 45 min) [15]. Pour compenser le faible taux de rotation d'acétone carboxylase, X. autotrophicus
produit des quantités élevées de l'enzyme (17-25% de protéine soluble totale) lorsqu'il est cultivé sur de l'acétone [15]
Genes situé à proximité du H. pylori
HP0695-HP0696-HP0697 enzymes opéron codent affichés pour convertir acétoacétate d'acétoacétyl-CoA, qui est métabolisé plus en acétyl-CoA [8, 18]. L'acétone, l'acétoacétate et le 3-β-hydroxybutyrate sont des corps cétoniques produites par les hépatocytes périveineux de mammifère au cours de la dégradation des acides gras et sont utilisés comme donneurs d'électrons pour la respiration lorsque les hydrates de carbone ne sont pas facilement disponibles [19]. Tout comme les corps cétoniques sont des sources d'énergie importantes pour l'homme lorsque les glucides ne sont pas disponibles, ces composés peuvent servir de donneurs d'électrons respiratoires pour H. pylori
colonisant la muqueuse gastrique. Pour déterminer si l'opéron HP0695-HP0696-HP0697 a un rôle dans la colonisation de l'hôte, nous inactivé HP0696 dans la souche de H. pylori SS1. Le mutant a été compromise HP0696 dans son aptitude à coloniser des souris suggérant que la carboxylation de l'acétone ou d'une activité enzymatique liée catalysée par les produits de l'opéron-HP0695 HP0696-HP0697 est un facteur contributif important pour accueillir la colonisation.
Résultats
H.pylori
contient un ensemble de gènes prédits être impliqués dans le métabolisme de l'acétone
Les trois H. pylori
souches dont les génomes ont été séquencés contenir un groupe de huit gènes conservés au sein d'une séquence d'ADN ~ 10 kb, dont six codent pour des enzymes prédits à métaboliser l'acétone et acétoacétate de l'acétyl-CoA (fig. 1 et 2). Helicobacter acinonychis
, une espèce voisine qui infecte les grands félins, possède également ce groupe de gènes. Comme indiqué plus haut, trois de ces gènes partagent une homologie avec acxABC
, bien que les deux premiers gènes dans l'opéron sont indiqués comme des gènes codant pour l'utilisation de la protéine A et hydantoïne méthylhydantoïnase, respectivement, dans les génomes de H. pylori
annotés. Hydantoinases catalyser l'hydrolyse des cycles à 5 chaînons, par hydrolyse d'une liaison imide interne et ont souvent assez large spécificité de substrat. Des protéines dans la base de données dont les fonctions biochimiques ont été démontrées, analyse BLAST a révélé que les produits prédites des gènes de H. pylori correspondent plus étroitement à celles de l'sp Xanthobacter. Py2 acxABC
opéron (identité d'acides aminés 59-68% sur toute la longueur des trois sous-unités prédite). Pour le plus récemment séquencés H. pylori et H.
acinonychis
génomes du dernier gène de l'opéron est annoté comme acxC
[20, 21]. Ainsi, HP0695-HP0696-HP0697 l'opéron du H. pylori code probablement l'acétone carboxylase plutôt que hydantoïnase, et nous renvoyons donc à cet opéron comme acxABC
. La figure 1 Organisation des gènes impliqués dans le métabolisme de l'acétone chez H. pylori et H. acinonychus souches. désignations de gènes sont indiqués ci-dessous chaque flèche (non dessinée à l'échelle). cadres de lecture ouverts qui ne sont pas donnés une désignation de gène dans les séquences génomiques annotées sont indiqués avec soit une désignation hp (pour H. pylori
26695), une désignation de jhp (pour H. pylori
J99), ou seulement la open numéro de cadre de lecture (pour H. pylori
HPAG1 et A. acinonychis
souche Sheeba). orthologues dans les quatre souches sont de la même couleur. Les gènes jhp0628 chez H. pylori
J99 et 0671 chez H. pylori
HPAG1 correspondent à une fusion de hp0688 et hp0689 de H. pylori
26695. H. pylori
J99 et HPAG1 ont deux gènes dans cette région, jhp0629 (HPAG1_0672) et jhp0630 (HPAG1_0672), qui code pour une méthyltransférase de type II de l'ADN et une enzyme de restriction de type II, respectivement, et on ne trouve pas chez H. pylori le plus 26695. les fonctions des produits des gènes au sein du cluster du métabolisme de l'acétone, sont décrits dans le texte. Les fonctions proposées des produits des gènes environnants sont: FECA
, le fer (III) protéine de transport de dicitrate; FeoB
, fer (II) protéine de transport; dgkA
, diacylglycérol kinase; gyrA
, sous-unité A de l'ADN gyrase; dcuA
, anaérobie C4-dicarboxylate transporteur; et ANSB
, asparaginase II.
Figure 2 voie proposée pour l'utilisation de l'acétone dans H. pylori. La voie proposée pour la conversion d'acétone pour l'acétyl-CoA chez H. pylori et H.
acinonychis
est représenté. Les réactions et les gènes codant pour les enzymes responsables de la catalyse de chaque réaction sont indiqués
Deux autres gènes au sein du groupe de gènes, SCOA
(HP0691) et (le HP0692) de Scob, encode succinyl CoA:. Acétoacétate CoA-transférase ( SCOT), qui catalyse la conversion de l'acétoacétate ainsi succinyl-CoA à l'acétoacétyl-CoA en plus du succinate [18]. Acétoacétyl-CoA produit par SCOT est métabolisé en outre par acétoacétyl-CoA thiolase, qui est codée par (le HP0690 de fada; gène est annoté comme THL
chez H. pylori
J99 et ATOB
à H. pylori et H.
HPAG1 acinonychis
), afin de générer deux molécules d'acétyl-CoA à partir acétoacétyl-CoA en plus coenzyme A (CoA) [8]. Les deux gènes restants dans ce groupe, HP0693 et ​​HP0694, sont prévus pour coder pour une permease d'acides gras à chaîne courte et d'une protéine de la membrane externe, respectivement, et peuvent fonctionner dans le transport de l'acétoacétate.
Les huit gènes au sein de ce groupe du métabolisme de l'acétone putatif sont disposés de la même par rapport à l'autre dans les trois souches de H. pylori
, mais le groupe est orienté dans l'une des deux orientations possibles (fig. 1) indiquant l'apparition d'une inversion de l'ADN dans cette région au cours de l'évolution de la H. pylori
. Les alignements de séquences d'ADN provenant des trois souches rétrécies sur le site de l'inversion à ~ 40 bp en aval de l'homologue de la acxC et ~ 160 pb en amont du codon d'initiation pour des fada (données non présentées). Pas de grandes répétitions directes ou inversées se trouvent près de ces régions qui pourraient avoir été impliqués dans l'inversion, et donc nous ne pouvons pas spéculer sur le mécanisme de cette inversion. H. pylori
souches J99 et HPAG1, mais pas 26.695, il existe un certain type II ADN méthyltransférase prédite (de jhp0629 et HPAG1_0673) et une enzyme de type II de restriction (jhp0630 et HPAG1_0672) adjacent au groupe de gènes du métabolisme de l'acétone putatif.
H. acinonychis
possède le groupe de gènes du métabolisme de l'acétone putative et les gènes au sein du cluster sont dans la même orientation que ceux de H. pylori
J99. Dans H. acinonychis
ces gènes sont adjacents à dgkA
et gyrA
comme ils sont dans H. pylori
, mais sont flanquées à l'extrémité opposée par dcuA
et ANSB
. Le
FECA et FeoB de gènes, qui sont situés à proximité du groupe de gènes du métabolisme de l'acétone dans les souches de H. pylori, sont ~ 69 kb de ce groupe de gènes dans H. acinonychis
. Ainsi, la disposition relative des gènes au sein du cluster du métabolisme de l'acétone est restée remarquablement conservée au cours de l'évolution de H. pylori et H.
acinonychis
en dépit du fait que la zone adjacente dans les génomes de ces deux espèces ont subi . extensives réarrangements
Le H. pylori acxB: chat
mutant est déficient dans sa capacité à coloniser des souris
gène de la acxB chez H. pylori
SS1, qui est une souche de souris adaptée , a été perturbée par une cassette de résistance au chloramphénicol (cat
). Les cultures de type sauvage H. pylori
SS1 et le acxB: chat
mutant ont été cultivées dans un bouillon Mueller-Hinton additionné de sérum de cheval ou un milieu défini précédemment décrit [22]. Des quantités variables d'acétone allant de 1,3 mM à 26 mM ont été inclus dans les milieux de croissance pour déterminer si l'acétone affecté la croissance des deux souches. La croissance cellulaire a été contrôlée par comptage des cellules viables, ainsi que les densités optiques des cultures à différentes époques. Y compris l'acétone dans les deux milieux de croissance n'a eu aucun effet sur le taux de croissance ou le rendement cellulaire finale de H. pylori
SS1 ou acxB: chat
mutant (données non présentées). L'échec de l'acétone pour stimuler la croissance de H. pylori
SS1 dans les conditions testées est pas inattendue puisque les médias de croissance pour H. pylori
est très riche en éléments nutritifs. Ces résultats suggèrent également que acxABC
est pas nécessaire pour l'acétone désintoxication
La capacité du acxB:. Chat
mutant à coloniser des souris a été comparée à celle du H. pylori
SS1 souche parentale en deux essais séparés. Dans chaque essai, onze souris ont été inoculées avec la souche de type sauvage et onze ont été inoculés avec le acxB: chat
mutant. Trois semaines après l'inoculation des souris avec les souches de H. pylori, les souris ont été sacrifiées et le nombre de H.pylori
dans les estomacs des animaux ont été déterminés. Pour les souris qui avaient été inoculés avec la souche de type sauvage, la plupart des animaux (19/22 animaux) avaient les chiffres de H. pylori qui étaient bien au-dessus de la limite de détection, ce qui était de 500 ufc par gramme estomac (Fig. 3). Le nombre de H. pylori
dans les échantillons qui étaient au-dessus de la limite de détection varie de 10 4-10 6 ufc par gramme estomac. La plupart des souris inoculées avec le acxB: chat
mutant avaient aussi des niveaux mesurables de H. pylori
(15/22 animaux), mais le nombre de H. pylori
associés à ces souris étaient généralement un à deux ordres de grandeur inférieurs à ceux des souris qui avaient été inoculés avec la souche de type sauvage. Une analyse statistique des données à l'aide d'un test Wilcoxin Rank vérifié que les différences dans le nombre de H. pylori
isolés à partir de souris inoculées avec les deux souches étaient significatives au niveau de confiance de 99%, ce qui indique que l'acétone carboxylase a amélioré la capacité des H. pylori
SS1 à coloniser l'estomac de la souris. Comme nous étions incapables de cloner l'opéron du acxABC nous ne pouvions pas vérifier par complémentation que la mutation du acxB était responsable du défaut de la colonisation. Toutefois, il est peu probable que le phénotype mutant de la colonisation de la acxB était due aux effets polaires étant donné qu'il n'y a pas d'autres gènes dans l'opéron de la acxABC dans l'une des trois souches de H. pylori
dont les génomes ont été séquencés à ce jour (Fig. 1). De plus, le défaut de la colonisation est peu probable en raison de l'atténuation ou une mutation secondaire puisque nous avons construit le mutant de la acxB dans une nouvelle isolat de la souche SS1 récupéré à partir d'une souris infectée. Figure 3 Souris colonisation dosage de H. pylori SS1 et une isogénique acxB: souche mutante de chat. Les données sont présentées sous la forme d'un diagramme de dispersion des unités formatrices de colonies par gramme de l'estomac formant tel que déterminé par les chiffres de la plaque. Chaque point représente le nombre ufc d'une souris, exprimée en tant que valeur de log10 (ufc /g estomac) dans l'axe Y. La ligne de base [log10 (ufc /g estomac) = 2,7] est la limite de détection de l'essai, ce qui représente le nombre inférieur à 500 ufc /g estomac.
Niveaux Acétone dans l'estomac de la souris
Depuis les données de la essais de colonisation souris ont suggéré que la capacité d'utiliser l'acétone par H. pylori
était important pour la colonisation hôte efficace, nous avons voulu déterminer si H. pylori
rencontré les niveaux d'acétone significatifs dans l'estomac de la souris. Bien que les niveaux d'acétone ont été rapportées pour divers fluides corporels, nous ne connaissions pas les rapports de niveaux d'acétone associés avec le suc gastrique ou d'un tissu. Par conséquent, nous avons mesuré les niveaux d'acétone associés avec le tissu gastrique de la souris après avoir retiré rapidement l'estomac de souris et de placer immédiatement l'estomac dans des flacons de sérum scellés. Étant donné que nous voulions estimer les niveaux d'acétone que H. pylori
pourrait rencontrer au cours de l'infection persistante, les animaux utilisés pour cette étude ont été maintenus sur un horaire régulier d'alimentation et ont été sacrifiés le matin avant de recevoir leur allocation alimentaire quotidienne normale. Les flacons de sérum scellés contenant les estomacs des souris ont été mises en incubation sur de la glace pour permettre à l'acétone associée avec le tissu gastrique pour équilibrer la phase gazeuse dans les flacons, après quoi les échantillons en phase gazeuse ont été analysés par chromatographie en phase gazeuse. Cette procédure a été faite initialement par le sacrifice des animaux et enlever leurs estomacs. Des résultats similaires ont cependant été obtenus en éliminant les estomacs d'animaux vivants ont été anesthésiés. La quantité d'acétone associée avec le tissu gastrique pour chaque souris individuelle a varié, allant de ~ 10-110 pmoles acétone par le tissu en poids humide g (fig. 4), avec la plupart des valeurs (7/6) tombant dans la plage de 10 à 35 umoles acétone par tissu poids humide de gramme. Ces données suggèrent que des quantités millimolaires d'acétone sont associées avec le tissu gastrique de souris et pourrait être disponible en tant que source de carbone ou d'énergie potentielle pour H.pylori
. Ce niveau d'acétone associée au tissu gastrique de la souris était supérieure à ce qu'on attendait puisque les niveaux de corps cétoniques dans le sérum varient humains et autres mammifères sont généralement comprises entre < 0,5 mm à quelques millimolaire [23]. Acétone est produit chez les mammifères par la décarboxylation spontanée d'acétoacétate et cette décarboxylation est améliorée à un pH faible, et ainsi de l'acétone peut accumuler dans l'estomac en raison de l'acidité gastrique. Figure 4 niveaux de Acétone associés avec le tissu gastrique de la souris. niveaux d'acétone de l'estomac ont été déterminées pour trois souris après avoir sacrifié les animaux et enlever immédiatement leurs estomacs (post-mortem), et pour quatre souris qui ont été anesthésiés après quoi leurs estomacs ont été enlevés (pré-mortem). les estomacs des souris excisés ont été placés immédiatement dans des flacons scellés ont été ensuite placés sur de la glace pendant au moins 30 minutes pour permettre l'acétone associée avec le tissu gastrique pour équilibrer la phase gazeuse. les niveaux d'acétone dans les phases gazeuses des flacons ont été mesurées par Chromatographie en phase gazeuse et estimées à partir des courbes étalons générées pour chaque flacon. Chaque valeur représente une moyenne d'au moins trois mesures et les barres d'erreur indiquent les écarts-types pour chaque échantillon de. Rapport
Nous apportons la preuve que H. pylori
possèdent une carboxylase acétone fonctionnelle postulé antérieurement par Ensign et co -les travailleurs [15]. L'opéron du pylori acxABC H. est proche de la
scoAB et les gènes fadB de qui codent pour les enzymes et SCOT acétoacétyl-CoA thiolase. Ainsi, ce groupe de gènes codant pour un ensemble d'enzymes capables de métaboliser l'acétone en acétyl-CoA. Acétyl-CoA produit à partir de l'acétone et l'acétoacétate pourrait alimenter le cycle de TCA pour fournir l'énergie pour H. pylori
. Comme observé par Pflock et collègues du acxABC
opéron et d'autres gènes associés au métabolisme de l'acétone sont présents dans H. acinonychis
[24]. Ces gènes sont absents, cependant, dans l'autre ε-Proteobacteria étroitement liés dont les génomes ont été séquencés à ce jour, qui comprend Helicobacter hepaticus
, Campylobacter jejuni
, Thiomicrospira de la
et Wolinella de la
. L'acquisition et l'entretien du groupe de gènes du métabolisme de l'acétone dans H. pylori et H.
acinonychis
peut être lié au fait que, contrairement à ces autres connexes ε-Proteobacteria, ils colonisent la muqueuse de l'estomac. Le regroupement de ces gènes et l'absence de gènes orthologues dans d'autres ε-Proteobacteria étroitement lié pourraient indiquer l'acquisition possible de ces gènes par H. pylori et H.
acinonychus
par transfert latéral de gènes. La teneur en G + C de ce groupe de gènes du métabolisme de l'acétone dans H. pylori
est légèrement plus élevé que la moyenne pour l'ensemble du génome, mais cela semble dû aux produits de ces gènes étant très riche en glycine (~ 10% comparer à 6% en moyenne du génome). De plus, les caractéristiques de composition de ces gènes, tels que les abondances relatives de dinucléotides et biais de codon, ne sont pas représentatifs du transfert latéral récent de cette région [25] (J. Mrázek, communication personnelle).
Jungblut et ses collègues ont rapporté que H . pylori
AcxC (HP0698) une réaction croisée avec des anticorps provenant d'un patient atteint d'un adénocarcinome, ce qui indique que l'opéron du H. pylori acxABC est exprimé dans l'hôte [26]. De plus, nous montrons ici que H. pylori
peut rencontrer des niveaux significatifs d'acétone dans l'estomac de la souris et ainsi de ce composé peut servir comme donneur d'électrons respiratoires importants pour la bactérie chez l'hôte. En accord avec cette hypothèse, le mutant du H. pylori acxB a été significativement réduite dans sa capacité à coloniser l'estomac de la souris que l'on en déduit les résultats de l'incapacité du mutant d'utiliser l'acétone en tant que source d'énergie. L'incapacité de l'acétone pour stimuler la croissance de H. pylori
SS1 en culture liquide peut résulter de l'échec des médias de croissance utilisés pour reproduire les conditions de croissance rencontrées par la bactérie quand colonisant la muqueuse gastrique. Une autre hypothèse pour le défaut de la colonisation du mutant de la acxB est que l'acétone carboxylase est nécessaire pour la désintoxication de l'acétone. Cependant, notre incapacité à observer aucune inhibition de la croissance du mutant du acxB par l'addition d'acétone dans le milieu de culture va à l'encontre de cette dernière hypothèse. Une autre possibilité est que les produits de l'opéron du acxABC catalysent une réaction connue qui est importante pour la survie ou la croissance des cellules de H. pylori dans
la muqueuse gastrique. Une caractérisation plus poussée biochimique des produits de l'opéron du pylori acxABC H. devrait aider à distinguer entre ces possibililties.
Une analyse de transcriptome récente de H. pylori
26695 en utilisant toute une microarray du génome a suggéré que le HP1021 régulateur de réponse fortement activé transcription de acxABC
et scoAB
, et la transcription activée de fada
et hp0693 dans une moindre mesure [24]. Les auteurs de cette étude ont montré que HP1021 lie la région régulatrice du promoteur du acxABC
, ce qui suggère que ce régulateur de réponse médie directement ses effets sur la transcription des acxABC
et que les gènes au sein du cluster de métabolisme de l'acétone font partie d'un régulon contrôlé par HP1021. Pflock et ses collègues ont identifié 79 gènes dans H. pylori
26695 dont l'expression a été modifiée dans le mutant HP1021 - 51 gènes ont été transcrits à des niveaux inférieurs dans le mutant tandis que 28 gènes ont été exprimés à des niveaux plus élevés [24]. HP1021 diffère de la plupart des autres régulateurs de réponse en ce qu 'il lui manque le résidu aspartate de phosphate acceptant hautement conservée, et une histidine kinase apparentée à HP1021 n'a pas été identifié. Il existe des rapports contradictoires sur la transcription de HP1021 en réponse à un pH acide, ainsi que sur la transcription de H. pylori acxABC
en réponse à abaisser le pH [27-29]. Ces différences peuvent être dues à la manière dont les bactéries ont été cultivés. Bien que ces rapports conflit en ce qui concerne la transcription de HP1021 en réponse à un pH acide, les résultats des deux études indiquent que les conditions qui conduisent à une régulation négative des résultats de la HP1021 à une expression accrue de acxABC
. Cela semble contre-intuitif étant donné le rôle apparent de HP1021 dans l'activation de la transcription de acxABC
.
La seule autre bactérie pour laquelle la régulation de l'opéron du acxABC a été examiné est X. autotrophicus
. Contrôle transcriptionnel de acxABC
dans X. autotrophicus
diffère de celle de H. pylori
. X. autotrophicus
manque un homologue de HP1021, mais réglemente plutôt la transcription de acxABC
via σ 54 (rpoN) et σ activateur 54 dépendant AcxR [15]. Bien que H. pylori
possède σ 54, l'opéron du acxABC ne fait pas partie de l'H. pylori
rpoN régulon [30].
En dépit de notre observation que la perturbation de acxB
affecte négativement la colonisation de souris par H. pylori
SS1, les récentes études entières génome microarray avec cinquante-six souches représentatives à l'échelle mondiale de H. pylori
et quatre H. acinonychis
souches ont indiqué que les gènes de la acxABC ne sont pas présents dans les souches de tous H. pylori [31]. Il serait intéressant de déterminer si les isolats dépourvus de acxABC
sont moins compétitifs à coloniser leurs hôtes naturels que les souches qui possèdent ces gènes. Alternativement, les souches manquant acxABC
peut avoir des adaptations qui compensent le manque d'activité acétone carboxylase. Les résultats des études de microréseaux par Gressmann et ses collègues ont indiqué que scoAB
, fada
, HP0693 et ​​HP0694 étaient présents dans tous les H. pylori et H.
acinonychis
souches examinées [31]. Ainsi, la pression sélective du maintien de l'aptitude à utiliser l'acétoacétate en tant que donneur d'électrons potentiel chez H. pylori et H.
acinonychis
semble être supérieure à celle pour le métabolisme de l'acétone.
Conclusion Le
H . pylori acxABC
code pour l'opéron acétone probablement carboxylase qui catalyse la conversion d'acétone et d'acétoacétate est intimement associé à des gènes dont les produits sont prévus pour catalyser la conversion séquentielle de l'acétoacétate d'acétyl-CoA. Inspection des génomes d'autres ε-Proteobacteria étroitement lié suggère que les gènes impliqués dans le métabolisme de l'acétone ne sont présents que dans les bactéries dans ce phylum qui colonisent la muqueuse gastrique. L'opéron du acxABC était pas essentiel pour la colonisation de la souris par H. pylori
SS1, mais il ne semble pour améliorer la colonisation. Une caractérisation plus poussée de la putative H. pylori
acétone carboxylase et les produits des autres gènes au sein du groupe de gènes du métabolisme de l'acétone doit fournir un aperçu de la façon dont les corps cétoniques à partir de l'hôte contribuent aux économies de H. pylori
et H métaboliques . acinonychis
et comment ces composés l'impact de la capacité de ces bactéries à coloniser leurs hôtes.
Méthodes
souches bactériennes et la construction et le clonage plasmidique des médias a été fait dans E. coli
souche DH5a qui a été cultivé dans un milieu Luria-Bertani à 37 ° C. La souche de H. pylori 26695 a été utilisé comme matrice pour une réaction en chaîne par polymérase (PCR). H. pylori
SS1 a été utilisé comme la souche de type sauvage pour toutes les expériences et a été cultivé soit sur gélose au sang ou gélose trypticase soja supplémenté avec 5% de sérum de cheval (TSA-sérum) à 37 ° C sous une atmosphère de 4% O 2, 5% de CO 2 et 91% N 2. Lorsqu'elles sont cultivées dans un milieu liquide, H. pylori
cultures ont été cultivées dans du bouillon de Mueller-Hinton supplémenté avec 5% de sérum de cheval et 30 pg /ml de bacitracine ou le milieu de croissance décrit par Bruggrabber définie et ses collaborateurs [22]. Cultures (10-15 ml cultivées milieu) ont été cultivées dans 150 ml fioles de sérum scellées avec 20 mm Teflon /disques de silicone et des capsules d'aluminium et sous une atmosphère de 4% O 2, 5% de CO 2, 10 % H 2, 81% N 2. Sauf indication contraire, lorsque les antibiotiques ont été inclus dans le milieu ont été ajoutés aux concentrations suivantes: 100 ug /ml d'ampicilline, 30 pg /ml de chloramphenicol, 200 pg /ml de bacitracine 10 ug /ml de vancomycine et 10 pg /ml d'amphotéricine B.
inactivation de (la HP0696) de acxB chez H. pylori
SS1
A 2,3 kb fragment d'ADN qui a effectué acxB
a été amplifié par PCR à partir de H. pylori
souche 22695 et clone dans pGEM-T (Promega). Le bac d'un chat a été introduit dans ce plasmide à un Eco 47III de site situé à peu près au milieu de la acxB
clonée. Le plasmide résultant a été utilisé comme un vecteur suicide pour inactiver la copie chromosomique de acxB
chez H. pylori
SS1. Le vecteur suicide a été introduit dans H. pylori
souches ATCC 43504 et SS1, une souche qui peut coloniser des souris. Parce que le passage répété de la souche de H. pylori SS1 sur le milieu a été signalé à entraîner la perte de l'infectivité chez la souris, le mutant du acxB a été construit dans une nouvelle isolat de la souche SS1 récupéré à partir d'une souris infectée. Le nombre de passages de acxB de mutant dans la souche SS1 a été limitée et enregistrée, et le mutant a été conservé congelé à -80 ° C. La souche SS1 parental a été maintenu et conservé congelé de manière identique. Nous avons confirmé par PCR que la copie chromosomique du acxB
a été perturbée par échange allélique avec la copie porté par un plasmide du gène en utilisant un ensemble d'amorces qui flanquaient le site de perturbation.
Les courbes de croissance de H. pylori

souches des cellules de H. pylori à partir de plaques TSA-sérum sur lesquelles les souches ont été rayées de la veille ont été mises en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et utilisée pour inoculer un milieu liquide à une DO 600 à 0,03. Le cas échéant, l'acétone a été ajoutée aseptiquement au milieu. Des échantillons ont été prélevés à des moments et des densités cellulaires différentes ont été mesurées par diffusion de la lumière à une DO 600. En variante, le nombre de cellules viables ont été déterminés après une dilution en série des échantillons, et placage sur TSA-sérum. À la suite de 4 à 5 jours d'incubation, le nombre des unités formant colonie (ufc) ont été déterminées pour les plaques.
Colonisation
souris Souris essais de colonisation ont été effectuées essentiellement comme décrit antérieurement [32]. Ces procédures étaient conformes aux lignes directrices fédérales pertinentes et les politiques institutionnelles pour le soin et la manipulation des animaux de laboratoire. En bref, les cellules de H. pylori ont été récoltées après 48 h de croissance sur des plaques de gélose au sang et mis en suspension dans du PBS jusqu'à une DO 600 de 1,7. L'espace de tête dans le tube a barboté avec de l'argon pour minimiser l'exposition à l'oxygène.

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