O agente patogénico humano gástrica Helicobacter pylori tem um potencial carboxilase acetona que aumenta a sua capacidade de colonizar murganhos

O patógeno gástrico humano Helicobacter pylori
tem um potencial carboxilase acetona que aumenta a sua capacidade de colonizar ratos da arte abstracta
Fundo
Helicobacter pylori
coloniza o estômago humano e é o agente etiológico da doença de úlcera péptica . Todos os três H. pylori
cepas que foram sequenciados até o momento contêm um operon potencial cujos produtos quota de homologia com as subunidades de carboxilase acetona (codificado por acxABC
) a partir Xanthobacter autotrophicus
estirpe Py2 e Rhodobacter capsulatus
estirpe B10. Acetona carboxilase catalisa a conversão de acetona em acetoacetato. Genes putativa a montante do operão acxABC
enzimas que convertem acetoacetato codificam para acetoacetil-CoA-redutase, o qual é metabolizado ainda mais para gerar duas moléculas de acetil-CoA.

Resultados Para determinar se a H. pylori acxABC
operão tem um papel na colonização do hospedeiro a acxB
homólogo na estirpe de H. pylori
SS1 adaptado-ratinho foi inactivada com uma cassete de resistência a cloranfenicol-(gato
). Em estudos de colonização de rato dos números de H. pylori
recuperado a partir de ratinhos inoculados com a acxB: gato
mutante foram geralmente uma a duas ordens de grandeza mais baixa do que aqueles recuperados a partir de ratinhos inoculados com a estirpe parental. Uma análise estatística dos dados utilizando um teste de Wilcoxin Terminou indicado as diferenças nos números de H. pylori
isolados a partir de murganhos inoculados com as duas estirpes eram significativas ao nível de confiança de 99%. Níveis de acetona associados com tecido gástrico removido a partir de ratinhos não infectados foram medidos e verificou-se variar entre 10-110 μmols por grama de tecido em peso húmido

Conclusão O defeito colonização do acxB: Cat.
Mutante sugere um papel para o acxABC
operão na sobrevivência da bactéria no estômago. Os produtos da H. pylori acxABC
operão podem funcionar, principalmente, a utilização de acetona ou pode catalisar uma reacção relacionada que é importante para a sobrevivência ou crescimento no hospedeiro. H. pylori
encontra níveis significativos de acetona no estômago que poderia ser utilizado como um potencial doador de elétrons para a respiração microaeróbia.
Fundo
Helicobacter pylori
é um microaerophilic, bactéria gram-negativa que é um agente patogénico significativo da mucosa gástrica humana [1, 2]. A colonização da mucosa gástrica por H. pylori
conduz à inflamação crónica que pode progredir para uma variedade de doenças, incluindo a gastrite crónica, úlcera péptica, cancro gástrico e linfoma associado a mucosa [3-5]. Na ausência de terapia antimicrobiana, o hospedeiro é susceptível de sofrer uma vida H. pylori
da mucosa gástrica.
A capacidade de H. pylori
a persistir no estômago humano por períodos prolongados que indica ele está bem adaptado para adquirir os nutrientes de que necessita para o crescimento neste nicho único. Por exemplo, a camada mucosa do estômago do rato contém quantidades significativas de hidrogénio molecular (17-93 uM) originárias de actividade metabólica da flora microbiana do intestino grosso [6]. H. pylori
é capaz de utilizar esta hidrogénio molecular como um doador de electrões para a respiração e um microaeróbia hidrogenase funcional é requerida para colonização bem sucedida de ratinhos por H. pylori
[6, 7]. Ao contrário de muitas bactérias oxidantes de hidrogênio, no entanto, H. pylori
não é capaz de CO autotrophic 2 fixação.
Vários estudos examinaram a capacidade de H. pylori
para utilizar diversas fontes de carbono. H. pylori
tem uma capacidade limitada para metabolizar adquirir e açúcares, uma observação que é consistente com a análise das sequências genómicas de H. pylori
estirpes 22695 e J99 [8]. A glicose é a única de hidratos de carbono que a H. pylori
é capaz de utilizar o que é feito através da via Entner-Doudoroff [9, 10]. Os aminoácidos também servir como fontes de carbono para o H. pylori
e são utilizados preferencialmente por H. pylori
em meio de crescimento contendo uma mistura de glucose e ácidos aminados [9, 11]. O piruvato, um intermediário chave no metabolismo central, parece ser gerado principalmente a partir de lactato, alanina e serina, em vez de glicose em H. pylori
[12, 13]. O piruvato é convertido em acetil-CoA por piruvato: Flavodoxina oxidorredutase em H. pylori
, que pode então contribuir para o ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) [14]. Além disso, alanina, lactato, acetato, formato e succinato podem ser produzidas pela H. pylori
células incubadas aerobicamente [12]. A produção de etilo e formato de produtos metabólicos como sugere a existência de uma via de fermentação ácido misto em H. pylori
, apesar de oxigénio é essencial para o crescimento da bactéria [12].
Análise de sequências do genoma de H . pylori
estirpes 26695, J99 e HPAG1 revelou um operão potencial de três genes (designados como HP0695, HP0696 e HP0697 em H. pylori
26695), cujos produtos partilhada 50-63% de identidade de aminoácidos com o β , α, e subunidades y de carboxilase acetona de Xanthobacter autotrophicus
estirpe Py2 e Rhodobacter capsulatus
estirpe B10 [15]. Homólogos de carboxilase acetona são encontrados em um número de bactérias, mas a X. autotrophicus
e R. capsulatus
enzimas são a melhor caracterizada. Acetona carboxilase catalisa a carboxilação dependente de ATP de acetona em acetoacetato e é necessária para o crescimento de X. autotrophicus
e R. capsulatus
com acetona como única fonte de carbono e de doador de electrões para a respiração [15-17]. X. autotrophicus
acetona carboxilase tem uma elevada afinidade para a acetona (Km = 8 uM), mas a taxa de turnover da enzima é muito lento (~ 45 por min) [15]. Para compensar a baixa rotatividade de carboxilase acetona, X. autotrophicus
produz grandes quantidades da enzima (17-25% de proteína solúvel total) quando cultivada em acetona [15]
Genes localizado perto do H. pylori
HP0695-HP0696-HP0697 enzimas operão mostrado codificam para converter acetoacetato de acetoacetil-CoA-redutase, o qual é metabolizado ainda mais a acetil-CoA [8, 18]. Acetona, acetoacetato e 3-β-hidroxibutirato corpos cetónicos são produzidos pelos hepatócitos perivenosa de mamíferos durante a degradação de ácido gordo e são utilizados como doadores de electrões para a respiração quando os hidratos de carbono não estão prontamente disponíveis [19]. Assim como corpos cetónicos são importantes fontes de energia para os seres humanos, quando os hidratos de carbono não estão disponíveis, estes compostos podem servir como dadores de electrões para o H. pylori respiratórias
colonizar a mucosa gástrica. Para determinar se o operão HP0695-HP0696-HP0697 tem um papel na colonização do hospedeiro que inativado HP0696 em H. pylori
estirpe SS1. O mutante HP0696 foi comprometido na sua capacidade de colonizar ratos que sugerem que carboxilação acetona ou uma atividade enzimática relacionada catalisada por produtos do operão HP0695-HP0696-HP0697 é um fator que contribui significativamente para hospedar colonização.

Resultados da H. pylori
contém um conjunto de genes previstos para ser envolvido no metabolismo de acetona
As três estirpes de H. pylori
cujos genomas foram sequenciados conter um conjunto de oito genes conservados dentro de uma sequência de ADN de ~ 10 kb, seis dos quais codificam enzimas previsto para metabolizar acetona e acetoacetato de acetil-CoA (Figs. 1 e 2). Helicobacter acinonychis
, uma espécie estreitamente relacionada que infecta grandes felinos, também possui este cluster gene. Tal como indicado acima, três destes genes partilham homologia com acxABC
, embora os dois primeiros genes no operão são indicados como genes que codificam para utilização hidantoína proteína A e methylhydantoinase, respectivamente, nos genomas de H. pylori
anotados. Hydantoinases catalisar a hidrólise de anéis de 5 membros através da hidrólise de uma ligação imida interna e têm, frequentemente, bastante ampla especificidade para o substrato. De proteínas na base de dados, cujas funções bioquímicas foram demonstradas, análise BLAST revelou que os produtos previstos da H. pylori
genes corresponde mais de perto as da Xanthobacter
sp. Py2 acxABC
operão (59-68% de identidade de aminoácidos inteiras ao longo dos comprimentos das três subunidades previstos). Para o mais recentemente sequenciado H. pylori Comprar e H. acinonychis
genomas do último gene do operon é anotado como acxC
[20, 21]. Assim, o H. pylori
operon HP0695-HP0696-HP0697 provavelmente codifica acetona carboxilase em vez de hidantoínase, e nós, portanto, referir-se a esse operon como acxABC
. A Figura 1 Organização dos genes envolvidos no metabolismo de acetona em H. pylori e H. acinonychus estirpes. designações de genes são indicados abaixo de cada seta (não desenhada à escala). Abertas quadros de leitura que não receberam uma designação gene nas sequências do genoma anotadas serem indicados com um designação hp (por H. pylori
26695), uma designação jhp (por H. pylori
J99), ou apenas o aberta número do quadro de leitura (por H. pylori
HPAG1 e A. acinonychis
estirpe Sheeba). genes ortólogos nas quatro estirpes são da mesma cor. Os genes jhp0628 em H. pylori
J99 e 0671 em H. pylori
HPAG1 correspondem a uma fusão de hp0688 e hp0689 de H. pylori
26695. H. pylori
J99 e HPAG1 têm dois genes dentro desta região, jhp0629 (HPAG1_0672) e jhp0630 (HPAG1_0672), que codificam uma metiltransferase de ADN de tipo II e um enzima de restrição do tipo II, respectivamente, e não são encontrados em H. pylori
26695. as funções dos produtos dos genes dentro do grupo metabolismo acetona são descritas no texto. As funções propostas dos produtos dos genes circundantes são: Feca
, ferro (III) proteína de transporte dicitrato; feoB
, ferro (II) proteína de transporte; dgkA
, diacilglicerol-quinase; gyrA
, subunidade A da DNA girase; dcuA
, anaeróbio C4-dicarboxilato transportador; e ansB
, asparaginase II.
Figura 2 via proposta para a utilização de acetona em H. pylori. A via proposta para a conversão de acetona a acetil-CoA em H. pylori e H.
acinonychis
é mostrado. Reacções e genes que codificam as enzimas responsáveis ​​pela catálise cada reacção são indicados
Dois outros genes no interior do aglomerado de genes, Scoa
(HP0691) e Scob
(HP0692), codificam succinil CoA:. Acetoacetato de CoA-transferase ( SCOT), que catalisa a conversão de acetoacetato mais succinil-CoA para acetoacetil-CoA-redutase mais succinato [18]. Acetoacetil-CoA produzido pela SCOT é metabolizado mais longe, acetoacetil-CoA thiolase, que é codificada pelo fadA
(HP0690; gene é anotado como thl
em H. pylori
J99 e atob
em H. pylori e H.
HPAG1 acinonychis
), para gerar duas moléculas de acetil-CoA a partir de acetoacetil-CoA-redutase mais coenzima a (CoA) [8]. Os dois restantes genes dentro deste conjunto, HP0693 e HP0694, está previsto para codificar uma permease de ácido gordo de cadeia curta e uma proteína de membrana exterior, respectivamente, e podem funcionar de transporte de acetoacetato.
Os oito genes dentro deste conjunto metabolismo acetona putativo estão dispostos da mesma em relação ao outro nas três estirpes de H. pylori
, mas o agrupamento é orientada em qualquer uma das duas orientações possíveis (Fig. 1), indicando a ocorrência de uma inversão de ADN nesta região durante a evolução H. pylori
. Os alinhamentos das sequências de ADN dos três estirpes estreitada do local de inversão para ~ 40 pb a jusante do acxC
homólogo e ~ 160 pb a montante do codão de iniciação para fadA
(dados não mostrados). Não há grandes repetições diretas ou invertidos são encontrados perto dessas regiões que poderiam ter sido envolvidos na inversão, e por isso não podemos especular sobre o mecanismo para essa inversão. Para o H. pylori
estirpes J99 e HPAG1, mas não 26695, há uma metiltransferase previu tipo II ADN (jhp0629 e HPAG1_0673) e uma enzima de restrição do tipo II (jhp0630 e HPAG1_0672) adjacente ao agrupamento de genes do metabolismo acetona putativo.
H. acinonychis
possui o agregado de genes do metabolismo acetona putativo e os genes dentro do cluster estão na mesma orientação como aqueles em H. pylori
J99. Em H. acinonychis
estes genes são adjacentes a dgkA Comprar e gyrA
como eles estão em H. pylori
, mas são acompanhadas na extremidade oposta por dcuA Comprar e ansB
. O
Feca e feoB
genes, que estão localizados perto do aglomerado de genes do metabolismo acetona na H. pylori
estirpes, são ~ 69 kb deste gene cluster em H. acinonychis
. Assim, a disposição relativa dos genes dentro do cluster metabolismo acetona permaneceu notavelmente conservadas durante a evolução de H. pylori e H.
acinonychis
apesar do facto de a região adjacente nos genomas das duas espécies sofreu . extensos rearranjos
O H. pylori acxB: gato
mutante é deficiente na sua capacidade de colonizar ratos
gene a acxB
em H. pylori
SS1, que é uma estirpe adaptada-rato , foi interrompida com uma cassete de resistência cloranfenicol (cat
). As culturas de tipo selvagem H. pylori
SS1 e o acxB: cat
mutante foram cultivadas em caldo de Mueller-Hinton suplementado com soro de cavalo ou um meio definido anteriormente descrito [22]. quantidades variáveis ​​de acetona variando desde 1,3 mM a 26 mM foram incluídas no meio de crescimento para determinar se acetona afectado o crescimento de qualquer uma das estirpes. O crescimento das células foi monitorizada por contagem de células viáveis, bem como densidades ópticas das culturas em vários momentos. Incluindo acetona em ambos os meios de crescimento teve nenhum efeito sobre a taxa de crescimento ou rendimento final de células de H. pylori ou
SS1 acxB: gato
mutante (dados não mostrados). A falha de acetona para estimular o crescimento de H. pylori
SS1 sob as condições testadas não é inesperado uma vez que o meio de crescimento para H. pylori
é muito rico em nutrientes. Estes resultados também sugerem que acxABC
não é necessária para a desintoxicação acetona
A capacidade do acxB: Cat.
Mutante para colonizar murganhos foi comparada com a do parental H. pylori
SS1 estirpe em dois ensaios separados. Em cada ensaio, onze camundongos foram inoculados com a estirpe do tipo selvagem e onze foram inoculados com o acxB: Gato
mutante. Três semanas após a inoculação de ratinhos com o H. pylori
estirpes, os ratinhos foram sacrificados e foram determinadas as quantidades de H. pylori
nos estômagos dos animais. Para os ratos que tinham sido inoculados com a estirpe de tipo selvagem, a maior parte dos animais (19/22) tiveram animais H. pylori
contagens que foram bem acima do limite de detecção, que foi de 500 CFU por grama de estômago (Fig. 3). O número de H. pylori
em amostras que estavam acima do limite de detecção variou de 10 4 - 10 6 ufc por estômago grama. A maioria dos ratinhos inoculados com a acxB: gato
mutante também tiveram níveis mensuráveis ​​de H. pylori
(15/22 animais), mas os números de H. pylori
associada com estes ratos foram geralmente para uma duas ordens de grandeza mais baixa do que aqueles em ratos que tinham sido inoculados com a estirpe de tipo selvagem. Uma análise estatística dos dados utilizando um teste de Wilcoxin Terminou verificou-se que as diferenças nos números de H. pylori
isolados a partir de murganhos inoculados com as duas estirpes eram significativas ao nível de confiança de 99%, indicando que a acetona carboxilase melhorada a capacidade de H. pylori
SS1 para colonizar o estômago mouse. Uma vez que não foram capazes de clonar o acxABC
operon não foi possível verificar por complementação que o acxB
mutação foi responsável pelo defeito na colonização. No entanto, é pouco provável que o fenótipo colonização do acxB
mutante foi devida a efeitos polares uma vez que não há genes adicionais no acxABC
operão em qualquer uma das três estirpes de H. pylori
cujos genomas foram seqüenciados até o momento (Fig. 1). Além disso, o defeito colonização não é provavelmente devido a atenuação ou uma mutação secundária, uma vez que o construído acxB
mutante em um isolado de fresco da estirpe SS1 recuperado a partir de um rato infectado. Figura 3 mouse ensaio de colonização do H. pylori SS1 e um isogênico acxB: estirpe mutante gato. Os dados são apresentados como um gráfico de dispersão de unidades formadoras de colónias por grama de estômago de formação, tal como determinado por contagem de placas. Cada ponto representa a contagem de CFU de um rato, expresso como o valor de log10 (ufc /g estômago) no eixo dos Y. A linha de base [log 10 (CFU /g estômago) = 2,7] é o limite de detecção do ensaio, o que representa a contagem inferior a 500 ufc g estômago /.
Níveis Acetona no estômago do rato
Uma vez que os dados do ensaios de colonização do rato sugeriu que a capacidade de utilizar acetona por H. pylori
foi importante para a colonização do hospedeiro eficaz, nós fato para determinar se H. pylori
encontrou níveis de acetona significativas no estômago do rato. Embora os níveis de acetona foram relatados para vários fluidos corporais, que não tinham conhecimento de quaisquer relatos de níveis de acetona associados com o suco gástrico ou tecido. Por isso, mediram os níveis de acetona associados com tecido gástrico do mouse depois de remover rapidamente os estômagos dos ratos e imediatamente colocar os estômagos em frascos de soro selados. Desde que queria para estimar os níveis de acetona que o H. pylori
poderia encontrar durante a infecção persistente, os animais utilizados para este estudo foram mantidos em uma programação de alimentação regular e foram sacrificados na parte da manhã antes de receber sua cota alimentação diária normal. Os frascos de soro selados contendo as estômagos ratos foram incubadas em gelo para permitir que a acetona associados com o tecido gástrico equilibrar-se com a fase de gás nos tubos de ensaio, após o que as amostras de fase gasosa foram analisados ​​por cromatografia em fase gasosa. Este procedimento foi feito inicialmente por sacrificar os animais e remover seus estômagos. Resultados semelhantes, no entanto, foram obtidas por remoção dos estômagos dos animais vivos que tinham sido anestesiados. A quantidade de acetona associado com tecido gástrico para cada ratinho individual variado, variando de ~ 10-110 μmols acetona por grama de tecido em peso húmido (Fig. 4), com a maioria dos valores (6/7) que cai na gama de 10 e 35 μmols acetona por grama de peso de tecido húmido. Estes dados sugerem que quantidades milimolares de acetona estão associadas com o tecido gástrico do rato e poderia estar disponível como uma potencial fonte de carbono ou energia para H. pylori
. Este nível de acetona associados com o tecido gástrica do rato foi mais elevada do que o esperado uma vez que os níveis séricos de corpos cetónicos variar em humanos e outros mamíferos geralmente variam de < 0,5 mM a alguns milimolar [23]. A acetona é produzido nos mamíferos pela descarboxilação espontânea de acetoacetato e esta descarboxilação é aumentada em pH baixo, e assim por acetona pode acumular-se no estômago devido à acidez gástrica. Figura 4 níveis de acetona associado com tecido gástrico mouse. níveis de acetona estômago foram determinados para três murganhos após sacrificar os animais e removendo imediatamente seus estômagos (post-mortem), e por quatro ratinhos que foram anestesiados após o que os seus estômagos foram removidos (pré-mortem). estômagos de ratinho excisadas foram colocados imediatamente em frascos selados que foram então colocadas em gelo durante pelo menos 30 minutos para permitir que a acetona associados com o tecido gástrico equilibrar-se com a fase de gás. níveis de acetona em fases de gás dos frascos foram medidos por cromatografia gasosa e estimado a partir de curvas padrão geradas para cada frasco. Cada valor representa uma média de pelo menos três medições e barras de erro indicam os desvios-padrão para cada amostra.
Discussão
Nós fornecemos evidências de que a H. pylori
possuir uma carboxilase acetona funcional como postulado anteriormente pela Ensign e co -trabalhadores [15]. O H. pylori acxABC
operon está perto do scoAB Comprar e fadB
genes que codificam enzimas do SCOT e acetoacetil-CoA tiolase. Assim, este agrupamento de genes codifica um conjunto de enzimas capazes de metabolizar acetona a acetil-CoA. Acetil-CoA produzido a partir de acetona e acetoacetato poderia contribuir para o ciclo TCA para fornecer energia para H. pylori
. Como observado por Pflock e co-trabalhadores a acxABC
operão e outros genes associados com o metabolismo acetona estão presentes em H. acinonychis
[24]. Estes genes estão ausentes, no entanto, no outro intimamente relacionado ε-Proteobacteria cujos genomas foram sequenciados até agora, que inclui Helicobacter hepaticus
, Campylobacter jejuni
, Thiomicrospira denitrificans
, e Wolinella succinogenes
. A aquisição e manutenção do grupo de genes do metabolismo acetona em H. pylori Comprar e H. acinonychis
pode estar relacionado ao fato de que, ao contrário destes outros relacionados ε-Proteobacteria, eles colonizar a mucosa do estômago. O agrupamento destes genes e a ausência de genes ortólogos em outros intimamente relacionados ε-Proteobacteria poderia indicar possível aquisição destes genes por H. pylori e H.
acinonychus
através da transferência lateral de genes. O teor de G + C do presente aglomerado de genes do metabolismo de acetona em H. pylori
é ligeiramente mais elevada do que a média por todo o genoma, mas este facto deve-se aos produtos destes genes sendo muito rico em glicina (~ 10% comparar a 6% média genoma). Além disso, as características de composição destes genes, tais como dinucleotidicos abundâncias relativas e desvio de codões, não são indicativos de transferência lateral recente desta região [25] (J. MRAZEK, comunicação pessoal).
Jungblut e colaboradores relataram que H . pylori
AcxC (HP0698) reagiram de forma cruzada com anticorpos a partir de um adenocarcinoma do paciente, o que indica que o H. pylori acxABC
operão é expresso no hospedeiro [26]. Além disso, mostramos aqui que a H. pylori pode encontrar
níveis significativos de acetona no estômago do rato e assim que este composto pode servir como um importante doador de electrões respiratória para a bactéria no hospedeiro. Consistente com esta hipótese, a H. pylori acxB
mutante foi significativamente reduzida na sua capacidade de colonizar o estômago do rato qual se infere resulta da incapacidade do mutante de utilizar acetona como fonte de energia. A incapacidade de acetona para estimular o crescimento de H. pylori
SS1 em cultura líquida pode resultar da falha dos meios de crescimento usados ​​para imitar as condições de crescimento encontrados pela bactéria quando colonizar a mucosa gástrica. Uma hipótese alternativa para o defeito colonização do acxB
mutante é que a carboxilase de acetona é necessária para a desintoxicação de acetona. No entanto, a nossa incapacidade para observar qualquer inibição no crescimento do acxB
mutante através da adição de acetona, no meio de cultura argumenta contra esta última hipótese. Outra possibilidade é que os produtos do operão acxABC
catalisar uma reacção desconhecida que é importante para a sobrevivência ou crescimento de células de H. pylori
na mucosa gástrica. Além disso caracterização bioquímica dos produtos do H. pylori acxABC
operão deve ajudar a distinguir entre estas possibililties.
Uma análise recente transcriptoma de H. pylori
26695 utilizando um microarray genoma inteiro sugeriu que o regulador de resposta HP1021 fortemente activado transcrição de acxABC
e scoAB
, e transcrição activado de fadA
hp0693 e, em menor medida [24]. Os autores deste estudo mostrou que HP1021 liga região reguladora do promotor de acxABC
, sugerindo que este regulador resposta medeia directamente os seus efeitos sobre a transcrição de acxABC
e que os genes dentro do cluster metabolismo acetona fazem parte de um regulon controlada por HP1021. Pflock e seus colegas identificaram 79 genes em H. pylori
26695 cuja expressão foi alterada no mutante HP1021 - 51 genes foram transcritas em níveis mais baixos do mutante, enquanto 28 genes foram expressos em níveis mais elevados [24]. HP1021 difere da maioria dos outros reguladores de resposta em que falta o resíduo de aspartato-aceitar fosfato altamente conservada, e uma histidina quinase cognata para HP1021 não foi identificado. Existem relatos contraditórios sobre a transcrição de HP1021 em resposta a pH ácido, bem como sobre a transcrição de H. pylori acxABC
em resposta a um pH mais baixo [27-29]. Estas diferenças podem ser devido à forma em que as bactérias foram cultivadas. Embora estes relatórios conflito no que diz respeito a transcrição de HP1021 em resposta a pH ácido, os resultados de ambos os estudos indicam que as condições que levam à diminuição da regulação de HP1021 resultado num aumento da expressão de acxABC
. Isso parece contraditório dada a aparente papel do HP1021 na activação de transcrição de acxABC
.
A única outra bactéria para a qual foi examinada regulação do acxABC
operon é X. autotrophicus
. controle transcricional de acxABC
em X. autotrophicus
difere daquela em H. pylori
. X. autotrophicus
carece de um homólogo de HP1021, mas em vez regula a transcrição de acxABC
através σ 54 (RPON) e o σ activador 54-dependente AcxR [15]. Embora H. pylori
possui σ 54, o acxABC
operon não faz parte do H. pylori
RPON regulon [30].
Apesar de nossa observação de que a interrupção de acxB
afeta negativamente a colonização de ratos por H. pylori
SS1, recentes estudos de genoma microarray inteiros com cinquenta e seis estirpes globalmente representativos do H. pylori Comprar e quatro H. acinonychis
estirpes indicaram que o acxABC
genes não estão presentes em todos H. pylori
estirpes [31]. Seria interessante determinar se os isolados falta acxABC
são menos competitivos em colonizar seus hospedeiros naturais do que as estirpes que possuem esses genes. Alternativamente, as estirpes falta acxABC
pode ter adaptações que compensam a falta de atividade acetona carboxilase. Os resultados dos estudos de microarranjos por Gressmann e seus colegas indicaram que scoAB
, fadA
, HP0693 e HP0694 estavam presentes em todo o H. pylori Comprar e H. acinonychis
cepas analisadas [31]. Assim, a pressão selectiva de manter a capacidade de utilizar acetoacetato como um potencial dador de electrões em H. pylori e H.
acinonychis
parece ser maior do que aquele para o metabolismo de acetona.
Conclusão O H
. pylori acxABC
operão provavelmente codifica acetona carboxilase que catalisa a conversão de acetona em acetoacetato e está intimamente relacionado com os genes cujos produtos estão previstos para catalisar a conversão sequencial de acetoacetato de acetil-CoA. Inspecção dos genomas de outros intimamente relacionados ε-Proteobacteria sugere que os genes envolvidos no metabolismo de acetona só estão presentes em bactérias dentro desta subfilo que coloniza a mucosa gástrica. O acxABC
operon não era essencial para a colonização do mouse por H. pylori
SS1, mas pareceu melhorar colonização. Além disso caracterização do H. pylori putativo
acetona carboxilase e os produtos de outros genes dentro do cluster gene metabolismo acetona deve fornecer insights sobre como os corpos cetônicos a partir do host contribuir para as economias metabólicas do H. pylori Comprar e H . acinonychis
e como estes compostos impacto a capacidade destas bactérias para colonizar seus hospedeiros.
Métodos
cepas bacterianas e mídia
construção e clonagem de plasmídeo foi feito em E. coli estirpe DH5a
que foi cultivado em meio de Luria-Bertani a 37 ° C. H. pylori
estirpe 26695 foi utilizado como molde para a reacção em cadeia da polimerase (PCR). H. pylori
SS1 foi usado como a estirpe de tipo selvagem para todas as experiências e foi cultivada em ambos agar de sangue ou agar de soja tríptica suplementado com 5% de soro de cavalo (TSA-soro) a 37 ° C sob uma atmosfera de 4% O 2, 5% de CO 2 e 91% N 2. Quando cultivadas em meio líquido, H. pylori
culturas foram cultivadas em caldo de Mueller-Hinton suplementado com soro de cavalo a 5% e 30 ug /ml de bacitracina ou o meio de crescimento definido descrito por Bruggrabber e colaboradores [22]. Culturas cultivadas (10-15 ml médio) foram cultivadas em 150 ml de soro frascos selados com Teflon discos de 20 mm /silicone e tampas de alumínio e sob uma atmosfera de 4% O 2, 5% de CO 2, 10 % H 2, 81% N 2. A menos que indicado de outra forma, quando os antibióticos foram incluídos no meio foram adicionados às seguintes concentrações: 100 ug /ml de ampicilina, 30 ug /ml de cloranfenicol, 200 ug /ml de bacitracina 10 ug /ml de vancomicina, e 10 ug /ml de anfotericina B.
Inactivação de acxB
(HP0696) em H. pylori
SS1
Um 2.3-kb fragmento de DNA que levou acxB
foi amplificado por PCR a partir de H. pylori
estirpe 22695 e clonado em pGEM-T (Promega). Um gato
cassete foi introduzida neste plasmídeo numa Eco 47III
sítio localizado aproximadamente no meio da clonado acxB
. O plasmídeo resultante foi usado como um vector suicida para inactivar a cópia cromossómica do acxB
em H. pylori
SS1. O vector suicida foi introduzido em H. pylori ATCC 43504
estirpes e SS1, uma estirpe que pode colonizar murganhos. Devido passagem repetida de H. pylori
estirpe SS1 em meio foi relatada como resultando em perda de infecciosidade em ratinhos, o acxB
mutante foi construído de um isolado de fresco da estirpe SS1 recuperado a partir de um rato infectado. O número de passagens de acxB
mutante na estirpe SS1 foi limitada e registada, e o mutante foi armazenado congelado a -80 ° C. A estirpe parental SS1 foi mantida congelada e armazenada de uma maneira idêntica. Foi confirmada por PCR que a cópia cromossómica do acxB
foi interrompida por troca alélica com a cópia de origem de plasmídeo do gene utilizando um conjunto de iniciadores que flanqueavam o local de ruptura. As curvas de crescimento de H. pylori para


estirpes de H. pylori a partir de placas
células TSA-soro em que as estirpes foram listradas no dia anterior foram suspensos em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e usadas para inocular meio líquido a um OD <> sub 600 de 0,03. Onde indicado, acetona foi adicionado assepticamente ao meio. As amostras foram retiradas a tempos e densidades celulares diferentes foram medidos por varrimento de luz em OD 600. Alternativamente, as contagens de células viáveis ​​foram determinados após a diluição em série das amostras e plaqueamento em TSA-soro. Após 4 a 5 dias de incubação, o número de unidades formadoras de colónias (CFU) foram determinadas para as placas.
Rato colonização
ensaios de colonização de rato foram realizados essencialmente como descrito anteriormente [32]. Estes procedimentos cumprido as diretrizes federais relevantes e políticas institucionais para o cuidado e tratamento dos animais de laboratório. Resumidamente, H. pylori
células foram colhidas após 48 h de crescimento em placas de agar de sangue e suspensas em PBS a uma DO 600 de 1,7. Headspace no tubo foi aspergida com árgon para minimizar a exposição ao oxigénio.

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