De menselijke maag-pathogeen Helicobacter pylori heeft een potentieel aceton carboxylase dat haar vermogen om mice

het menselijke maag-pathogeen Helicobacter pylori
heeft een potentieel aceton carboxylase dat zijn vermogen om muizen
Abstracte achtergrond
koloniseren verbetert koloniseren verbetert Helicobacter pylori
koloniseert de menselijke maag en is de etiologische agent van maagzweer. Alle drie de H. pylori
stammen die zijn gesequenced tot op heden bevatten een potentiële operon waarvan de producten delen homologie met de subeenheden van aceton carboxylase (gecodeerd door acxABC
) van Xanthobacter autotrophicus
stam PY2 en Rhodobacter capsulatus
stam B10. Aceton carboxylase katalyseert de omzetting van aceton om acetoacetaat. Genen stroomopwaarts van het vermoedelijke acxABC
operon coderen voor enzymen die acetoacetaat omzetten acetoacetyl-CoA, dat verder wordt omgezet in twee moleculen van acetyl-CoA genereren.

Resultaten Om te bepalen of H. pylori acxABC
operon heeft een rol in de gastheer kolonisatie acxB
homoloog in de muis aangepaste H. pylori
SS1 stam werd geïnactiveerd met een chlooramfenicol-resistentie (cat
) cassette. In muizen kolonisatie studies aantallen H. pylori
gewonnen uit muizen geïnoculeerd met de acxB: kat
mutant algemeen 1-2 orden van grootte lager dan die gewonnen uit muizen geïnoculeerd met de ouderstam. Een statistische analyse van de gegevens met behulp Wilcoxin rank test gaf de verschillen in aantallen H. pylori
geïsoleerd uit muizen geïnoculeerd met de twee stammen waren significant op het 99% betrouwbaarheidsniveau. Niveaus van aceton in verband met de maag weefsel verwijderd uit niet-geïnfecteerde muizen werden gemeten en bleek te variëren 10-110 umol per gram nat gewicht weefsel
Conclusie Ondernemingen De kolonisatie defect van de acxB:. Kat
mutant suggereert een rol de acxABC
operon in overleving van de bacterie in de maag. Producten van de H. pylori acxABC
operon kan voornamelijk functioneren in aceton gebruik of kan een reactie die soortgelijk is belangrijk voor de overleving of groei in de gastheer katalyseren. H. pylori
stuit significante niveaus van aceton in de maag dat hij kan gebruiken als een potentiële elektronendonor voor microaerobic ademhaling. Achtergrond
Helicobacter pylori
is een Microaërofiele, Gram-negatieve bacterie die een belangrijke pathogeen van het menselijke maagslijmvlies [1, 2]. Kolonisatie van het maagslijmvlies van H. pylori
leidt tot chronische ontsteking die kunnen ontwikkelen tot een verscheidenheid van ziekten, waaronder chronische gastritis, maagzweren, maagkanker en mucosa geassocieerde lymfomen [3-5]. Aangezien antimicrobiële therapie de gastheer waarschijnlijk een levenslange H. pylori
infectie van het maagslijmvlies lijden.
Het vermogen van H. pylori
te persisteren in het menselijke maag langdurig aangeeft dat het is goed aangepast aan de voedingsstoffen die het nodig heeft voor groei in deze unieke niche verwerven. Bijvoorbeeld, het slijmvlies van de maag van de muis bevat aanzienlijke hoeveelheden moleculaire waterstof (17-93 pM) afkomstig van metabole activiteit van de microbiële flora in de dikke darm [6]. H. pylori
gebruik kan maken van deze moleculaire waterstof als elektronendonor voor microaerobic ademhaling en een functionele hydrogenase vereist voor een succesvolle kolonisatie van muizen door H. pylori
[6, 7]. In tegenstelling tot veel waterstof oxiderende bacteriën echter H. pylori
niet kan autotrofe CO 2 fixatie.
Verschillende studies hebben het vermogen van H. pylori te gebruiken
verschillende koolstofbronnen onderzocht. H. pylori
heeft een beperkt vermogen tot verwerven en metaboliseren suikers, een observatie die consistent is met de analyse van de genomische sequenties van H. pylori stammen 22695
en J99 [8]. Glucose is de enige koolhydraat dat H. pylori
gebruik kan maken die zij wel via de Entner-Doudoroff-route [9, 10]. Aminozuren ook als koolstofbronnen voor H. pylori Kopen en worden bij voorkeur door H. pylori
gebruikt in groeimedia met een mengsel van glucose en aminozuren [9, 11]. Pyruvaat, een sleuteltussenproduct in centraal metabolisme, lijkt voornamelijk worden gegenereerd uit lactaat, alanine en serine, plaats van glucose in H. pylori
[12, 13]. Pyruvaat wordt omgezet in acetyl-CoA door pyruvaat: flavodoxine oxidoreductase in H. pylori
, die vervolgens kunnen worden gebruikt bij de tricarbonzuur (TCA) cyclus [14]. Bovendien kan alanine, lactaat, acetaat, formiaat en succinaat worden geproduceerd door H. pylori
cellen aëroob [12] geïncubeerd. De productie van acetaat en formiaat als stofwisselingsproducten suggereert het bestaan ​​van een gemengde zure fermentatie route in H. pylori
, hoewel zuurstof essentieel is voor groei van de bacterie [12].
Analyse van de genoomsequenties van H .
pylori stammen 26695, J99 en HPAG1 onthulde een potentieel operon van drie genen (aangeduid als HP0695, HP0696 en HP0697 H. pylori
26.695) waarvan de producten gedeelde 50-63% aminozuur identiteit tussen β , α en γ subeenheden van aceton carboxylase van Xanthobacter autotrophicus
stam PY2 en Rhodobacter capsulatus
stam B10 [15]. Homologen aceton carboxylase worden gevonden in een aantal bacteriën, maar de X. autotrophicus Kopen en R. capsulatus
enzymen het beste gekarakteriseerd. Aceton carboxylase katalyseert de ATP-afhankelijke carboxylering van aceton acetoacetaat en is vereist voor de groei van X. autotrophicus Kopen en R. capsulatus hotels met aceton als enige koolstofbron en elektronendonor voor ademhaling [15-17]. X. autotrophicus
aceton carboxylase heeft een hoge affiniteit voor aceton (Km = 8 urn), maar de omloopsnelheid van het enzym is erg traag (~ 45 per min) [15]. Ter compensatie voor de lage omloopsnelheid van aceton carboxylase, X. autotrophicus
produceert grote hoeveelheden van het enzym (17-25% van de totale oplosbare proteïne) wanneer gekweekt op aceton [15]
Genen gelegen in de buurt van de H. pylori
HP0695-HP0696 HP0697-operon coderen enzymen aangetoond acetoacetaat omzetten acetoacetyl-CoA, dat verder wordt omgezet in acetyl-CoA [8, 18]. Aceton, acetoacetaat en β-3-hydroxybutyraat zijn ketonlichamen door zoogdierlijke periveneuze hepatocyten tijdens vetzuur afbraak en worden gebruikt als elektronendonor voor de ademhaling als koolhydraten niet beschikbaar [19]. Net zoals ketonlichamen zijn belangrijkste energiebronnen voor de mens wanneer koolhydraten niet beschikbaar zijn, kunnen deze verbindingen dienen als respiratoire electron donoren voor H. pylori
koloniseert het maagslijmvlies. Om te bepalen of de HP0695-HP0696-HP0697 operon heeft een rol in gastheer kolonisatie we HP0696 geïnactiveerd in H. pylori
stam SS1. De HP0696 mutant werd gecompromitteerd zijn vermogen om muizen suggereren dat aceton carboxylering of een verwante enzymatische activiteit gekatalyseerd door producten van het HP0695-HP0696 HP0697-operon koloniseren is een belangrijke bijdragende factor kolonisatie gastheer.
Resultaten
H. pylori
bevat een set van genen voorspeld worden betrokken in aceton metabolisme
De drie H. pylori
stammen waarvan het genoom is gesequenced bevatten een cluster van acht geconserveerde genen in een ~ 10 kb DNA-sequentie, waarvan zes coderen enzymen voorspeld aceton metaboliseren en acetoacetaat in acetyl-CoA (fig. 1 en 2). Helicobacter acinonychis
, een nauw verwante soort dat grote katachtigen infecteert, bezit ook dit gen cluster. Zoals hierboven aangegeven, drie van deze genen delen homologie met acxABC
, hoewel de eerste twee genen in het operon zijn aangegeven genen die coderen hydantoïne gebruik proteïne A en methylhydantoinase respectievelijk in de geannoteerde H. pylori
genomen. Hydantoïnasen katalyseren de hydrolyse van 5-ledige ringen door hydrolyse van een interne imidebinding en vaak vrij brede substraatspecificiteit. Van eiwitten in de gegevensbank waarvan biochemische functies zijn aangetoond, BLAST analyse bleek dat de voorspelde producten van de H. pylori
genen nauw overeenkomt met die van de Xanthobacter
sp. PY2 acxABC
operon (59-68% aminozuur identiteit over de volledige lengte van de drie voorspelde subeenheden). Voor de meest recente gesequenced H. pylori Kopen en H. acinonychis
genomen de laatste gen van het operon wordt geannoteerd als acxC
[20, 21]. Zo is de H. pylori
HP0695-HP0696-HP0697 operon codeert waarschijnlijk aceton carboxylase in plaats van hydantoinaseactiviteit, en we dus verwijzen naar dit operon als acxABC
. Figuur 1 Organisatie van de betrokkenen in aceton metabolisme in H. pylori en H. genen acinonychus stammen. Gene aanduidingen onder elke pijl (niet op schaal) weergegeven. Open leesramen die geen gen aanduiding gegeven in de geannoteerde genoomsequenties worden aangegeven met ofwel een hp aanduiding (H. pylori
26.695), een JHP aanduiding (H. pylori
J99), of alleen de open reading framenummer (voor H. pylori
HPAG1 en A. acinonychis
stam Sheeba). Orthologe genen in de vier stammen zijn dezelfde kleur. De genen jhp0628 in H. pylori
J99 en 0671 in H. pylori
HPAG1 overeen met een fusie van hp0688 en hp0689 van H. pylori
26695. H. pylori
J99 en HPAG1 hebben twee genen in deze regio, jhp0629 (HPAG1_0672) en jhp0630 (HPAG1_0672), dat een type II DNA-methyltransferase en een type II restrictie-enzym, respectievelijk coderen, en worden niet gevonden in H. pylori
26695. Functies van de producten van de genen in aceton metabolisme cluster zijn beschreven in de tekst. De voorgestelde functies van de producten van de omliggende genen: Feca
, ijzer (III) dicitrate transporteiwit; feoB
, ijzer (II) transporteiwit; dgkA
, diacylglycerol kinase; gyrA
, subunit Een DNA gyrase; dcuA
, anaërobe C4-dicarboxylaat transporter; en ansB
, asparaginase II.
figuur 2 Voorgestelde route voor aceton gebruik in H. pylori. De voorgestelde route voor de omzetting van aceton in acetyl-CoA in H. pylori Kopen en H. acinonychis
wordt getoond. Reacties en genen die coderen voor de enzymen die verantwoordelijk zijn voor het katalyseren van elke reactie wordt aangegeven
Twee andere genen binnen het gen cluster, SCoA
(HP0691) en Scob
(HP0692), coderen succinyl CoA:. Acetoacetaat CoA-transferase ( SCOT), die de omzetting van acetoacetaat plus succinyl-CoA katalyseert voor acetoacetyl-CoA plus succinaat [18]. Acetoacetyl-CoA geproduceerd door SCOT wordt verder gemetaboliseerd door acetoacetyl-CoA thiolase, dat wordt gecodeerd door Fada
(HP0690; gen wordt geannoteerd als THL
in H. pylori
J99 en AtoB
in H. pylori
HPAG1 en H. acinonychis
), twee moleculen van acetyl-CoA genereren van acetoacetyl-CoA plus coenzym A (CoA) [8]. De twee overige genen in deze cluster, HP0693 en HP0694, wordt voorspeld dat een korte keten vetzuur permease en een buitenste membraaneiwit respectievelijk coderen, en kunnen in het vervoer van acetoacetaat functie. Ondernemingen De acht genen in dit kandidaat aceton metabolisme cluster zijn aangebracht hetzelfde ten opzichte van elkaar in drie H. pylori
stammen, maar het cluster is georiënteerd in een van de twee mogelijke richtingen (fig. 1), die het optreden van DNA inversie in dit gebied tijdens de evolutie van H. pylori
. Aanpassing van het DNA sequenties van de drie stammen verkleinde de plaats van inversie ~ 40 bp stroomafwaarts van de acxC
homoloog en ~ 160 bp stroomopwaarts van het startcodon voor Fada
(gegevens niet getoond). Geen grote directe of omgekeerde herhalingen zijn gevonden in de buurt van deze regio's die betrokken zouden kunnen zijn in inversie, en dus we kunnen niet speculeren over het mechanisme voor deze inversie. H. pylori stammen
J99 en HPAG1, maar niet 26.695, er een voorspeld type II DNA-methyltransferase (jhp0629 en HPAG1_0673) en een type II restrictie-enzym (en jhp0630 HPAG1_0672) nabij het vermeende aceton metabolisme gencluster.
H. acinonychis
bezit het vermeende aceton metabolisme gencluster en de genen in de cluster zijn in dezelfde richting als die van H. pylori
J99. In H. acinonychis
deze genen liggen naast dgkA Kopen en gyrA
zoals ze zijn in H. pylori
, maar worden geflankeerd aan de andere kant van dcuA Kopen en ansB
. De Feca Kopen en feoB
genen, die zich in de buurt van het aceton metabolisme gen cluster in de H. pylori
stammen, zijn ~ 69 kb van dit gen cluster in H. acinonychis
. Aldus is de relatieve opstelling van de genen in aceton metabolisme cluster bleef opmerkelijk geconserveerd tijdens de evolutie van H. pylori Kopen en H. acinonychis
hoewel het aangrenzende gebied in de genomen van deze twee soorten heeft ondergaan . uitgebreide herschikkingen Ondernemingen De H. pylori acxB: kat
mutant deficiënt is in zijn vermogen om muizen te koloniseren
acxB
gen in H. pylori
SS1, dat is een muis aangepaste stam , werd verstoord met een chlooramfenicol weerstand (cat
) cassette. Culturen van wild-type H. pylori
SS1 en de acxB: kat
mutant werden gekweekt in Mueller-Hinton bouillon aangevuld met paard serum of een eerder beschreven gedefinieerd medium [22]. Verschillende hoeveelheden aceton variëren van 1,3 mM tot 26 mM werden in de groeimedia te bepalen of aceton beïnvloed groei van beide stam. Celgroei werd gevolgd door levensvatbare cellen en optische dichtheden van culturen op verschillende tijdstippen. Waaronder aceton in beide groeimedia had geen effect op de groeisnelheid of definitieve cel opbrengst van H. pylori
SS1 of acxB: kat
mutant (gegevens niet getoond). Het falen van aceton om de groei van H. pylori
SS1 te stimuleren onder de geteste omstandigheden is niet onverwacht, aangezien de groei van media voor H. pylori
is zeer voedselrijk. Deze bevindingen suggereren ook dat acxABC
niet vereist voor ontgifting aceton
Het vermogen van de acxB. Kat
mutante muizen te koloniseren werd vergeleken met die van de ouderlijke H. pylori stam SS1
in twee aparte trials. In beide onderzoeken werden elf muizen ingeënt met de wild-type stam en elf werden geënt met de acxB: kat
mutant. Drie weken na inoculatie van de muizen met de H. pylori stammen
werden de muizen gedood en de aantallen H. pylori
in de maag van de dieren bepaald. Voor de muizen die waren geïnoculeerd met wildtype meeste dieren (19/22 dieren) had H. pylori
tellingen die ruim boven de detectielimiet waren, die 500 cfu per gram maag (Fig. 3). Het aantal H. pylori
in monsters die boven de detectielimiet waren varieerde van 10 4-10 6 kve per gram maag. De meeste van de muizen geïnoculeerd met de acxB: kat
mutant had ook meetbare niveaus van H. pylori
(15/22 dieren), maar het aantal H. pylori
verbonden aan deze muizen waren in het algemeen één tot twee orden van grootte lager dan die in muizen die geïnoculeerd waren met het wildtype. Een statistische analyse van de gegevens met behulp Wilcoxin rank test vastgesteld dat de verschillen in het aantal H. pylori
geïsoleerd uit muizen geïnoculeerd met de twee stammen waren significant op het 99% betrouwbaarheidsniveau aangeeft dat aceton carboxylase versterkt het vermogen van H. pylori
SS1 naar de maag van de muis te koloniseren. Omdat we niet in staat om de acxABC
operon klonen konden we niet controleren door complementering dat de acxB
mutatie was verantwoordelijk voor het defect in de kolonisatie. Het is echter onwaarschijnlijk dat de kolonisatie van het fenotype acxB
mutant werd veroorzaakt door polaire effecten aangezien er geen extra genen in het operon acxABC
één der drie H. pylori stammen
wiens genoom zijn sequentie bijgewerkt (fig. 1). Bovendien is de kolonisatie defect is niet waarschijnlijk te wijten aan verzwakking of een secundaire mutatie omdat we de acxB
mutant gebouwd in een frisse isolaat van stam SS1 hersteld van een besmette muis. Figuur 3 Mouse kolonisatie assay van H. pylori SS1 en een isogene acxB: kat mutante stam. De gegevens worden gepresenteerd als een scatterplot kolonievormende eenheden per gram maag zoals bepaald door plaattellingen. Elke vlek geeft het aantal CFU van één muis, uitgedrukt als de waarde van log10 (cfu /g maag) in de Y-as. De basislijn [log10 (kve maag /g) = 2,7] is de detectiegrens van de assay, die de telling onder 500 cfu maag /g vertegenwoordigt.
Aceton niveaus in de maag muis
Aangezien de gegevens van de muis kolonisatie assays gesuggereerd dat het vermogen om aceton te benutten door H. pylori
was belangrijk voor een effectieve gastheer kolonisatie, wilden we om te bepalen of H. pylori
ondervonden significant aceton niveaus in de maag van de muis. Hoewel aceton spiegels gemeld voor diverse lichaamsvloeistoffen, waren wij niet bewust van rapporten aceton die samenhangen met maagsap of weefsel. Daarom meten we aceton die samenhangen met de muis de maag weefsel na snel verwijderen van de magen van muizen en onmiddellijk de magen te plaatsen in afgesloten serum flesjes. Omdat we wilden aceton niveau dat H. pylori
kon tegenkomen tijdens persistente infectie te schatten, werden de voor deze studie dieren gehouden op een regelmatige voeding schema en werden in de ochtend opgeofferd voorafgaand aan het ontvangen van hun normale dagelijkse voedsel toewijzing. De verzegelde flesjes serum bevattende de muizen magen werden geïncubeerd op ijs om de aceton in verband met de gastrische weefsels in evenwicht met de gasfase in de flesjes, waarna gasfase monsters werden geanalyseerd met gaschromatografie. Deze procedure werd oorspronkelijk uitgevoerd door het opofferen van de dieren en het verwijderen van de maag. Vergelijkbare resultaten werden echter verkregen door het verwijderen van de maaginhoud uit levende dieren die verdoofd waren. De hoeveelheid aceton geassocieerd met maag- weefsel voor elke individuele muis verschillen: van ~ 10-110 umol aceton per gram natgewicht weefsel (fig. 4), met de meeste waarden (6/7) vallen in het traject van 10 en 35 umol aceton per gram nat gewicht weefsel. Deze gegevens suggereren dat millimolair hoeveelheden aceton geassocieerd met muis maagweefsel en beschikbaar kan zijn als potentiële koolstof of energiebron voor H. pylori
. Dit niveau aceton geassocieerd met de muis maagweefsel was hoger dan verwacht omdat we serum ketonlichamen variëren bij mensen en andere zoogdieren in het algemeen van <, 0,5 mM tot enkele millimolair [23]. Aceton wordt geproduceerd in zoogdieren door de spontane decarboxylering van acetoacetaat en deze decarboxylering wordt verbeterd bij lage pH, aceton enzovoort kunnen ophopen in de maag door maagzuur. Figuur 4 Aceton die samenhangen met de muis maagweefsel. Maag aceton werden bepaald drie muizen na het opofferen van de dieren onmiddellijk verwijderen van de maag (post mortem) en vier muizen die werden verdoofd waarna hun magen werden verwijderd (pre-mortem). Uitgesneden muis magen werden onmiddellijk afgesloten flesjes die vervolgens op ijs geplaatst gedurende ten minste 30 minuten om aceton verband met de gastrische weefsels in evenwicht met de gasfase gebracht. Aceton niveaus in de gas fase van de flesjes werden gemeten met gaschromatografie bepaald standaardcurven gegenereerd voor elk flesje. Elke waarde vertegenwoordigt een gemiddelde van ten minste drie metingen en fout balken geven de standaardafwijking voor elk monster.
Discussion
Wij leveren het bewijs dat H. pylori
beschikken over een functionele aceton carboxylase zoals eerder gepostuleerd door Ensign en co -workers [15]. De H. pylori acxABC
operon ligt vlakbij de scoAB Kopen en FADB
genen die coderen voor de enzymen SCOT en acetoacetyl-CoA thiolase. Aldus is deze gencluster codeert voor een set van enzymen die in staat metaboliseren aceton in acetyl-CoA. Acetyl-CoA geproduceerd uit aceton en acetoacetaat kan worden meegenomen in de TCA cyclus om energie voor H. pylori
. Zoals waargenomen door Pflock en medewerkers de acxABC
operon en andere genen geassocieerd met aceton metabolisme aanwezig zijn in H. acinonychis
[24]. Deze genen afwezig zijn, echter, in andere nauw verwante ε-Proteobacteria genomen waarvan nu toe zijn gesequenced, wat Helicobacter hepaticus
, Campylobacter jejuni
, Thiomicrospira denitrificans
en Wolinella succinogenes
omvat. De aanschaf- en onderhoudskosten van de aceton metabolisme gencluster van H. pylori Kopen en H. acinonychis
kan worden gerelateerd aan het feit dat, in tegenstelling tot deze andere verwante ε-Proteobacteria Zij koloniseren het maagslijmvlies. De clustering van deze genen en het ontbreken van orthologe genen in andere nauw verwante ε-Proteobacteria kunnen mogelijke overname van deze genen aangeven door H. pylori Kopen en H. acinonychus
met laterale genoverdracht. Het G + C inhoud van deze cluster aceton metabolisme genen in H. pylori
is iets hoger dan het gemiddelde van het gehele genoom, maar dit lijkt door de producten van deze genen zijn zeer rijk aan glycine (~ 10% vergelijk tot 6% genoom gemiddeld). Bovendien compositorische kenmerken van deze genen, zoals dinucleotide relatieve abundanties en codon bias, zijn niet indicatief voor de recente zijdelingse overdracht van deze regio [25] (J. Mrázek, persoonlijke communicatie).
Jungblut en collega's meldde dat H . pylori
AcxC (HP0698) cross-reageerde met antilichamen uit een adenocarcinoom patiënt, wat aangeeft dat de H. pylori acxABC
operon wordt uitgedrukt in de host [26]. Bovendien tonen wij hier dat H. pylori
kunnen grote hoeveelheden aceton in de maag van de muis tegen en dus deze verbinding kan dienen als een belangrijke respiratoire elektronendonor voor de bacterie in de gastheer. Consistent met deze hypothese, werd de H. pylori acxB
mutant aanzienlijk verminderd in zijn vermogen om de maag muis die we afleiden resultaat van het feit dat de mutant aceton als energiebron gebruiken koloniseren. Het onvermogen aceton om de groei van H. pylori
SS1 in vloeibare kweek te stimuleren kan resulteren uit het falen van de groeimedia gebruikt groeiomstandigheden waarmee de bacterie bij kolonisatie van de maagslijmvlies nabootsen. Een alternatieve hypothese voor de kolonisatie van het defect acxB
mutant is dat aceton carboxylase nodig voor detoxificatie aceton. Echter, ons niet opslaan van remming van de groei van de mutant acxB
waarnemen door toevoeging van aceton in het kweekmedium pleit tegen deze laatste hypothese. Een andere mogelijkheid is dat de producten van de acxABC
operon katalyseren onbekende reactie die belangrijk is voor de overleving of celgroei van H. pylori
in het maagslijmvlies. Verdere biochemische eigenschappen van de producten van de H. pylori acxABC
operon zou moeten helpen om onderscheid te maken tussen deze possibililties.
Een recent transcriptoom analyse van H. pylori
26695 met behulp van een hele genoom microarray gesuggereerd dat de respons regulator HP1021 sterk geactiveerd transcriptie van acxABC
en scoAB
en geactiveerde transcriptie van FADA Kopen en hp0693 in mindere mate [24]. De auteurs van deze studie toonden aan dat HP1021 bindt de promoter regulerende regio acxABC
, wat suggereert dat deze reactie toezichthouder direct medieert de effecten op transcriptie van acxABC Kopen en dat de genen in de aceton metabolisme cluster behoren tot een regulon gecontroleerde door HP1021. Pflock en collega's die 79 genen in H. pylori
26.695 wiens expressie veranderd in de HP1021 mutant - 51 genen getranscribeerd op lagere niveaus in de mutante terwijl 28 genen tot expressie op hogere niveaus [24]. HP1021 verschilt van de meeste andere respons regulatoren doordat het mist de sterk geconserveerde-fosfaat residu accepteren aspartaat en histidine een verwant kinase HP1021 niet geïdentificeerd. Er zijn tegenstrijdige rapporten over de transcriptie van HP1021 reactie op zure pH, en de transcriptie van H. pylori acxABC
reactie op lagere pH [27-29]. Deze verschillen kunnen het gevolg zijn van de wijze waarop de bacteriën werden gekweekt. Hoewel deze meldingen conflict met betrekking tot transcriptie van HP1021 reactie op zure pH, resultaten van beide studies aan dat omstandigheden die leiden tot neerwaartse regulatie van HP1021 leiden tot verhoogde expressie van acxABC
. Dit lijkt contra-intuïtief, gezien de duidelijke rol van de HP1021 in het activeren van transcriptie van acxABC
. Ondernemingen De enige andere bacterie waarvoor regulering van de acxABC
operon is onderzocht is X. autotrophicus
. Transcriptionele controle van acxABC
in X. autotrophicus
verschilt van die in H. pylori
. X. autotrophicus
mist een homoloog van HP1021, maar regelt transcriptie van acxABC
via σ 54 (RpoN) en de σ 54-afhankelijke activator AcxR [15]. Hoewel H. pylori
bezit σ 54, de acxABC
operon is geen onderdeel van de H. pylori
RpoN regulon [30].
Ondanks onze waarneming dat verstoring van acxB
nadelig voor kolonisatie van muizen door H. pylori
SS1, recente whole genome microarray studies met zesenvijftig hele linie een representatieve stammen van H. pylori
en vier H. acinonychis
stammen aangegeven dat de acxABC
genen niet aanwezig zijn in alle H. pylori
stammen [31]. Het zou interessant zijn om te bepalen of de isolaten ontbreekt acxABC Wat zijn minder concurrerend in het koloniseren van hun natuurlijke gastheren dan stammen die deze genen bezitten. Als alternatief, stammen ontbreekt acxABC
kunnen aanpassingen die compenseren voor het gebrek aan aceton carboxylase activiteit. De resultaten van de microarray studies van Gressmann en collega's aangegeven dat scoAB
, FADA
, HP0693 en HP0694 aanwezig in alle H. pylori
waren en H. acinonychis
stammen onderzocht [31]. Dus de selectieve druk van het mogelijk blijft acetoacetaat gebruiken als potentiële elektronendonor in H. pylori Kopen en H. acinonychis
blijkt groter te zijn dan voor aceton metabolisme.
Conclusie Ondernemingen De H . pylori acxABC
operon codeert waarschijnlijk aceton carboxylase dat de omzetting van aceton acetoacetaat katalyseert en innig geassocieerd met genen waarvan de producten wordt voorspeld dat de achtereenvolgende omzetting van acetoacetaat in acetyl-CoA katalyseren. Inspectie van genomen van andere nauw verwante ε-Proteobacteria suggereert dat genen die betrokken zijn bij het metabolisme aceton alleen aanwezig in bacteriën op deze subphylum het maagslijmvlies koloniseren. De acxABC
operon was niet essentieel voor de muis kolonisatie door H. pylori
SS1, maar het leek te kolonisatie te verbeteren. Verdere karakterisatie van de vermeende H. pylori
aceton carboxylase en de producten van de andere genen in de aceton metabolisme gencluster dienen beeld biedt ketonlichamen van de gastheer bijdragen aan de metabole economie van H. pylori Kopen en H . acinonychis Kopen en hoe deze verbindingen effect het vermogen van deze bacteriën hun gastheer koloniseren.

Werkwijzen Bacteriële stammen en media
Plasmide constructie en klonering werd gedaan in E. coli stam DH5a die
werd gekweekt in Luria-Bertani medium bij 37 ° C. H. pylori
stam 26695 werd gebruikt als de matrijs voor polymerase ketenreactie (PCR). H. pylori
SS1 werd gebruikt als wildtype voor alle experimenten en was gekweekt op zowel agar en tryptische soja-agar aangevuld met 5% paardenserum (TSA-serum) bij 37 ° C onder een atmosfeer van 4% O 2, 5% CO 2 en 91% N 2. Indien gekweekt in vloeibaar medium werden H. pylori
kweken in Mueller-Hinton-bouillon gekweekt aangevuld met 5% paardenserum en 30 ug /ml bacitracine of gedefinieerd groeimedium beschreven door Bruggrabber en medewerkers [22]. Kweken (10-15 ml gekweekt medium) werden gekweekt in 150-ml flesjes serum afgesloten met 20 mm Teflon /siliconen schijven met aluminium doppen en onder een atmosfeer van 4% O 2, 5% CO 2, 10 % H 2, 81% N 2. Tenzij anders aangegeven, als antibiotica in het medium opgenomen werden ze toegevoegd aan de volgende concentraties: 100 ug /ml ampicilline, 30 pg /ml chlooramfenicol, 200 ug /ml bacitracine 10 ug /ml vancomycine, en 10 ug /ml amfotericine B.
Inactivatie van acxB
(HP0696) in H. pylori
SS1
Een 2,3-kb DNA-fragment dat uitgevoerd acxB
werd versterkt door PCR uit H. pylori
stam 22.695 en gekloond in pGEM-T (Promega). Een kat
cassette werd geïntroduceerd in dit plasmide bij een Eco
47III plaats ongeveer in het midden van de gekloonde acxB
. Het resulterende plasmide werd gebruikt als suicide vector voor het inactiveren van de chromosomale kopie van acxB
van H. pylori
SS1. De zelfmoord vector werd ingebracht in H. pylori
stammen ATCC 43504 en SS1, een stam die muizen kunnen koloniseren. Vanwege herhaalde passage van H. pylori stam SS1
op medium is zou resulteren in verlies van infectiviteit bij muizen, werd de acxB
mutant geconstrueerd op een nieuwe isolaat van stam SS1 teruggewonnen uit een geïnfecteerde muizen. Het aantal passages van acxB
mutant in de SS1 stam was beperkt en worden vastgelegd en de mutant werd ingevroren bij -80 ° C. De parentale stam SS1 onderhouden en bevroren bewaard op dezelfde wijze. We bevestigd door PCR dat de chromosomale kopie van acxB
werd verstoord door allelische uitwisseling met het plasmide aanwezige kopie van het gen met een set primers die de site van verstoring geflankeerd.
Groeicurven voor H. pylori
H. pylori stammen

cellen van TSA-serum platen waarop de stammen werd uitgestreken op gisteren in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gesuspendeerd en gebruikt voor vloeibaar medium te inoculeren in een OD 600 van 0,03. Waar aangegeven, werd aceton aseptisch toegevoegd aan het medium. Monsters werden genomen op diverse tijdstippen en celdichtheden werden gemeten door lichtverstrooiing in OD 600. Alternatief werden levensvatbare cellen bepaald na seriële verdunning van de monsters en uitplaten op TSA-serum. Na 4-5 dagen incubatie werden de aantallen kolonievormende eenheden (cfu) bepaald voor de platen.
Muis kolonisatie
muis kolonisatie assays werden in wezen uitgevoerd zoals eerder beschreven [32]. Deze procedures voldaan aan de betrokken federale richtlijnen en institutioneel beleid voor de zorg en behandeling van proefdieren. In het kort werden H. pylori
cellen geoogst na 48 uur groei op agarplaten en gesuspendeerd in PBS tot een OD 600 van 1,7. Headspace in de buis werd gespoeld met argon blootstelling zuurstof te minimaliseren.

• Genezing Potentieel van Picrorhiza kurroa (Scrofulariaceae) wortelstokken tegen-indomethacine geïnduceerde maagzweren: a. Mechanistische exploratie
• Dosis-afhankelijke remming van de maag letsel door waterstof in alkalisch geëlektrolyseerd drinkwater