Antioxidačná aktivita a ultrastrukturální zmeny v žalúdočnom rakovinových bunkových línií indukované severovýchodnej Thai jedlé plody ľudovej extracts

antioxidačnú aktivitu a ultrastrukturální zmeny v žalúdočnom rakovinových bunkových línií indukované severovýchodnej Thai jedlé ľudovej rastlinných extraktov
Abstract
pozadí
phytochemical výrobky majú kritickú úlohu v procese objavovania liekov. Táto nádejná možnosť však vyžaduje nutnosť potvrdenie ich vedecké overenie pred použitím. Z tohto dôvodu sa táto štúdia si kladie za cieľ vyhodnotiť (1) antioxidačné aktivity, (2) cytotoxicity potenciál, a (3), vplyv na ultrastrukturální zmeny v žalúdku nádorových bunkových línií v dôsledku vystavenia frakcií troch miestnych Northeastern Thai jedlých rastlín.
Metódy
Rastliny, Syzygium gratum, Justicia Gangetic stroje a Limnocharis flava
bola extrahovaná etyl-acetátom, a každý surový extrakt analyzované na celkový obsah fenolických látok metódou Folin-Ciocalteuovým. Ich antioxidačná aktivita bola stanovená s použitím systému ABTS. Extrakty boli potom testované na cytotoxicitu na dvoch žalúdočné rakovinové bunkové línie Kato III-a NUGC-4, a v porovnaní s Hs27 fibroblasty ako kontrolná za použitia MTT testu. Životaschopnosť buniek (%), IC 50 hodnoty, ako aj ultrastrukturální zmeny boli hodnotené po liečbe s jedným analýza rozptylu (ANOVA).
Výsledky
celkových fenolových hodnôt etyl-acetátové extrakty boli dobre koreluje s antioxidačné kapacity, sa extrahuje produktom S. gratum
zobrazovanie nad J. Gangetic stroje a L. flava
najvyššiu antioxidačné aktivity (10-krát vyšší odozvy), resp. Expozícia S. gratum stroje a J. Gangetic
výpisov normálnych bunkových línií (Hs27) viedlo v okrajových cytotoxicity účinky. Avšak, cez závislým od dávky teste S. gratum stroje a J. Gangetic
výťažkov vyrobených cytotoxicological účinky na o niečo viac ako 75 percent Kato-III a NUGC-4 bunkové línie. Okrem toho, proapoptotický charakteristika bola preukázaná na základe TEM u oboch bunkových línií karcinómu s týmito dvoma extraktov, pričom charakteristiky autofagie bol nájdený v bunkových líniách po následnej vydania výpisov z L. Flava
.
Závery
Z nich tri rastliny, S. gratum
mali najvyšší obsah fenolových zlúčenín a antioxidačné kapacity. Všetky z nich sa zistilo, že obsahujú zlúčeninu (zlúčeniny) s cytotoxicity in vitro
na rakovinových bunkách, ale nie na normálnych bunkových línií, ako je vyriešený v tkanivovej kultúre a ultrastrukturální analýzu. Toto je prvá správa ukázať účinok na bunkové zmeny ako apoptózy s ethylacetátového extraktu S. gratum stroje a J. Gangetic.
Ďalšie štúdie sa teraz zameriava na jednotlivých izolátov a ich funkcie, priority na S. gratum stroje a J. Gangetic
pre vývoj nových liekov a bojovníkov proti rakovine.
Kľúčové
karcinóm žalúdka ultraštruktúra bunkovej cytotoxicity TEM pozadí
rakovina žalúdka je štvrtým najčastejšie diagnostikovaná rakovina a druhým najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu v spojení vo svete [1]. Odhaduje sa, že tam bolo asi milión nových prípadov karcinómu žalúdka zaznamenané v roku 2008, ale z tých, väčšina (713900) boli hlásené v rozvojových krajinách s najvyšším výskytom rakoviny žalúdka nachádzajú vo východnej Ázii, cez strednej a východnej Európe, a Južná Amerika [1]. Napriek zdanlivej intenzifikáciu choroby, dôkazy naznačujú, že celková miera karcinómu žalúdka sa tomuto trendu vzpiera, s poklesom správ rakovinou žalúdka nájdený vo väčšine častiach západného sveta [2].
Pacientov s rakovinou Bohužiaľ väčšina žalúdočné sú často diagnostikovaná v pokročilom štádiu, keď liek nie je možná a liečba je paliatívna s úmyslom zlepšiť kvalitu a množstvo života. Aj keď sú liečebné pokyny pre rakovinu žalúdka, miera prežitia päť rokov menej ako 50% [3, 4]; sadzba, ktorá samozrejme nie je povzbudivé buď onkológov alebo rakovinou trpia. Okrem toho vedľajšie účinky Súčasná liečba tj chirurgia, chemoterapia a ožarovanie nie sú uspokojivé. Takže sú potrebné cielené terapie na zníženie vedľajších účinkov a zlepšiť klinické výsledky u pacientov. Z tohto dôvodu, výskumníci v tomto novom tisícročí venujú oveľa väčšiu pozornosť na rozvoj nielen nových terapeutických smerov a stratégií včasné prevencia rakoviny žalúdka [5, 6], ale aj na hľadanie nových a zamerať sa na špecifické terapeutických činidiel rovnako.
v priebehu posledných dvoch desaťročí, fytochemické produkty hrajú dominantnú úlohu v objavu nových liekov na cieľové rakoviny [7], s viac ako 60% z bežne používaných protinádorových činidiel sú odvodené z prírodných zdrojov [8]. Príklady celom svete klinicky užitočných protirakovinových činidiel odvodených od divých rastlín zahrňujú Taxol, vinblastín, vinkristín, deriváty kamptothecinu, topotekan (a pšeničných klíčkov), rakytníka rešetliakového, Lingzhi, irinotekan a etopozidu, ktorý je odvodený od epipodophyllotoxin [9, 10]. Iné sú odvodené z ovocia a zeleniny; nie je obmedzený na zahrnúť kurkumín (kurkuma), genistein (sójový), katechíny (zelený čaj) [7], ale aj byliny, ako sú alkaloidy vinca, Podofylotoxín, berberin, citróny trávy oleje, flavonoidy a kamptothecin; ďalšia skupina sľubných protinádorová činidla [11]. Hoci tieto protirakovinové látky boli použité pre cielené dráh mechanizmov založených na ich efektívne manipulácie vonkajšieho systému a štrukturálne apoptóza cesty sú stále predmetom skúmania [12-14]. Paclitaxel izolovať z kôry tichomorského tisu, Taxus brevifolia
je jedným fytochemické, ktorá ukazuje sľub. To je liek schválený z FDA, ktoré majú byť použité na liečbu AIDS, Kaposiho sarkóm, rakoviny prsníka, nemalobunkového karcinómu pľúc a vaječníkov. Jeho primárnou bunkový účinok má spôsobiť abnormálny stabilizácie dynamického polymerizácii mikrotubulov, čo vedie k zlyhaniu bunkového delenia vedie k apoptóze [15-17]. Avšak, paclitaxel sa tiež študovaná ako alternatívnej liečbe iných typov rakoviny, vrátane rakoviny žalúdka. Je v súčasnej dobe v klinických štúdiách fázy III [18, 19]. Bez ohľadu na to, či boli schválené alebo nie, široká dosahuje podpora a pokračovanie štúdií rastlinných extraktov s dôsledkami v žalúdku liečby rakoviny indikujú jeho úlohu, ktorú prírodné produkty zohrávajú v procese hľadania liekov.
Pri zvažovaní epidemiológie štúdie novo diagnostikovaných prípadov karcinómu žalúdka v Thajsku, oveľa nižší výskyt boli pozorované v severovýchodnej oblasti [20]. Aj keď je prevalencia Helicobacter pylori
infekcií, nelíšia naprieč severnej oblasti Thajska, nie zemepisný faktor (napríklad plošine, hornatej rozsah alebo džungli terénu) bol odlišný buď [21]. Preto musí existovať niečo iné centrálne voči obyvateľstvu v severovýchodnej oblasti, ktorá znižuje celkový výskyt rakoviny žalúdka. Ktoré majú všetky ale vylúčené, genetiku a environmentálne faktory, to bolo navrhol, že jedlé rastliny ľudové diéty, ktoré sú bežne spotrebujú v tomto regióne, môže držať odpoveď na tento rozpor. Táto nová dáta, a to sľubné vedenie nás veľmi vyzýva na tajuplné jav, teda či fytochemické zlúčeniny v Northeastern thajských jedlých ľudových rastlín má chemopreventivní alebo cytotoxický potenciál pre boj s rakovinou žalúdka, alebo iné vlastnosti. Z tohto dôvodu je táto štúdia bola vykonaná preto, aby vyhodnotenie cytotoxicity potenciál týchto miestnych jedlých rastlín. Osobitného záujmu, rastliny S. gratum
J. Gangetic stroje a L. Flava
boli vybrané na základe epidemiologických údajov, aby vznikol dojem, že oni sú najviac pravidelne jedlá ľudovej zelenina v severovýchodnej oblasti.
sme predpokladajú, že tieto rastliny mohli držať vo vnútri skrytých vlastností, ktoré by bolo možné zneužiť na boj proti tomuto rakovinu, a táto štúdia snaží zhodnotiť svoj potenciál. Hodnotíme surovej fenolové báze výťažky z týchto rastlín, a preukázať vysokú bunkovú apoptotické a cytotoxické účinky na dvoch bežných a porovnávacích žalúdočných rakovinových bunkových línií, Kato-III a NUGC-4.
Metódy
materiály Plant
Tri miestnej jedlé plody ľudovej; S. gratum
, J. Gangetic stroje a L. flava
(tabuľka 1) boli zakúpené z troch rôznych lokálnych trhoch v provincii Khon Kaen v severovýchodnej časti Thajska v priebehu októbra do decembra 2008. Tieto rastliny boli vybraná na základe informácií ethnobotanical [22-26] a epidemiologické údaje, ako bolo popísané vyššie. Správna taxonomické identifikáciu rastlinných druhov použitých pre túto štúdiu bola pod dohľadom botanikov z Ústavu botaniky a farmakológie, Farmaceutickú fakultu Univerzity Khon Kaen, Thailand.Table 1 menami troch rastlinných extraktov a ďalších výskumných referencií, terapeutické využitie v Tradičná thajská liek premietané v tejto štúdii
druhov [poukaz číslo]
Family (všeobecný názov anglický /Thai)
Uvádzané hlavnými zložkami
Terapeutické využitie v thajskej tradičnej medicíne

Jedlá časť
Ref.
Syzygium gratum
(Wight) SN Mitra var. Gratum
[Ch. Laongpol 6] a, c
Myrtaceae (Eugenia /Phak Mek, Zamat chun)
Doteraz jasne určené chemickou štruktúrou, ale dokázal byť silný v antioxidantov a prevencie oxidačnej a nitrosative zdôrazňuje
liečbe dyspepsia a zažívacie ťažkosti
Listy
22,23
Justicia Gangetic
L. [TK-PSKKU-0066] b
Acanthaceae (čínska fialová, tropický prvosienky /prijatý názov: Asystasia Gangetic
)
5,11-epoxymegastigmane glukozid (asysgangoside), salidrosidov, benzyl β-d-glukopyranozidu (6S
, 9R
) -roseoside, ajugol, apigenin-7-O
-β-d- glukopyranozidu apigenin 7-o
-neohesperidoside a apigenin 7-o
-β-d-Glukopyranosyl (1 → 6) -β-d-glukopyranozidu
Liečba bolesti žalúdka, žalúdočné červami, anti- astma
listy
24,25
Limnocharis flava
L. Buchenau [Patt. 173] c
limnocharitaceae (žltá abutilon, žltá Burr hlava /Talabhat Reus)
neurčeným
Predjedlo
Stem
26
aVoucher vzorky uložené pri lese Herbár (BKF), odbor National Park, Wildlife a ochrana rastlín, ministerstvo prírodných zdrojov, ü herbár fakulty of Pharmaceutical Sciences, University Khon Kaen a CZobrazí princ Songkla univerzitnú herbár (PSU), Katedra biológie Prírodovedeckej fakulty, princ Songkla University, Thajsko .
Príprava rastlinných extraktov
jedlé časti každej jednotlivej rastlinné odrody (tabuľka 1) boli opláchnuté sterilnou destilovanou vodou na odstránenie suť aj sušené v teplovzdušnej sušiarni pri teplote 50 ° C počas 7 dní. Po usušení, časti rastlín boli potom rozreže na malé kúsky a melie sa na jemný prášok za použitia trecej misky a kladivka. Každá zem prášok rastlinný materiál bol potom ponorený s prebytkom ethylacetátového rozpúšťadlá (Sigma-Aldrich Pte Ltd-, Singapur), v fľaši extrakcie. Zmesi etylacetátu boli potom inkubované na trepačke pri teplote miestnosti po dobu 72 hodín. V nadväznosti na tento proces, supernatanty potom boli prenesené do novej nádoby, a proces extrakcie etylesterom kyseliny octovej sa opakuje ešte trikrát, než supernatanty týchto triplikátech extrakciou sa spoja. Tie boli následne sa filtruje cez filtračný papier Whatman č.1, a odparí na rotačnej odparke. Tieto ukážkové extrakty potom boli použité v ďalších experimentoch.
Stanovenie celkového fenolové zlúčeniny
Celkom fenolových zlúčenín v rastlinných extraktov boli stanovené metódou Folin-Ciocalteuovým, ako je popísané Sachindra [27]. Stručne povedané, 0,2 ml každý rastlinný extrakt sa rozpustí v 50% DMSO (Santa Cruz Biotechnology Inc., Bangkok, Thajsko) oxiduje 1,0 ml 10-krát riedené Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich Pte-LTD, Singapur) a neutralizovaný s 0,8 ml roztoku 6% uhličitanu sodného (Sigma-Aldrich Pte-Ltd, Singapore). Po 1 h inkubácie sa Absorbancia roztoku sa meria pri 764 nm a výsledky boli vyjadrené ako miligramy gálová ekvivalent kyseliny na gram suchej hmotnosti (mg GAE /g). Tento test bol vykonaný v troch opakovaniach pre každú koncentráciu vzorky od 3 oddelených testoch.
Stanovenie antioxidačnej aktivity
Antioxidačné aktivita rastlinných extraktov bola stanovená spektrofotometricky za použitia systému ABTS v závislosti na spôsobe Re et al [28]. Stručne povedané, ABTS radikálne kácia (ABTS • +) zmes bola generovaná oxidáciou 7 mM ABTS (Sigma-Aldrich Pte-Ltd, Singapur) s 140 mM APS draselného (Sigma-Aldrich Pte-Ltd, Singapur), inkubované po dobu 16 hodín pri teplote miestnosti v tme. Antioxidačná aktivita bola stanovená pridaním 0,2 ml rastlinných extraktov s 1,8 ml ABTS • + radikálnej zmes katiónov. Po inkubácii zmesi po dobu 6 minút, bola zaznamenaná absorbancia pri 734 nm. ABTS • + akceptor radikálov schopnosť (%) z rastlinných extraktov boli vypočítané podľa rovnice: ABTS • + akceptor radikálov schopnosť (%) = [(Abs.control-Abs.test vzorky) /Abs. ovládanie] x100. Kde Abs.control je absorbancie kontrolná reakcia (bez rastlinného extraktu) a vzorka Abs.test je absorbancie v prítomnosti rastlinného extraktu. Výsledky boli porovnané s anti-vyplachovanie aktivity Troloxu (Sigma-Aldrich Pte Ltd-, Singapur) a reprezentovaný ako Troloxu ekvivalentné antioxidačné kapacity na gram suchej hmotnosti (TEAC /g). Tento test bol vykonaný v troch opakovaniach pre každú koncentráciu vzorky od 3 oddelených testoch.
Bunkové kultúre
dve ľudské bunkové línie karcinómu žalúdka Kato-III (ATCC No. HTB-103) z American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA) a NUGC-4 (JCRB0834) od Health Science Research Resources Bank (Japonsko vedy Foundation) boli použité pre in vitro
cytotoxické testy. Ľudské fibroblasty predkožky bunkové línie (ATCC Hs27 No.1634) bol použitý ako kontrola. Boli kultivované v sterilnom RPMI 1640 obsahujúcim 10% (v /v) fetálneho hovädzieho séra (Biochrom AG, Berlín), pri teplote 37 ° C, dodáva s 5% CO 2 v inkubátore. Bunky boli pestované v bežných fľašiach pre tkanivové kultúry a pri dosiahnutí 80% zhlukovania boli pasážovania s roztokom 0,25% trypsín-EDTA (Sigma-Aldrich Pte-Ltd, Singapore) každé 3-4 dni až do použitia.
In vitro
test cytotoxicity
Rastlinné extrakty boli hodnotené svoju cytotoxickú aktivitu proti Kato-III a NUGC-4 bunkových línií pomocou MTT kolorimetricky ako prvý popísal Mosmann [29] s úpravami navrhnutými Denizot a Lang [30]. Kultivované bunky (1 x 10 4 bunky) v kompletnom médiu boli prenesené do každej jamky rovno 96 jamkové doštičke a inkubované pri teplote 37 ° C vo zvlhčenej atmosfére vzduchu obohatenom 5% (v /v), CO 2 po dobu 24 h, aby sa nechal bunky pripojiť na dno každej jamky. Kultivované bunky boli potom ošetrené testovanou surového extraktu (v troch jamkách za stavu) pridaním 2 ul sériových riedení každého extraktu v koncentrácii 1,25, 2,5, 5, 10 a 20 ug /ml. Bunky potom boli kultivované ako je uvedené vyššie pre ďalšie 72 hodín pred pridaním 10 ul 5 mg /ml roztoku 3- (4, 5-dimetyl-thiazol-2-yl) -2, 5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) ( sigma-Aldrich Pte-Ltd, Singapore) do každej jamky. V inkubácii sa pokračuje po dobu ďalšie 4 hodiny a potom sa odstránia média. Zmes DMSO (150 ul) a glycínu (25 ul) bol pridaný do každej jamky a zmieša sa s cieľom zabezpečiť bunkovú lýzu a rozpúšťanie formasan kryštálov, predtým, než bola meraná absorbancie pri 540 nm. Tri replikácie každého experimentu boli vykonané a percento konverzie MTT jeho formazanový derivát pre každú jamku (percenta rastu buniek) bola vypočítaná delením OD pri 540 nm jamiek s riadením podľa rovnice: percento buniek rast = [A540 test - A540 nula] x 100 /[Ovládacie A540 - A540 nula]. Kde A540 nula = A540 roztoku potom, čo je bunka bola inkubovaná počas 24 hodín pred pridaním rastlinných extraktov; A540 test = A540 z roztoku po pridaní rastlinných extraktov; a regulácia A540 = A540 riešenie bez pridávania rastlinných extraktov. Okrem toho u netoxického zaistenie rastlinných extraktov proti normálnych buniek (fibroblastov bunková línia Hs27), dvojitú dávku (2 časy IC 50 Koncentrácia [10 ng /ml]) extraktov boli zamestnané a posudzovaných MTT test. Tento test bol vykonaný v troch opakovaniach pre každú koncentráciu vzorky od 3 oddelených testoch.
Polovica maximálnej inhibičnej koncentrácie (IC50)
Získaný absorbancie pri 540 nm bola použitá pre stanovenie percenta prežitie buniek za predpokladu, že sa získalo 100% prežitie ak sa nechajú reagovať s rozpúšťadlami iba ako ovládacie prvky, a žiadne rozdiely v metabolickej aktivity existoval medzi preživších buniek za odlišných podmienok. Za týchto predpokladov je percento prežitia ošetrených bunkových línií nádorových a normálnych kultivovaných buniek bola vypočítaná podľa tohto vzorca: Percento prežitia = (A540 liečených buniek /kontrola A540) x 100. Priemer ± 1 štandardnú odchýlku (SD) buniek prežitia (%) bola vynesená proti koncentrácii zodpovedajúce rastlinným extraktom a najvhodnejšie línia bola použitá pre odvodenie odhadovanej IC 50 hodnota z koncentrácie, ktorá by mohla poskytnúť 50% prežitie buniek.
koncentrácia rastlinné extrakty dáva 50% inhibičnej koncentrácie (IC 50) bola stanovená z troch oddelených pokusov. IC 50 jednotlivých rastlinných extraktov boli potom použité ako ošetrené koncentrácie na 0 a 3 dni proti Kato-III a NUGC-4, ktoré boli posudzované z apoptózy s použitím transmisný elektrónové mikroskopia (TEM). Test bol vykonaný v troch opakovaniach pre každú koncentráciu vzorky od 3 oddelených testoch.
Príprava vzoriek na transmisný elektrónové mikroskopia
Kato III-buniek (1x10 6 článkov) a NUGC-4 bunky (1x10 6 bunky) ošetrené s každým extrakt z rastliny, rovnako ako negatívne kontroly (neošetrené kultúre), boli vykonané oddelene. V stručnosti, boli opláchnuté roztokom D-Hankova (Life Technologies, Bangkoku v Thajsku) dvakrát, a dodáva do skúmaviek s plastovou škrabkou a následným odstredením pri 2000 otáčkach za minútu po dobu 15 minút, pričom supernatant bol odstránený. Zrazenina bola stanovená v roztoku obsahujúcom 4% glutaraldehydu (elektrónová mikroskopia Sciences, Bangkok, Thajsko) a 2% paraformaldehydu (elektrónová mikroskopia Sciences, Bangkok, Thajsko) v 0,1 M fosfátový pufer (PBS), pH 7,4, pri teplote 4 ° C po dobu 1 hodiny, potom sa premyje 0,1 M PBS na odstránenie ustaľovača. Vzorky boli fixované v 1% oxidu osmičelého (elektrónová mikroskopia Sciences, Bangkoku v Thajsku) v rovnakom pufri počas 30 minút, a dehydratáciu v odstupňované rade etanolu za každých 10 min. Potom boli vymazané s dvoma zmenami propylénoxidu a ponorí do sekvenčné zmesou propylénoxidu a Araldite 502 živice (Sigma-Aldrich Pte-Ltd, Singapore), v pomere 3: 1, 2: 1, 1: 2, a konečne vložené do čistej Araldite. Úseky 1 um boli znížené pomocou MT-2-Porter Blum ultramicrotome. Rezy boli následne namontované na medené mriežky, vysuší na vzduchu a následne porovnaná s 2% uranylacetátem (elektrónová mikroskopia Sciences, Bangkok, Thailand) v 7% alkoholu v tme, a potom zmieša s citrátom olovnatým (Electron Microscopy Sciences, Bangkok, Thailand ). Skúmali pod Philips CM 100 transmisný elektrónový mikroskop pracujúci pri 80 kV.
Štatistická analýza
Výsledky boli vyjadrené ako priemer ± SD zo replikátov z 3 oddelených testoch. Porovnanie medzi dátovými sadami sa vykonáva za použitia jednosmernej analýzy variance (ANOVA) nasledované Študentov t-test. Všetky štatistické analýzy boli vykonávané s použitím SPSS19. Rozdiely boli prijaté ako štatisticky signifikantné pri p. ≪ 0,05
výsledky
Celkom fenolové obsahuje výťažky rastlín
Tri jedlé rastliny ľudových zo severovýchodnej oblasti Thajska (S. gratum
J. Gangetic
a L. flava
) boli extrahované a ich celkový obsah fenolové stanoví s výsledkami uvedenými v tabuľke 2. z týchto rastlinných extraktov, bola zistená najvyššia úroveň celkového obsahu fenolové S. gratum
na 149.789 ± 0,381 mg GAE /g. To bolo 10 záhyby významne vyšší obsah, než ktorý bol identifikovaný v J. Gangetic stroje a L. flava
(16,513 ± 0,130 a 14,334 ± 0,

• Xpert MTB /RIF test môže byť použitý na archivované žalúdočnej sekrécie a indukované vzorky spúta pre citlivú diagnostiku detskej tuberkulózy
• Núdzové prezentácia rakoviny žalúdka; Prognóza a dôsledky pre plánovanie služieb