Možné zapojenie Nrf2-sprostredkovanej hemové oxygenázy-1, up-regulácia v ochrannom účinku inhibítora protónovej pumpy pantoprazolu proti indometacínom vyvolanej gastrickej poškodenie u potkanov

Možné zapojenie Nrf2-sprostredkovanej hemové oxygenázy-1, up-regulácia v ochrannom účinku inhibítora protónovej pumpy pantoprazolu proti indometacínom vyvolanej gastrickej poškodenie u potkanov
abstraktné
pozadia
protónovej pumpy je integrálnou membránový proteín, ktorý je všadeprítomný ATP viažuci kazeta (ABC), podieľa na mnohých dopravných procesov vo všetkých živých organizmoch, z ktorých špecializovaná forma čerpadlá, tzv str
-type protónovej pumpy, existuje v parietálnych bunkách žalúdka. Hoci inhibítory protónovej pumpy (PPI) sú často predpísaný pre prevenciu nesteroidné protizápalové lieky (NSAID) indukovanej žalúdočnej škody, kyslé tlmivé kroky nestačí na vysvetlenie.
Metódy
Aby bolo možné dokumentovať účinky pantoprazolu , jeden z IPP, na poškodenie žalúdočnej NSAID vyvolané in vitro a in vivo
boli vykonané
štúdie. Imunocytochémia, Western blot analýza, elektroforetické mobility shift assay a RT-PCR bola vykonaná za účelom zhodnotenia indukciu heme oxygenázy-1 (HO-1) prostredníctvom aktivácie Nrf2 v normálnych buniek žalúdočnej sliznice RGM-1 alebo in vivo
žalúdočné tkanív potkany ošetrenie indometacín a /alebo pantoprazolu.
Výsledky
pantoprazolu aktivovaný Nrf2 prostredníctvom inaktivácie Keap1, po ktorom je expresia HO-1 bola významne zvýšená v spôsobom závislým od dávky v bunkách RGM-1. Zvýšená väzbové aktivita ARE-DNA bola pozorovaná maximálne na 1 h s 300 uM pantoprazolu. Expresie HO-1 indukovanej pantoprazolu bola významne spojená so zvýšenou in vitro
tvorby trubice v (P
menšie ako 0,05) a angiogénnych faktorov, vrátane VEGF, bFGF, a HIF-1α. Indometacín výrazne zvýšila vyjadrenie TNF-a, IL-1SS, IL-8, NOX-1, ICAM-1 a VCAM, vzhľadom k tomu, pantoprazol výrazne znížil výrazy indometacínu vyvolané týchto zápalových mediátorov v súlade s pantoprazolu indukovanú HO-1 (P Hotel < 0,05), ako je doložené HO-1 inhibítora. In vivo
modelu indometacínom indukované poškodenie žalúdočnej mohol overiť in vitro
-drawn výsledky, ktoré pantoprazol pozoruhodne chránené proti indometacínom vyvolanej gastrickej poškodenia, v ktorej zinok protoporfyrín (5 mg /kg, ip
) významne zrušené protektívna účinnosť pantoprazolu.
Záver
Tieto výsledky ukazujú, že Nrf2 sprostredkovaná HO-1 indukcie IPP získa významný ochranný účinok proti NSA-indukovanej poškodenia žalúdočnej kyseliny za supresorových akcií.
kľúčové slová
hom oxygenázy-1 protón inhibítor čerpadlo NSA indukované gastropatia Nrf2 pozadí
NSAID majú obrovské objemy predpis väčšinou vychádzajú z týchto dvoch dávok, jedna predstavuje nárast o starších pacientov vyžaduje NSA predpis k úľave od bolesti, degeneratívne zmeny indukované a druhý je ďalšie skúšobné buď pre prevenciu polypov hrubého čreva alebo úteku z ischemických kardiovaskulárnych ochorení [1, 2]. Avšak veľká použitie NSAID je obmedzené nepríjemných vedľajších účinkov, ako sú žalúdočné erózia /vredu, krvácanie z komplikované vredy a závažnejších komplikácií u tenkého a hrubého čreva. Vzhľadom k tomu, farmakologický účinok NSAID je prostredníctvom inhibícia prostaglandínu (PG) syntézu cez potlačenie cyklooxygenázy (COX) [3], nerozoznateľný zmenšenie žalúdočným prostaglandínu E 2 (PGE 2) je zodpovedný za tieto gastrointestinálne (GI) nepriaznivé účinky. Aj keď vynález selektívnych inhibítorov COX-2, koxiby, aby bola zaručená bezpečnosť GI bolo navrhnuté ako stratégia pre riešenie problémov, toto riešenie je potrebné zlepšiť. Aj keď NSAID sa používajú ako silné anti-vredových liekov, dodatočné nekryté mechanizmy NSAID toxicity [4, 5] nás vedie k rozvoju silnejšej a bezpečnejšej činidlá.
V súčasnej dobe najlepšou voľbou pre prevenciu NSAID v súvislosti s GI toxicita je buď kombinácia NSAID a inhibítory protónovej pumpy (PPI), alebo voľba koxibovej [6, 7]. Vzhľadom k tomu, hojenie miera GI vredov pri kontinuálnom NSAID bola vyššia u IPP skupine než histamínu typu 2 receptora skupiny (H2-RA), boli uprednostňované PPI ako H2-RA sa vyrovnať s nepriaznivým účinkom NSAID [8, 9 ]. Okrem základných kyselín potlačovacie pôsobenie IPP niekoľko funkcií, ktoré boli odhalené, ktoré sú redukcia pre-apoptotického signalizácie, kyselina nezávislá obnova množiacich a opravy ciest [10], zníženie slizničnej oxidačným poškodením, hojenie propagáciu akcie a ergastoplazma pnutia mechanizmus [11 až 16]. Hahm et al.
[17-19] tiež uviedla, že IPP vykazujú potenciálnu činnosť ako protinádorová terapeutiká založená na selektívnej indukcie apoptózy, anti-angiogenézy proti Helicobacter pylori
-associated karcinogenézy, a priame anti-mutagénne podujatí pri vzniku nádorov. Avšak mechanizmy zodpovedné za ochranné účinky IPP v NSA indukovanej žalúdočnej poškodenia je potrebné ešte určiť.
Hem oxygenázy-1 (HO-1), indukovatelná pre prvý a rýchlosť obmedzujúci enzým degradácie hému, bol známe, že chráni pred cytotoxicitou oxidatívneho stresu a apoptotické bunkovej smrti, ako aj zápalu [20, 21]. Základné ochranné účinky HO-1 proti zápalu sú sprostredkované pomocou anti-oxidačné degradácii hemu, ale tiež spojené s výrobou protizápalové mediátory, pre ktoré redox-dependentný transkripčný aktivátor, NF-E2-súvisiace s faktorom 2 (Nrf2), a jeho fosforylácie /aktivácie, a oxidácia Kelch-ako ECH-združujúca proteín 1 (Keap1) je mechanicky navrhuje [22 až 24]. Vzhľadom k tomu, expresie HO-1 bola vyvolaná proti oxidačné, protizápalové a ischemickej reakcií odľahčenie, v súčasnej štúdii sme predpokladali, že ochranné účinky IPP proti NSA-indukovanej poškodenia žalúdočnej môže súvisieť s HO-1 a následnej angiogenézy za potlačenie kyseliny vrodené. Dohromady, naše výsledky demonštrujú nové mechanizmy, ktoré PPI indukujú expresiu HO-1 prostredníctvom aktivácie Nrf2 /inaktivácie Keap1 sprevádzaný odmeňovania ischemické zmeny a útlm zápalových mediátorov, a tým uľahčiť ochranu proti indometacínom vyvolanej gastrickej poškodenia.
metódy
materiály a bunkových kultúr
Indomethacin bol zakúpený od Sigma Aldrich (Saint Louis, MO) a pantoprazol bola poskytnutá zo Amore Tichého Pharmaceutical Co. (Soul, Kórea). Protilátky pre p-aktínu, HO-1, α-tubulín, Keap1, Nrf2 a VEGF boli všetky získané od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Normálny žalúdočnej sliznice potkania bunky RGM-1 boli poskytnuté Prof. Hirofumi Matsui, CSc (Tsukuba Univ., Japonsko), boli kultivované v Eaglovho média Dulbecco (DMEM) s obsahom 10% (V
/v
) fetálneho hovädzieho séra, 100 U /ml penicilínu. Ľudské pupočnej vaskulárne endotelové bunky (HUVEC) boli kultivované v M199 médiu (InnoPharma plátno, Soul, Kórea). Bunky boli udržiavané pri 37 ° C vo zvlhčenej atmosfére obsahujúcej 5% CO 2. Vhodná množstvo RGM-1 buniek alebo buniek HUVEC boli schovať a inkubované po dobu 24 hodín, potom boli ošetrené s uvedenou dávkou pantoprazolu alebo indometacínu a inkubované po uvedenej doby. Bunky HUVEC boli presunuté do 1% O 2 a 5% CO 2 hypoxia komory a inkubované po dobu 0-12 h pre in vitro
teste tvorby rúrka in.
Elektrónové spinové rezonanciou (ESR) spektroskopie a ROS meranie generácie
rôznych koncentrácií pantoprazolu pridaná do celkového objemu 200 ul s obsahom 0,05 mM FeSO 4, 1 mM H 2O 2, 1 mM 5,5-dimethylpyrroline-N-oxid (DMPO, Sigma Aldrich, Saint Louis, MO), a 50 mM fosforečnanu sodného s pH 7,4 pri teplote miestnosti. Reakcie boli zahájené pridaním H 2O 2. Po inkubácii po dobu 1 min, alikvótne reakcie boli prenesené do kremenného bunky a spektra DMPO-OH bola skúmaná s použitím ESR spektrofotometra (JES-TE300, JEOL, Tokyo, Japonsko) za nasledovných podmienok: magnetické pole, 338,0 ± 5,0 mT; mikrovlnný výkon, 4,95 mW; Frekvencia, 9.421700 GHz; modulačné amplitúda, 5 mT; Doba rozmietanie, 0,5 min; a časová konštanta 0,03 s. Obsah bunková ROS boli merané inkubáciou ovládanie alebo pantoprazol spracuje RGM-1 buniek s 10 uM H 2DCF-DA (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) po dobu 30 minút. Fluorescencia bola meraná pomocou konfokálního laserového mikroskopu (LSM710, Carl Zeiss, Oberkochen, Nemecko).
Western blot analýzu
Ošetrené bunky boli dvakrát premyté PBS a potom sa lyžovalo v ľadovom lyzačním pufri bunky (Cell Signaling Technology) obsahujúcim 1 mM fenylmetylsulfonyl fluorid (PMSF, Sigma Aldrich). Proteíny v lyzátu boli separované SDS-PAGE a prenesené na polyvinylidénfluoridu (PVDF) membrány, ktoré boli inkubované s primárnymi protilátkami, premyje, inkubuje s peroxidázou konjugovanou sekundárnej protilátky, znovu sa premyje a potom vizualizované za použitia rozšírenej chemiluminiscencie systému (ECL) ( GE Healthcare, Buckinghamshire, UK).
Elektroforetická pohyblivosť gél shift assay (EMSA)
jadrové a cytoplazmatické frakcie sa extrahujú za použitia NE-PER jadrové a cytoplazmatické činidiel (Pierce, Rockford, IL) podľa návodu výrobcu. Antioxidant element sprostredkujúcej odpoveď (ARE) oligonukleotidové sonda, 5'-TTT TCT GCT GAG TCA AGG TCC G-3 ', a HIF-1α oligonukleotidové sonda, 5'-TCT GTA CGT GAC CAC CAC ACT CTC-3', bol označený pomocou [ ,,,0],γ- 32P] ATP za použitia T4 polynukleotidy kinázy (Promega, Madison, WI) a oddelená od neprirodzenej [γ- 32P] ATP gélovou filtráciou za použitia spin kolóny nick (GE Healthcare). Pred pridaním 32P-oligonukleotid (1x10 5 cpm), 10 ug jadrového extraktu bol udržiavaný na ľade po dobu 15 minút v posune na géle väzobnom pufri. Pre určenie sekvencie špecifickosť interakcie NF-kB DNA, sme sa pridá prebytok neznačeného oligonukleotidov. Po 20 minútach inkubácie pri teplote miestnosti, pridá sa 2 ul 0,1% brómfenolovej modro, a vzorky boli podrobené elektroforéze cez 6% non-denaturačné PAGE pri 150 V, v chladnej miestnosti. Nakoniec sa gély boli vysušené a vystavené röntgenovému filmu (Kodak, Rochester, NY).
Imunocytochemie
Ošetrené bunky v priestore sklíčka boli stanovené 3,7% formaldehydu po dobu 15 minút. Po premytí boli bunky blokované v 5% roztoku BSA s obsahom 0,1% Triton X-100 v PBS po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti, a potom inkubované s primárnou protilátkou (1: 100) po dobu 12 hodín pri 4 ° C. Bunky boli potom premyté 3-krát, inkubované s sekundárnou protilátkou (1: 300) po dobu 1 hodiny, a potom sa s 4'-6-diamidínov-2-fenylindol (DAPI, 100 ng /ml) po dobu 1 minúty pri izbovej teplote. Po premytí 3krát, bunky boli umiestnené s Prolong Gold antifade činidla (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Fluorescencia bola vizualizované pod konfokálním laserovým mikroskopom (LSM710, Carl Zeiss).
RNA izolácie a kvantitatívne reverznej transkripcie PCR (QRT-PCR)
Po spracovaní sa médium odsaje a bunky boli premyté fosfátom Dulbecco -buffered fyziologický roztok (DPBS) dvakrát. RiboEX (Gene All, Seoul, Kórea) bol pridaný do doštičiek, ktoré potom boli inkubované po dobu 10 minút pri teplote 4 ° C. RiboEX sa zberalo a umiestni do 1,5 ml skúmavky a bol pridaný chloroform a opatrne premiešaný. Po inkubácii po dobu 10 minút na ľade, Vzorky boli odstredené pri 10000 x g počas 30 min. Supernatanty boli extrahované a zmieša sa s izopropanolom, a zmesi boli inkubované pri 4 ° C po dobu 1 hodiny. Po odstredení pri 13000 g počas 30 minút
, peleta sa premyje 70% (v /v
) etanolu. Potom, čo sa etanol, aby úplne odpariť, pelety boli rozpustené v dietylénglykol pyrocarbonate (DEPC) -treated vodou (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). cDNA bola pripravená pomocou reverznej transkriptázy odvodenú od myší Maloney vírusu leukémie (Promega, Madison, WI) podľa pokynov výrobcu. PCR bola vykonaná viac ako 30 cyklov: 94 ° C počas 20 sekúnd, 58 ° C počas 30 sekúnd, a 72 ° C počas 45 sekúnd. Oligonukleotidové priméry pre PCR (tabuľka 1) boli zakúpené od Bioneer (Daejeon, Kórea). Všetky pokusy QRT-PCR boli opakované trikrát a kvantifikácie bol uvedený v priemere ± SD.Table 1. Sekvencie PCR primérov
GAPDH
Forward 5'-GMT GCT GAG TAT GTC GTG GA -3 '
Reverzný 5'-TTC AGC TCT GGG ATG ACC TT-3 '
HO-1
Forward 5'-GAG AGC ATG TCC CAG GAT TT-3'
Reverse 5'-GGT TCT GCT TGT TTC GCT CT -3 '
COX-2
Forward 5'-GAA GCT ATG GCA GAG TTG AA -3'
Reverzný 5'-TCA TCT AGT CTG GAG TGG GA -3
HIF-1α '
Forward 5'-AAC AAA CAG AAT TCC CTG TC-3 '
Reverse 5'-GGT AAT GGA GAC ATT GCC AG-3'
VEGF
Forward 5'-CAA TGA TGA AGC CCT GGA GT-3 '
Reverse 5'-GAT TTC TTG CGC TTT CGT TT -3'
PDGF
Forward 5'-AGG AAG CCA TTC CCG CAG TT-3 '
Reverzný 5'-CTA ACC TCA CCT GGA SCS CT -3 '
bFGF
Forward 5'-TAT GAA GGA AGA TGG ACG GC-3'
Reverse 5'-AAC AGT ATG GCC TTC TGT CC -3 '
IL-1β
Forward 5'-CAT TGT GGC TGT GGA GAA G-3 '
Reverse 5'-ATC ATC CCA CGA GTC ACA GA -3'
IL-8
Forward 5'- CAG ACA GTG GGG GCA ATT CA-3 '
Reverse 5'-TTG GGG ACA CCC TTT AGC AT-3'
TNF-a
Forward 5'-TAC TGA ACT TCG GGG TGA TT -3 '
Reverzný 5'-CAG CCT TCT CCC TTG AAG AG-3 '
ICAM-1
vpred 5'-TGT GCT TTG AGA ACT GTG GC-3'
Reverzný 5'-GMT TCT GTC CAA CTT CTC AG -3 '
VCAM-1
Forward 5'-GAG ACA AAA CAG AAG TGG AAT-3'
Reverse 5'-TAC AAG TGG TCC ACT TAT TTC -3 '
NOX1
Forward 5'-GAG AAA TTC TCG GAA CTG CC-3 '
Reverse 5'-TGT TGG CTT CTA CTG TAG CG-3'
in vitro
angiogenézy testu
testu bola vykonaná s použitím komerčné zostavy podľa inštrukcií výrobcu (Millipore, Billerica, MA). Za hypoxických podmienok, ECMatrix a riediaci roztok pufra sa zmieša, aby sa pevný gél, ktorý bol potom nanesené na 96 jamkové mikrotitračné doštičky. Ľudské pupočnej žily endoteliálne bunky (HUVEC, 1,0 x 10 5 /ml) boli vrúbľovať s riadiacim, indometacín, indometacín a navyše pantoprazol, indometacín a navyše pantoprazol a navyše ZnPPIX inkubované pri 37 ° C počas 4 hodín. Tvorba skúmavka bola pozorovaná pod svetelným mikroskopom.
Indometacínom vyvolané gastrickej modelu poškodenia
celkom 48 potkanov boli zakúpené od Charles River (Osaka, Japonsko). Zvieratá boli riešené v akreditovanom živočíšneho zariadení v súlade s Asociáciou pre posudzovanie a akreditáciu Laboratory Animal Care International (AAALAC International) pokynov v rámci facility s názvom CACU (centrum starostlivosti o zvieratá a používanie) Lee Gil Ya rakoviny a cukrovky Institute, Gachon Univerzitný po schválení Institutional Ethics Review Board. Zvieratá bola rozdelená do štyroch skupín, z ktorých každá obsahuje 12 krýs a nechajú hladovať po dobu 24 hodín pred experimenty nasledujúcim spôsobom; všetky krysy boli podávané spolu s intraperitoneálnou injekciou indometacínu (10 mg /kg) na vyvolanie žalúdočnej škody, druhá skupina sa intraperitoneálnou injekciou 10 mg /kg pantoprazolu, tretia skupina sa intraperitoneálnou injekciou 30 mg /kg, pantoprazolu, a štvrtý skupina s intraperitoneálnou injekciou 30 mg /kg pantoprazolu a 5 mg /kg ZnPPIX inhibovať aktivitu HO-1. Zvieratá boli zabité 16 hodín po každom podaní. Žalúdkov krýs boli odstránené a otvorený pozdĺž veľkého zakrivenia a potom sa premyje ľadovo chladným fosfátom pufrovaným riešenie. Počty buď erózia alebo vredy boli stanovené na základe zväčšeného fotografiami. Homogenát získané z poškriabaných žalúdočnej sliznice boli uchovávané v tekutom dusíku nádrže až do testu.
Štatistická analýza
Výsledky sú vyjadrené ako priemer ± SD. Dáta boli analyzované pomocou jednosmernej ANOVA a štatistická významnosť medzi skupinami bola stanovená pomocou viacnásobného testovania rozsahu Duncana. Štatistická významnosť bola prijatá na P Hotel < 0,05.
Výsledky
pantoprazolu zvýšila HO-1 expresiu cez Nrf2 aktivačný
na základe predbežnej štúdii sme zistili, pantoprazol ukázal najvyššiu indukciu HO-1 expresie v RGM-1 bunky medzi inhibítory protónovej pumpy, lanzoprazol, rabeprazol omeprazol, pantoprazol a (dáta nie sú uvedené). Pantoprazol zvýšila expresiu HO-1 mRNA a proteín, a to spôsobom (obrázok 1A) a na dávky závislé Imunocytochemická analýza tiež ukázala, že úroveň HO-1 sa významne zvýšili o pantoprazolu ošetrení v cytoplazme RGM-1 buniek v dávke -dependentní spôsobom (obrázok 1B). Ak chcete porozumieť mechanizmom, ktoré sú dôvodom up-regulácia HO-1 expresie pantoprazol, sme sa zaoberali jeho účinky na aktiváciu Nrf2, hlavný transkripčný faktor, ktorý sprostredkováva ARE /EpRE-riadený expresie antioxidačných enzýmov. Keď sa meria úroveň expresie keap1, represor Nrf2 v cytoplazmatickej frakcie zmieša s 300 uM pantoprazolu v inom časovom okamihu, výrazne znížil expresie Keap1 bola pozorovaná u 1 h (obrázok 2A), čo naznačuje, že HO-1 by mohli byť prepísané po ošetrení pantoprazolu prostredníctvom aktivácie Nrf2 a Keap1 deaktiváciu. Ako je znázornené na obrázku 2A, Nrf2 nukleárna kolokalizace bol zjavný v bunkách RGM-1 ošetrených pantoprazolu. Maximálna SÚ-väzbové aktivita Nrf2 bola zvýšená na 1 h, ako aj jeho nukleárna lokalizácia vyvolaných pantoprazolu (obrázok 2B). Ak chcete zistiť jadrovú akumuláciu Nrf2, sme vykonali analýzu imunocytochemického s použitím anti-Nrf2 protilátky. Ako je ukázané na obrázku 2C, Nrf2 bol translokovaný do jadra s 300 uM pantoprazolu liečby. Tieto výsledky naznačujú, že sústavne pantoprazol by mohli zvýšiť hladinu HO-1 až transkripčný aktivácia Nrf2 v krysích žalúdočných epiteliálnych bunkách. Obrázok 1 Pantoprazole indukované expresiu HO-1. (A) RT-PCR a Western blot pre HO-1 expresie v závislosti na rôznych dávkovanie pantoprazolu, 30, 100, a 300 uM, v danom poradí. Tieto údaje sú zástupcovia výsledkov získaných v 3 nezávislých experimentov. (B) konfokálna zobrazovania HO-1. Pantoprazol zvýšila expresiu HO-1 v spôsobom závislým od dávky v normálnej žalúdočnej sliznice potkanov buniek RGM-1.
Obrázok 2 pantoprazol zvýšenú Nrf2 nukleárnej translokácii a cytoplazmatickú keap1 inaktiváciu, viedla k významnému anti-oxidácia. (A) Western blot pre buď cytozolové Keap1 alebo nukleárnej Nrf2 v rôznom čase, v prítomnosti 300 uM pantoprazolu. (B) Elektroforetická pohyblivosť posunu test (EMSA), spadajú-DNA väzbovú aktivitu. Významne zvýšil DNA väzbovú Nrf2 bolo zistené, 60 minút po podávaní pantoprazolu. (C) konfokálna zobrazovanie Nrf2 po inom dávkovanie pantoprazolu, 100 a 300 um. Meranie (D) Electron spin rezonancie (ESR) pre Fenton reakciu generované hydroxylové radikály. (E) Zmeny DCF-DA fluorescencie po inom dávkovanie pantoprazolu, 30, 100, a 300 uM. Pantoprazol značne znížili H2O2-indukovanej oxidatívny fluorescencie.
Vzhľadom k tomu, biologický význam HO-1 pantoprazolu má anti-oxidačné kroky týkajúce sa HO-1 indukcie. Meranie ESR bol konečný spôsob, ako sledovať voľných radikálov pomocou spin adukt, pre ktoré sme vytvorili hydroxylové radikály pomocou DMPO ako adductor pod Fenton reakcie. Ako je vidieť na obrázku 2D, 3 mM pantoprazol pôsobí jasne zachytávať pôsobenie DMPO-adukt vytvárajúci hydroxylové radikály. Vzhľadom k tomu, meranie ESR bol vykonaný v chemickej reakcii podmienka biologického systému a pantoprazol nie je profesionálny antioxidant, rozhodne prispelo k viazaniu hydroxylové radikály, aj keď je relatívne vysoká koncentrácia pantoprazolu upratovať reaktívne formy kyslíka. Tieto chemické výsledky zo štúdie ESR boli ďalej overené biologický test pomocou merania DCF-DA fluorescencie, čo ukazuje, že pantoprazol ukázali významné zníženie DCF-DA v závislosti na dávke závislým (P Hotel < 0,05, obrázok 2E).
angiogénny akcie následným na pantoprazol indukované HO-1
PPI zvýšil výrazy VEGF mRNA a bielkoviny v RGM-1 buniek (obrázok 3A). Aby bolo možné dokumentovať, či prírastkové indukciu VEGF s PPI sa týka HO-1 indukcie, sme opakovali pokusy so samotným PPI alebo súčasného podávania pantoprazolu a protoporfyrínovej zinku (ZnPPIX) ako HO-1 inhibítor. Ako výsledky, mohli by sme znovu potvrdiť expresiu VEGF indukovanú pantoprazol a kumulatívne spoločné liečenie ZnPPIX zreteľne znížil expresiu PPI-indukovanej VEGF v spôsobom závislým od dávky (obrázok 3B). Ďalej sme skúmali zmeny reprezentatívnych angiogénnych faktorov, bFGF, PDGF a HIF-1α a dodržiavať tieto výrazy sú relevantné pre pantoprazol indukované HO-1 na obrázku 3C. Ako sa očakávalo, pantoprazol výrazne zvýšila tieto výrazy niekoľkých angiogénnych faktorov. Aj tieto indukcie bFGF a PDGF boli významne oslabený sa súčasného podávania pantoprazolu a ZnPPIX. Aby bolo možné overiť, či tieto indukcia angiogenézy faktoru po pantoprazolu bolo v skutočnosti vzťahujúce sa na angiogenézu, in vitro
angiogenézy test bol vykonaný (obrázok 3D). Tvorba Trubica bola významne zoslabený 500 uM indometacínu v HUVEC, zatiaľ čo 100 uM pantoprazol mohla prekonať tieto derangements angiogenézy liečených indometacín. Avšak, ďalšia liečba ZnPPIX zrušiť tieto výhody prekonanie angiogenézu pantoprazolu pod správou indometacínu. Tieto výsledky naznačujú, že pantoprazol kompenzované NSAID vyvolané chybnú angiogenézu prostredníctvom indukčnej schopnosti HO-1. Obrázok 3 Pantoprazol indukované angiogénny faktory spojené s HO-1 indukcie. (A) RT-PCR a western blot pre VEGF. Významné indukcie VEGF boli zaznamenané s pantoprazol, výrazne po 300 uM pantoprazolu (p menšie ako 0,05
). Tieto údaje sú zástupcovia výsledkov získaných v 3 nezávislých experimentov. (B) Zmeny VEGF a HO-1 so samotným pantoprazolu alebo kombinácia pantoprazolu a ZnPPIX. Indukcia VEGF po pantoprazolu bola významne zoslabený s HO-1 inhibítor, znamenať implikáciu HO-1 v PPI-indukovanej VEGF. Tieto údaje sú zástupcovia výsledkov získaných v 3 nezávislých experimentov. (C) Ostatné angiogénny faktory týkajúce sa pantoprazolu. bFGF a VEGF bol stále viac vyjadrená pantoprazol, ale tieto indukcia boli zoslabené s HO-1 inhibítor. Tieto údaje sú zástupcovia výsledkov získaných v 3 nezávislých experimentov. (D) in vitro angiogenézu
test. Tvorba trubice HUVEC sa výrazne znížila s 50 uM indometacín. Pantoprazol kompenzovaný indometacínom indukovanej angiogenézy defektné ako bolo stanovené s percentom tvorby trubice, zatiaľ čo HO-1 inhibítor zrušené tieto prekonanie pantoprazolu indukovanej angiogenézy. Tieto údaje sú zástupcovia výsledkov získaných v 3 nezávislých experimentov.
Pantoprazol-indukovanej HO-1 oslabený indometacínom spojené zápalové útok
keď indometacín je protizápalová látka, bolo známe, že NSAID vyvolané žalúdočné jeho poškodenie v dôsledku zvýšenej prejavy zápalových mediátorov, vrátane TNF-a, IL-1, IL-8, a NADPH oxidáza-1 (NOX-1). Ako je vidieť na obrázku 4A, 500 uM indometacín významne zvýšilo vyjadrenia TNF-a, IL-1 a IL-8 v žalúdočných epiteliálnych bunkách, vzhľadom k tomu, že sa znížila expresiu HO-1, čo potvrdzuje, že zápalové mediátory môžu byť mechanicky spojené s indometacín-indukovanej poškodenia žalúdočnej epiteliálnych buniek. V tomto stave, súčasné podávanie 500 uM indometacínu a 300 uM pantoprazolu významne znížila vyjadrenie TNF-a, IL-1 a IL-8 doplnené štatisticky významných zvýšenie HO-1 expresie. Navyše, indometacín úloha výrazne zvýšil výrazy NOX-1, v ktorom sa pantoprazol výrazne tlmí zvýšenú expresiu NOx-1, čo naznačuje, že pantoprazol vyvolané HO-1 uložených protizápalovo pod indometacín. Ďalej, aby sa ďalej preukázať, či tieto zoslabenie zápalových mediátorov po pantoprazolu sú výsledkom HO-1 indukcie, sme opakovali tieto pokusy s podaním ZnPPIX. Ako je vidieť na obrázku 4B, čo-ošetrenie ZnPPIX v prítomnosti pantoprazolu podstatne ruší výhody protizápalový účinok. Prírastkové indukcia z ICAM-1 a VCAM po indometacínu liečby boli zodpovedné za ischémie a zhoršenie orgánových škody, v ktorých bolo zaoberajúcich buď vaskulárneho zápalu alebo zvýšená agregácie leukocytov. Liečba indometacín významne zvýšilo vyjadrenie ICAM-1 a VCAM v HUVEC, ale čo-výzva indometacínu a pantoprazolu významne znížil indometacínom indukované expresiu ICAM-1 týkajúce sa zvýšenia indukcia HO-1 (obrázok 4C). V tomto stave, ZnPPIX neukladá útlm ICAM alebo VCAM napriek pantoprazolu liečby, ďalej zabezpečenie príjemca pôsobenia pantoprazolu spojené s HO-1 indukcie. Obrázok 4 Pantoprazol atenuovaný indometacínom indukované mediátormi zápalu prostredníctvom HO-1. (A) RT-PCR pre TNF-a, IL-1, IL-8, a HO-1. 500 uM indometacín zvýšila expresiu zápalových mediátorov, vrátane TNF-a, IL-1, IL-8, ale významne znížil HO-1 expresiu. NOX-1 sa významne zvýšila s indometacín. Tieto údaje sú zástupcovia výsledkov získaných v 3 nezávislých experimentov. (B) Pantoprazol významne znížil indometacínom indukovanej IL-1 a TNF-a, ale tieto akcie Zvýhodnené pantoprazolu bola zrušená s ZnPPIX, čo vedie k záveru, že protizápalové akcie pantoprazolu bolo vzhľadom k HO-1 indukcie. Tieto údaje sú zástupcovia výsledkov získaných v 3 nezávislých experimentov. (C) Pantoprazol významne znížil indometacínom indukované ICAM-1 a VCAM v HUVEC bunkách, ale tieto akcie Zvýhodnené pantoprazolu boli zrušené s ZnPPIX ako HO-1 inhibítor. Tieto údaje sú zástupcovia výsledkov získaných v 3 nezávislých experimentov.
Pantoprazol indukovanú HO-1 oslabenej indometacínom vyvolanej gastrickej zranenia
Pre zistenie ochranný účinok in vivo pantoprazolu
, indometacín (10 mg /kg ) bol podávaný intraperitoneálne počas 16 hodín u potkanov. Liečba indometacínu výrazne vyvolal žalúdočnej sliznice zranenia vrátane hemoragickej erózie a vredy. Avšak, tieto žalúdočné patológiou vyvolané s indometacínu boli významne zoslabený sa intraperitoneálnou injekciou 30 mg /kg pantoprazol (obrázok 5A). Vzhľadom k tomu, tieto ochranné účinky 30 mg /kg pantoprazol proti indometacínom vyvolanej gastrickej poškodenie významne zrušená Pri súčasnom liečení intraperitoneálne podané 5 mg /kg ZnPPIX, sme potvrdili, že ochranný účinok pantoprazolu bolo založené na jeho schopnosti HO-1 indukcie , Keď sa výrazy HO-1 a ICAM-1 bola meraná v slizničných Homogenát z každej skupiny, indometacín podávanie významne znížila vyjadrenie HO-1 a zvýšila expresiu ICAM-1. Avšak vzhľadom k zvýšeným HO-1 výrazov po pantoprazolu, ako aj podstatne oslabených hladiny ICAM-1, indometacín-indukovanej poškodenia žalúdka sa úmerne zlepšili aj napriek indometacín výzve (obr 5B). Ak chcete ukázať, ako pantoprazol zlepšila chybný angiogenézy a ischémiu zapríčinená indometacínu, EMSA s použitím HIF-1α bola vykonaná (obrázok 5C). HIF-1α-DNA väzbové aktivita bola veľmi zvýšená indometacín samotnej skupine, ktorá bola výrazne poklesol v žalúdočných Homogenát pantoprazolu liečebnej skupiny, znamenať pantoprazolu výrazne uľavilo hypoxické podmienky indukovanej indometacínom. Dohromady PPI pôsobí silnú ochranu proti indometacínom indukovanej poškodeniu žalúdočnej sliznici cez významné HO-1 indukcie, čo je nad rámec autentického potláčajúce kyseliny akciu, aj keď sme nemali merať zmeny kyslosti žalúdka. Obrázok 5 Pantoprazol zabraňuje sa poškodeniu žalúdočnej indometacínom indukované prostredníctvom závislosti na indukciu HO-1. (A) Stredná index indometacínom vyvolanej gastrickej poškodenia. (B) RT-PCR pre HO-1 a ICAM-1, podľa skupiny. (C) EMSA pre HIF-1α podľa skupiny. Indometacín významne zvýšila HIF-1α-DNA viazanie, zatiaľ čo pantoprazol výrazne poklesol záväzné v spôsobom závislým od dávky HIF-1α-DNA.
Diskusia
Pred súčasného vyšetrovania niekoľko vedci zverejnili, že PPI by mohli zabrániť žalúdočnej sliznice pomocou iných mechanizmov, mimo pôsobenia inhibíciu špecifickej kyseliny [11, 14, 25-28], mohli by sme pridať ďalšie dôkazy týkajúce sa ochranné pôsobenie proti PPI NSAID. Pantoprazol významne indukuje expresiu HO-1 aktiváciou Nrf2 relevantnými protizápalové, anti-oxidačných a ischémie zmiernenie opatrení. Novel zistením tejto štúdie sa líši od ostatných šetrenia je, že pantoprazol ukazuje ochranné opatrenia k ujme NSA-indukovanej prostredníctvom buď korekciu angiogénny postihnutia alebo zoslabenie sklonu zápalu.
Becker JC et al.
[16] preukázali že ako omeprazol a lansoprazol chránenej ľudskej žalúdočnej epitelové a endotelové bunky pred oxidačným stresom podobné našej štúdii, ale používajú rôzne druhy IPP. Vzhľadom k tomu, tento účinok bol zrušený v prítomnosti inhibítora HO-1, ZnPPIX, HO-1 sa zdá byť správny cieľ PPI ako v endotelových a epitelových buniek žalúdka. V tejto štúdii sme pozorovali nedotknutou nové zistenie, že HO-1 indukovanej PPI poklesol NSA-vzniknuté zápal a angiogénny zmyslov. Takagi T et al.
[25] takisto skúmala úlohu Nrf2, jeho fosforylácie /aktivácie a oxidácii Keap1 v up-regulácia pomocou rovnaké bunkové línie s nami, RGM-1 buniek lansoprazol indukované HO-1. Všetci autori čítať a schválená konečná rukopis.

• Epstein-Barrovej spájaný karcinóm žalúdka: správa z Iránu v posledných štyroch decades
• Súvislosť medzi RUNX3 metylácie promótorom a rakovinou žalúdka: meta-analysis