En mulig involvering af Nrf2-medieret hem oxygenase-1 opregulering i beskyttende virkning af protonpumpeinhibitoren pantoprazol mod indomethacin-induceret gastrisk beskadigelse hos rotter

En mulig inddragelse af Nrf2-medieret hæm oxygenase-1 opregulering i beskyttende effekt af protonpumpehæmmer pantoprazol mod indomethacin-induceret gastrisk skade i rotter
Abstrakt
Baggrund
Proton pumpe er en integreret membranprotein, som er allestedsnærværende ATP bindende kassette (ABC) involveret i mange transportprocesser i alle levende organismer, blandt hvilke en specialiseret form for pumpe, såkaldte p
-typen protonpumpe, eksisterer i parietalcellerne i maven. Selvom protonpumpehæmmere (PPI) ofte ordineres til at forebygge ikke-steroide antiinflammatoriske lægemidler (NSAID) -induceret gastrisk skade har de sure undertrykkende handlinger ikke nok til at forklare.
Metoder
For at dokumentere effekten af ​​pantoprazol , en af ​​PPI, om NSAID-induceret gastrisk beskadigelse, in vitro
og in vivo
blev udført. Immuncytokemi, Western blot-analyse, elektroforetisk mobilitet ændring-assayet og RT-PCR blev udført for at evaluere induktionen af ​​hæm oxygenase-1 (HO-1) gennem Nrf2 aktivering i normale gastriske mucosale RGM-1-celler eller in vivo
mave væv fra rotter behandlet med indomethacin og /eller pantoprazol. Search Results Salg pantoprazol aktiveret Nrf2 gennem inaktivering af Keap1, hvorefter ekspressionen af ​​HO-1 var signifikant forøget på en dosis-afhængig måde i RGM-1-celler. Øget ARE-DNA-bindende aktivitet blev observeret maksimalt ved 1 time med 300 pM af pantoprazol. Ekspressionen af ​​HO-1 induceret af pantoprazol var signifikant associeret med den øgede in vitro
rør-dannelse (P
< 0,05) og angiogene faktorer, herunder VEGF, bFGF, og HIF-1α. Indomethacin markant øgede udtrykkene for TNF-α, IL-1SS, IL-8, NOX-1, ICAM-1 og VCAM, mens pantoprazol faldt betydeligt udtrykkene for indomethacin-induceret disse inflammatoriske mediatorer i overensstemmelse med pantoprazol-inducerede HO-1 (P
< 0,05) som dokumenteret med HO-1 hæmmer. In vivo
model af indomethacin-induceret gastrisk beskadigelse kunne validere in vitro
-drawn resultater, at pantoprazol bemærkelsesværdigt beskyttet mod indomethacin-induceret gastrisk beskadigelse, hvori zink protoporphyrin (5 mg /kg, ip
) signifikant afskaffet den beskyttende effekt af pantoprazol.
Konklusion
Disse resultater viser, at Nrf2-medieret HO-1 induktion af PPI gav en signifikant beskyttende effekt mod NSAID-induceret gastrisk skade ud over syre undertrykkende handlinger.
Nøgleord
Hæm oxygenase-1 protonpumpehæmmer NSAID-induceret gastropati Nrf2 Baggrund
NSAID har enorme receptpligtig mængder meste baseret på følgende to fordele, den ene er en stigning på ældre patienter nødvendiggør NSAID recept til at lindre degenerative forandringer smerter og den anden er en yderligere forsøg for enten forebyggelse af kolon polypper eller flugt fra iskæmiske hjerte-kar-sygdomme [1, 2]. Imidlertid er det store anvendelse af NSAID'er begrænset af besværlige bivirkninger såsom gastrisk erosion /ulcus, kompliceret blødning fra sår, og mere alvorlige komplikationer, der opstår på tyndtarmen og tyktarmen. Da den farmakologiske virkning af NSAID er gennem hæmning af prostaglandin (PG) syntese via undertrykkelse af cyclooxygenaser (COX) [3], umærkelig formindskelse af gastrobeskyttende prostaglandin E 2 (PGE 2) er ansvarlig for disse gastrointestinale (GI) bivirkninger. Om opfindelsen af ​​selektive COX-2-inhibitor, coxib, at garantere den gastrointestinale sikkerhed er blevet foreslået som løsningen strategi, denne løsning skal også forbedres. Selvom NSAID anvendes som potente anti-ulcus medicin, de ekstra udækkede mekanismer NSAID toksicitet [4, 5] føre os til at udvikle mere potente og sikrere agenter.
I øjeblikket det bedste valg for at forhindre NSAID-relaterede GI toksicitet er enten kombinationen af ​​NSAID og protonpumpehæmmere (PPI) eller valg af coxiber [6, 7]. Da den helbredende på GI sår under kontinuerlig brug af NSAID var større i PPI gruppe end histamin type 2-receptorantagonist (H2-RA) gruppe, PPI'er er blevet foretrukket end H2-RA til at klare den negative virkning af NSAID [8, 9 ]. Udover grundlæggende sure suppressive virkninger af PPI, flere funktioner er blevet afsløret som en reduktion af pro-apoptotisk signalering, syre-uafhængig restaurering af prolifererende og reparation pathways [10], en reduktion i mucosal oxidative skader, healing fremmende virkning, og endoplasmatisk reticulum spændingsaflastende mekanisme [11-16]. Hahm et al.
[17-19] har også rapporteret, at PPI viser de mulige aktiviteter som anticancer lægemidler baseret på selektiv induktion af apoptose, anti-angiogenese mod Helicobacter pylori
associeret carcinogenese, og direkte anti-mutagene handlinger under tumorigenese. Men de mekanismer, der er ansvarlige for de beskyttende virkninger af PPI i NSAID-induceret gastrisk skade endnu ikke fastlagt.
Hem oxygenase-1 (HO-1), en inducerbar for første og hastighedsbegrænsende enzym af hæm nedbrydning, har været kendt for at beskytte mod cytotoksiciteten af ​​oxidativt stress og apoptotisk celledød samt inflammatorisk tilstand [20, 21]. Grundlæggende beskyttende virkninger af HO-1 mod inflammation medieres via anti-oxidativ hæm nedbrydning, men også i forbindelse med produktionen af ​​anti-inflammatoriske mediatorer, for hvilke redox afhængig transskriptionel aktivator, NF-E2-relateret faktor 2 (Nrf2), og dens phosphorylering /aktivering, og oxidation af Kelch-lignende ECH-associerende protein 1 (Keap1) er mekanistisk foreslået [22-24]. Eftersom ekspressionen af ​​HO-1 er blevet induceret af anti-oxidativ, anti-inflammatorisk, og iskæmiske lindre responser, i den aktuelle undersøgelse, fremsatte vi den hypotese, at de beskyttende virkninger af PPI mod NSAID-induceret gastrisk beskadigelse kan være relateret til HO-1 og deraf følgende angiogenese over medfødte syresuppression. Alt i alt, vores resultater viser de nye mekanismer, som PPI inducerer ekspressionen af ​​HO-1 til at aktivere Nrf2 /inaktivering Keap1 ledsaget med aflønning af iskæmisk forandring og dæmpningen af ​​inflammatoriske mediatorer, hvilket letter beskyttelse mod indomethacin-induceret gastrisk skade.
Metoder
Materialer og cellekulturer
Indomethacin blev købt fra Sigma Aldrich (Saint Louis, MO) og pantoprazol blev leveret fra Amore Pacific Pharmaceutical Co. (Seoul, Korea). Antistoffer til β-actin, HO-1, α-tubulin, Keap1, Nrf2 og VEGF blev alle opnået fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Normal rotte gastrisk mucosa-RGM-1-celler blev tilvejebragt af professor Hirofumi Matsui, MD, PhD (Tsukuba Univ., Japan), blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) indeholdende 10% (volumen
/v
) føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin. Humane umbilical vaskulære endotelceller (HUVEC'er) blev dyrket i M199 medium (InnoPharma Screen, Seoul, Korea). Celler blev holdt ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO 2. Passende mængder af RGM-1-celler eller HUVEC'er blev udsået og inkuberet i 24 timer, hvorefter de blev behandlet med den angivne dosis af pantoprazol eller indomethacin og inkuberet i de angivne tidsrum. HUVEC'er blev flyttet til 1% O 2 og 5% CO 2 hypoxi kammer og inkuberet i 0-12 timer til in vitro
rørdannelse assay.
Electron (ESR) spektroskopi og ROS-generering måling
Forskellige koncentrationer af pantoprazol tilsat til et totalvolumen på 200 pi indeholdende 0,05 mM FeSO 4, 1 mM H 2O 2, 1 mM 5,5-dimethylpyrroline-N-oxid (DMPO, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), og 50 mM natriumphosphat ved pH 7,4 ved stuetemperatur. Reaktioner blev initieret ved at tilsætte H 2O 2. Efter inkubering i 1 min, blev portioner af reaktionerne overført til en kvarts celle og spektret af DMPO-OH blev undersøgt ved anvendelse af et ESR spektrofotometer (JES-TE300, JEOL, Tokyo, Japan) under de følgende betingelser: magnetfelt, 338,0 ± 5,0 mT; mikrobølgeeffekt, 4,95 mW; frekvens, 9.421700 GHz; modulationsamplitude, 5 mT; feje tid, 0,5 min; og tidskonstant, 0,03 s. Cellular ROS indholdet blev målt ved at inkubere kontrol eller pantoprazol behandlet RGM-1-celler med 10 uM H 2DCF-DA (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) i 30 min. Fluorescens blev målt under anvendelse af et konfokalt laser mikroskop (LSM710, Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland).
Western blot-analyser
Behandlede celler var vasket to gange med PBS og derefter lyseret i iskold cellelyse-buffer (Cell Signaling Technology) indeholdende 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, Sigma-Aldrich). Proteiner i lysater blev separeret ved SDS-PAGE og overført til polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner, som blev inkuberet med primære antistoffer, vasket, inkuberet med peroxidase-konjugeret sekundære antistoffer, vaskes igen, og derefter visualiseret under anvendelse af et forøget kemiluminescens (ECL) systemet ( GE Healthcare, Buckinghamshire, UK).
Elektroforetisk mobilitet gelforskydningsassay (EMSA)
nuklear og cytoplasmiske fraktioner blev ekstraheret under anvendelse NE-PER Nuclear og cytoplasmiske reagenser (Pierce, Rockford, IL) ifølge producentens instruktioner. Antioxidant responselement (ARE) oligonukleotidprobe, 5'-TTT TCT GCT GAG TCA AGG TCC G-3 ', og HIF-1α oligonukleotidprobe, 5'-TCT GTA CGT GAC CAC ACT CAC CTC-3', blev mærket med [ ,,,0],γ- 32P] ATP under anvendelse af T4-polynukleotidkinase (Promega, Madison, WI) og separeret fra ikke-inkorporeret [γ- 32P] ATP ved gelfiltrering under anvendelse af en nick spinkolonne (GE Healthcare). Før du tilføjer den 32P-oligonukleotid (1x10 5 cpm), 10 ug nukleare ekstrakt blev holdt på is i 15 min i gel shift bindende buffer. At bestemme sekvensen specificiteten af ​​NF-KB-DNA-interaktion, vi tilføjet et overskud af umærkede oligonukleotider. Efter 20 minutters inkubation ved stuetemperatur blev 2 pi 0,1% bromphenolblåt tilsat, og prøver blev elektroforeret gennem 6% ikke-denaturerende PAGE ved 150 V i et koldt rum. Endelig blev gelerne tørret og eksponeret for røntgenfilm (Kodak, Rochester, NY).
Immuncytokemi
Behandlede celler i kammeret objektglas blev fikseret med 3,7% formaldehyd i 15 min. Efter vask blev cellerne blokeret i 5% BSA-opløsning indeholdende 0,1% Triton X-100 i PBS i 1 time ved stuetemperatur, og derefter inkuberet med primært antistof (1: 100) i 12 timer ved 4 ° C. Celler blev derefter vasket 3 gange, inkuberet med sekundært antistof (1: 300) i 1 time, og derefter med 4'-6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, 100 ng /ml) i 1 min ved stuetemperatur. Efter vask 3 gange blev cellerne monteret med Prolong Gold antifade reagens (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Fluorescens blev visualiseret under et konfokalt laser mikroskop (LSM710, Carl Zeiss).
RNA-isolering og kvantitativ revers transkription polymerasekædereaktion (QRT-PCR)
Efter behandling blev mediet fjernet ved sugning, og cellerne blev vasket med Dulbeccos phosphat -buffered saltvand (DPBS) to gange. RiboEX (Gene All, Seoul, Korea) blev sat til plader, som derefter blev inkuberet i 10 min ved 4 ° C. RiboEX blev høstet og anbragt i et 1,5 ml rør, og chloroform blev tilsat og blandet forsigtigt. Efter inkubation i 10 minutter i is blev prøverne centrifugeret ved 10.000 x g i 30 min. Supernatanter blev ekstraheret og blandet med isopropanol og blandingerne blev inkuberet ved 4 ° C i 1 time. Efter centrifugering ved 13.000 g
i 30 minutter blev pelleten vasket med 70% (volumen
/v
) ethanol. Efter at have ladet ethanol til fordampe fuldstændigt, blev pellets opløst i diethylenglycol pyrocarbonat (DEPC) -behandlet vand (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). cDNA blev fremstillet under anvendelse af revers transkriptase afledt af murint Maloney-leukæmivirus (Promega, Madison, WI), ifølge producentens instruktioner. PCR blev udført over 30 cykler af: 94 ° C i 20 sekunder, 58 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 45 sek. Oligonukleotidprimere til PCR (tabel 1) blev købt hos Bioneer (Daejeon, Sydkorea). Alle QRT-PCR-forsøg blev gentaget tre gange, og kvantificering blev vist i middel ± SD.Table 1 Sekvensen af ​​PCR-primere
GAPDH
fremadrettet 5'-GGT GCT GAG TAT GTC GTG GA -3 '
Reverse 5'-TTC AGC TCT GGG ATG ACC TT-3 '
HO-1
Forward 5'-GAG AGC ATG TCC CAG GAT TT-3'
Reverse 5'-GGT TCT GCT TGT TTC GCT CT -3 '
COX-2
Forward 5'-GAA ATG GCT GCA GAG TTG AA -3'
Reverse 5'-TCA TCT AGT CTG GAG TGG GA -3 "
HIF-1α
Forward 5'-AAC AAA CAG AAT CTG TCC TC-3 '
Reverse 5'-GGT AAT GGA GAC ATT GCC AG-3'
VEGF
Forward 5'-CAA TGA TGA AGC CCT GGA GT-3 '
Reverse 5'-GAT TTC TTG CGC TTT CGT TT -3'
PDGF
Forward 5'-AGG AAG CCA TTC CCG CAG TT-3 '
Reverse 5'-CTA ACC TCA FTT GGA FTT CT -3 '
bFGF
Forward 5'-TAT GAA GGA AGA TGG ACG GC-3'
Reverse 5'-AAC AGT ATG GCC TTC TGT CC -3 '
IL-1β
Forward 5'-CAT TGT GGC TGT GGA GAA G-3 '
Reverse 5'-ATC ATC CCA CGA GTC ACA GA -3 "
IL-8
Forward 5' CAG ACA GTG GCA GGG ATT CA-3 '
Reverse 5'-TTG GGG ACA CCC TTT AGC AT-3'
TNF-α
Forward 5'-TAC TGA ACT TCG GGG TGA TT -3 '
Reverse 5'-CAG CCT TCT CCC TTG AAG AG-3 '
ICAM-1
Forward 5'-TGT GCT TTG AGA ACT GTG GC-3'
Reverse 5'-GGT TCT GTC CAA CTT CTC AG -3 '
VCAM-1
Forward 5'-GAG ACA AAA CAG AAG TGG AAT-3'
Reverse 5'-TAC AAG TGG TCC ACT TAT TTC -3 '
NOX1
Forward 5'-GAG AAA TTC TCG GAA CTG CC-3 '
Reverse 5'-TGT TGG CTT CTA CTG TAG CG -3' Salg In vitro
angiogenese assay
Denne assay blev udført under anvendelse af et kommercielt kit ifølge producentens anvisninger (Millipore, Billerica, MA). For hypoxiske betingelser, ECMatrix og diluentbuffer blev blandet for at gøre en fast gel, som derefter blev udpladet i 96 brønds mikroplader. Humane navlevene-endotelceller (HUVEC, 1,0 x 10 5 /ml) blev podet med kontrol, Indomethacin, indomethacin plus pantoprazol, indomethacin plus pantoprazol plus ZnPPIX inkuberet ved 37 ° C i 4 timer. Tube-dannelse blev observeret under et lysmikroskop.
Indomethacin-induceret gastrisk beskadigelse model
I alt 48 rotter blev indkøbt fra Charles River (Osaka, Japan). Dyrene blev håndteret i en akkrediteret dyr facilitet i overensstemmelse med Foreningen for Vurdering og akkreditering af Laboratory Animal Care International (AAALAC International) retningslinjer under faciliteten navngivne CACU (Center for Animal Care og brug) af Lee Gil Ya kræft og diabetes Institute, Gachon University efter Institutional Ethics Review Board godkendelse. Dyr blev inddelt i fire grupper hver bestående af 12 rotter, og blev sultet i 24 timer før eksperimentering som følger; blev alle rotter administreret med intraperitoneal injektion af indomethacin (10 mg /kg) for at provokere gastriske skader, anden gruppe med intraperitoneal injektion af 10 mg /kg af pantoprazol, den tredje gruppe med intraperitoneal injektion af 30 mg /kg af pantoprazol, og den fjerde gruppe med intraperitoneal injektion af 30 mg /kg af pantoprazol og 5 mg /kg af ZnPPIX at hæmme aktiviteten af ​​HO-1. Dyr blev aflivet 16 timer efter hver administration. Maverne af rotter blev fjernet og åbnet langs den store krumning og derefter vasket med iskold phosphatpufret løsninger. Antallet af enten erosioner eller sår blev bestemt under de forstørrede fotografier. Homogenater opnået fra ridset maveslimhinden blev holdt i flydende nitrogen beholder indtil assay.
Statistiske analyser
Resultater udtrykkes som middelværdi ± SD. Dataene blev analyseret ved envejs ANOVA, og den statistiske signifikans mellem grupperne blev bestemt ved Duncans test Multiple Range. Statistisk signifikans blev accepteret ved P
< 0.05.
Resultater
Pantoprazol øget HO-1-ekspression gennem Nrf2 aktivering
Baseret på foreløbige undersøgelse viste vi har fundet pantoprazol den højeste induktion af HO-1-ekspression i RGM-1 celler blandt PPI, lansoprazol, rabeprazol , omeprazol, og pantoprazol (data ikke vist). Pantoprazol øgede ekspressionen af ​​HO-1-mRNA og protein i en dosisafhængig måde (figur 1A) og immuncytokemisk analyse viste også, at niveauet af HO-1 var signifikant forhøjet ved pantoprazol behandling i cytoplasmaet i RGM-1 celler i en dosis -afhængig måde (figur 1B). For at forstå mekanismerne bag opregulering af HO-1-ekspression ved pantoprazol, vi undersøgte dens virkninger på aktivering af Nrf2, en stor transskription faktor, der medierer ARE /EpRE-drevne udtryk for antioxidant enzymer. Da vi målte ekspressionsniveauet for keap1, en repressor af Nrf2 i cytoplasmatiske fraktion behandlet med 300 pM pantoprazol i et andet tidspunkt, betydeligt nedsat ekspression af Keap1 blev observeret i 1 time (figur 2A), hvilket antyder, at HO-1 kan transkriberes efter pantoprazol behandling gennem Nrf2 aktivering og Keap1 inaktivering. Som illustreret i figur 2A, Nrf2 nuklear co-lokalisering var tydelig i RGM-1-celler behandlet med pantoprazol. Den maksimale ER-bindende aktivitet af Nrf2 blev forøget i 1 h samt dens kernelokalisering induceret af pantoprazol (figur 2B). For at sikre den nukleare ophobning af Nrf2, gennemførte vi en immuncytokemisk analyse ved hjælp af anti-Nrf2 antistof. Som vist i figur 2C blev Nrf2 translokeres ind nucleus med 300 pM pantoprazol behandling. Disse resultater konsekvent foreslået, at pantoprazol kunne øge HO-1-niveauer ved transkriptionel aktivering af Nrf2 i rotte gastriske epitelceller. Figur 1 Pantoprazol inducerede ekspressionen af ​​HO-1. (A) RT-PCR og Western blot for HO-1-ekspression efter forskellige dosering af pantoprazol, 30, 100, og 300 uM. Disse tal er repræsentanter for de opnåede resultater i 3 uafhængige forsøg. (B) Konfokal afbildning af HO-1. Pantoprazol øgede ekspressionen af ​​HO-1 i en dosis-afhængig måde i normal rotte gastrisk mucosa-RGM-1-celler.
Figur 2 Pantoprazol øget Nrf2 nuklear translokation og cytoplasmatisk keap1 inaktivering, medførte signifikant anti-oxidation. (A) Western blots for enten cytosoliske Keap1 eller nukleare Nrf2 i en anden tid i nærvær af 300 uM pantoprazol. (B) Elektroforetisk mobilitet (EMSA) for ARE-DNA bindingsaktivitet. Markant øget DNA-binding af Nrf2 blev noteret 60 min efter pantoprazol administration. (C) Konfokal afbildning af Nrf2 efter forskellige dosering af pantoprazol, 100 uM og 300 uM. (D) Electron (ESR) måling for Fenton reaktionen genererede hydroxylradikaler. (E) Ændringerne af DCF-DA fluorescens efter forskellige dosering af pantoprazol, 30, 100, og 300 uM. Pantoprazol faldt betydeligt H2O2-induceret oxidativ fluorescens.
Da den biologiske betydning af HO-1 pantoprazol besidder en anti-oxidativ handling relateret til HO-1 induktion. ESR måling var ultimative måde at spore frie radikaler under anvendelse af spin-addukt, som vi genererede hydroxylradikaler ved hjælp DMPO som adductor under Fenton reaktionen. Som det ses i figur 2D, 3 mM pantoprazol udøvede klar fjernende virkning af DMPO-addukt-generering hydroxylradikaler. Da ESR måling blev udført i kemisk reaktion betingelse ikke biologisk system og pantoprazol er ikke en professionel antioxidant, det definitivt bidrog til at fjerne hydroxylradikaler selvom det er relativt høj koncentration af pantoprazol til at fjerne reaktive oxygenarter. Disse kemiske resultater fra ESR undersøgelse blev yderligere valideret med biologisk test med DCF-DA fluorescensmåling, som viser, at pantoprazol viste signifikant DCF-DA reduktion på en dosis-afhængig måde (P
< 0,05, figur 2E).
angiogene aktioner deraf til pantoprazolinducerede HO-1
PPI steg udtrykkene for VEGF-mRNA og protein i RGM-1-celler (figur 3A). For at dokumentere, om den trinvise induktion af VEGF med PPI er relateret til HO-1 induktion, vi gentog forsøgene med PPI alene eller co-behandling af pantoprazol og zink protoporphyrin (ZnPPIX) som HO-1 hæmmer. Som resultaterne, kunne vi bekræfte ekspressionen af ​​VEGF induceres af pantoprazol og inkremental co-behandling af ZnPPIX klart faldet ekspressionen af ​​PPI-induceret VEGF på en dosis-afhængig måde (figur 3B). Dernæst undersøgte vi ændringerne i repræsentative angiogene faktorer, bFGF, PDGF og HIF-1α og observeres disse udtryk er relevante for pantoprazol-inducerede HO-1 i figur 3C. Som forventet, pantoprazol steget markant disse udtryk for flere angiogene faktorer. Også disse induktioner af bFGF og PDGF var signifikant svækket med co-behandling af pantoprazol og ZnPPIX. For at efterprøve, om disse induktioner af angiogene faktor efter pantoprazol var faktisk relateret til angiogenese, in vitro
angiogenese assay blev udført (figur 3D). Tube formation var signifikant svækket med 500 uM indomethacin i HUVEC'er, mens 100 uM pantoprazol kunne overvinde disse derangements af angiogenese behandlet med indomethacin. Men yderligere behandling med ZnPPIX afskaffede disse fordele ved at overvinde angiogenese ved pantoprazol under indomethacin administration. Disse resultater antyder, at pantoprazol kompenseret NSAID-induceret defekte angiogenese gennem sin HO-1 induktion kapacitet. Figur 3 Pantoprazol inducerede angiogene faktorer relateret til HO-1 induktion. (A) RT-PCR og Western blot for VEGF. Væsentlige induktioner af VEGF blev noteret med pantoprazol, markant efter 300 uM pantoprazol (p < 0,05
). Disse tal er repræsentanter for de opnåede resultater i 3 uafhængige forsøg. (B) Ændringerne af VEGF og HO-1 med pantoprazol alene eller en kombination af pantoprazol og ZnPPIX. Induktion af VEGF efter pantoprazol var signifikant svækket med HO-1 hæmmer, der betyder konsekvenserne af HO-1 i PPI-induceret VEGF. Disse tal er repræsentanter for de opnåede resultater i 3 uafhængige forsøg. (C) Andre angiogene faktorer relateret til pantoprazol. bFGF og VEGF blev i stigende grad udtrykt med pantoprazol, men disse induktioner blev svækket med HO-1 hæmmer. Disse tal er repræsentanter for de opnåede resultater i 3 uafhængige forsøg. (D) in vitro
angiogenese assay. Tube dannelsen af ​​HUVEC blev signifikant nedsat med 50 pM indomethacin. Pantoprazol kompenseret indomethacin-induceret defekte angiogenese som vurderet med den procentdel dannelse rør, mens HO-1 hæmmer aflyst disse overvindes af pantoprazol-induceret angiogenese. Disse tal er repræsentanter for de opnåede resultater i 3 uafhængige forsøg.
Pantoprazol-induceret HO-1 svækket indomethacin-associeret inflammatorisk overfald
Selvom indomethacin er en anti-inflammatorisk middel, har det været kendt, at NSAID-induceret gastrisk beskadigelse gennem øgede udtryk for inflammatoriske mediatorer, herunder TNF-α, IL-1β, IL-8, og NADPH-oxidase-1 (NOX-1). Som det ses i figur 4A, 500 uM indomethacin steget betydeligt udtrykkene for TNF-α, IL-1β og IL-8 i gastriske epitelceller, mens den faldt ekspressionen af ​​HO-1, som bekræfter, at inflammatoriske mediatorer kan være mekanisk forbundet med indomethacin-induceret gastrisk epitelcelleskade. I denne tilstand, samtidig administration af 500 uM indomethacin og 300 uM pantoprazol faldt betydeligt udtryk af TNF-α, IL-1β og IL-8 ledsaget med statistisk signifikante stigninger i HO-1-ekspression. Derudover indomethacin udfordring steget betydeligt udtrykkene for NOX-1, hvor pantoprazol betydeligt svækkede den forøgede ekspression af NOX-1, hvilket antyder, at pantoprazolinducerede HO-1 indført antiinflammatoriske aktioner under indomethacin. Dernæst for yderligere at vise, om disse dæmpninger af inflammatoriske mediatorer efter pantoprazol er ført fra HO-1 induktion, vi gentog disse eksperimenter med ZnPPIX administration. Som det ses i figur 4B, co-behandling af ZnPPIX i nærvær af pantoprazol betydeligt afskaffet fordelene ved anti-inflammatorisk virkning. De forlængede induktioner af ICAM-1 og VCAM efter indomethacin behandling var ansvarlige for iskæmi og forværret organskader, hvor enten vaskulær inflammation eller forøget leukocyt aggregation blev engageret. Behandling med indomethacin steget betydeligt udtrykkene for ICAM-1 og VCAM i HUVEC, men co-udfordring af indomethacin og pantoprazol faldt betydeligt indomethacin-induceret ICAM-1-ekspression relevante for øget induktion af HO-1 (figur 4C). I denne tilstand har ZnPPIX ikke pålægge dæmpningen af ​​ICAM eller VCAM trods pantoprazol behandling, yderligere sikre modtageren virkning af pantoprazol forbundet med HO-1 induktion. Figur 4 Pantoprazol svækket indomethacin-induceret inflammatoriske mediatorer gennem HO-1. (A) RT-PCR for TNF-α, IL-1β, IL-8, og HO-1. 500 uM indomethacin øgede ekspression af inflammatoriske mediatorer, herunder TNF-α, IL-1β, IL-8, men faldt betydeligt HO-1-ekspression. NOX-1 blev signifikant øget med indomethacin. Disse tal er repræsentanter for de opnåede resultater i 3 uafhængige forsøg. (B) Pantoprazol signifikant nedsat indomethacin-induceret IL-1β og TNF-α, men disse begunstigede handlinger pantoprazol blev afskaffet med ZnPPIX, hvilket fører til den konklusion, at anti-inflammatoriske virkninger af pantoprazol var grund HO-1 induktion. Disse tal er repræsentanter for de opnåede resultater i 3 uafhængige forsøg. (C) Pantoprazol signifikant nedsat indomethacin-induceret ICAM-1 og VCAM i HUVEC celler, men disse begunstigede handlinger pantoprazol blev også afskaffet ZnPPIX som HO-1 hæmmer. Disse tal er repræsentanter for de opnåede resultater i 3 uafhængige forsøg.
Pantoprazol-induceret HO-1 svækket indomethacin-induceret gastrisk skade
For at undersøge den beskyttende effekt af pantoprazol in vivo
, indomethacin (10 mg /kg ) blev administreret intraperitonealt i 16 timer i rotter. Behandling med indomethacin signifikant provokeret gastriske mucosale skader herunder blødende erosioner og ulcerationer. Imidlertid blev disse gastriske patologier provokeret med indomethacin signifikant svækket med intraperitoneal injektion af 30 mg /kg pantoprazol (figur 5A). Da disse beskyttende virkninger af 30 mg /kg pantoprazol mod indomethacin-induceret gastrisk skade var signifikant afskaffet med co-behandling af intraperitoneal indgivet 5 mg /kg ZnPPIX, bekræftede vi, at den beskyttende virkning af pantoprazol var baseret på dens evne til HO-1 induktion . Når udtrykkene for HO-1 og ICAM-1 blev målt i mucosale homogenater fra hver gruppe, indomethacin administration faldt betydeligt udtrykkene for HO-1 og forøget ekspression af ICAM-1. Som følge af øgede HO-1 udtryk efter pantoprazol samt signifikant svækkede niveauer af ICAM-1, indomethacin-induceret gastrisk beskadigelse blev proportionalt forbedret på trods af indomethacin udfordring (figur 5B). At vise, hvordan pantoprazol forbedret defekte angiogenese og iskæmi provokeret af indomethacin, EMSA hjælp HIF-1α blev udført (figur 5C). Den HIF-1α-DNA bindende aktivitet blev stærkt forøget i indomethacin alene gruppen, som var signifikant nedsat i gastriske homogenater af pantoprazol behandlingsgruppe, der betyder pantoprazol betydeligt lettet hypoxisk tilstand fremkaldt af indomethacin. Tilsammen PPI udøvede en stærk beskyttelse mod indomethacin-induceret maveslimhinden skader gennem betydelig HO-1 induktion, som er ud over autentiske syre undertrykkende handling, selvom vi ikke måle ændringerne i gastrisk surhedsgrad. Figur 5 Pantoprazol forhindrer til indomethacin-induceret gastrisk beskadigelse gennem afhængigt induktionen af ​​HO-1. (A) Mean indeks af indomethacin-induceret gastrisk skade. (B) RT-PCR for HO-1 og ICAM-1 ifølge gruppe. (C) EMSA for HIF-1α ifølge gruppe. Indomethacin signifikant forøget HIF-1α-DNA-binding, mens pantoprazol signifikant nedsat HIF-1α-DNA bindende i en dosisafhængig måde.
Diskussion
Før den aktuelle undersøgelse, har flere forskere offentliggjort, at PPI kunne forhindre maveslimhinden skade af andre mekanismer ud over virkningen af ​​dens specifikke syrehæmning [11, 14, 25-28], kunne vi tilføje flere beviser vedrørende beskyttende virkning af PPI mod NSAID. Pantoprazol signifikant inducerede ekspressionen af ​​HO-1 til Nrf2 aktivering relevante for anti-inflammatorisk, anti-oxidative og iskæmi lindre handlinger. Novel fund af denne undersøgelse adskiller sig fra andre undersøgelser, er, at pantoprazol viser beskyttelsesforanstaltninger til NSAID-induceret skade gennem enten korrektion af angiogene handicap eller dæmpningen af ​​betændelse tilbøjelighed.
Becker JC et al.
[16] viste, at både omeprazol og lansoprazol beskyttet menneskelige gastrisk epitel og endotelceller mod oxidativ stress ligner vores undersøgelse, men brugte forskellige former for PPI. Eftersom denne virkning blev ophævet i nærvær af HO-1-inhibitor, ZnPPIX, HO-1 synes at være en rigtige mål af PPI i både endotel og gastriske epitelceller. I denne undersøgelse observerede vi uberørt roman fund, at HO-1 induceret af PPI faldt NSAID-afholdt inflammation og angiogen forstyrrelse. Takagi T et al.
[25] også undersøgt den rolle, Nrf2, dets phosphorylering /aktivering, og oxidation af Keap1 i lansoprazol-induceret HO-1 opregulering ved hjælp samme cellelinje med os, RGM-1-celler. Alle forfattere læst og godkendt den endelige manuskript.

• Epstein-Barr virus associeret gastrisk karcinom: en rapport fra Iran i de sidste fire decades
• Association mellem RUNX3 promotor methylering og mavekræft: en meta-analysis