Возможное участие Nrf2-опосредованной гемоксигеназы-1 повышающей регуляции в защитном эффекте протонного насоса ингибитора пантопразола против индометацин-индуцированного повреждения желудка в rats

A возможном участии Nrf2 опосредованную гемоксигеназы-1 повышающей регуляции в защитный эффект протонного насоса ингибитор пантопразол против индометацин-индуцированного повреждения желудка у крыс
Аннотация
Справочная информация
протонный насос представляет собой интегральный мембранный белок, который является повсеместным АТФ связывающего кассетного (ABC) участвует во многих транспортных процессов во всех живых организмах, в том числе который специализированная форма насоса, так называемый р
типа протонного насоса, существует в париетальных клетках желудка. Хотя ингибиторы протонной помпы (ИПП) часто назначают для предотвращения нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) индуцированный повреждение желудка, кислотно-подавляющие действия не достаточно для объяснения.
Методы
Для документирования последствий пантопразола , один из ИПН, на НПВС-индуцированные повреждения желудка в пробирке
и в естественных условиях были проведены исследования
. Иммуноцитохимическая, Вестерн-блот-анализ, методом сдвига электрофоретической подвижности и ОТ-ПЦР проводили с целью оценить индукцию гемоксигеназы-1 (HO-1) через активацию Nrf2 в нормальных клетках слизистой оболочки желудка РГМ-1 или в естественных условиях
тканей желудка от крыс, получавших индометацин и /или пантопразола.
Результаты
пантопразола активированного Nrf2 через инактивации Keap1, после чего экспрессия HO-1 была значительно увеличена в зависимости от дозы в клетках RGM-1. Повышенная активность связывания ARE-ДНК наблюдали максимально на 1 ч с 300 мкМ пантопразола. Выражение HO-1, индуцированный пантопразола была в значительной степени связано с повышенной экстракорпорального
формирования трубки на в (P &
л; 0,05) и развитие кровеносных сосудов факторы, включая VEGF, bFGF и HIF-1. Индометацин заметно возросшую выражения TNF-alpha, IL-1ß, IL-8, NOX-1, ICAM-1 и VCAM, в то время как пантопразол значительно уменьшились выражения индометацин-индуцированного этих медиаторов воспаления в соответствии с пантопразол-индуцированный HO-1 (Р
≪ 0,05), как документировано с ингибитором HO-1. В естественных условиях
модели индометацин-индуцированного повреждения желудка может подтвердить в пробирке
-drawn результаты, которые пантопразол замечательно защищены от индометацин-индуцированного повреждения желудка, в котором цинк протопорфирин (5 мг /кг, внутрибрюшинно
) значительно отмененные защитная эффективность пантопразола.
Заключение
Эти результаты показывают, что Nrf2 опосредованной HO-1 индукция ИЦП дает значительный защитный эффект против НПВС-индуцированных повреждений желудка за кислотных подавляющих действий.
Ключевые слова
гема оксигеназы-1 Протон ингибитор насоса НПВС-индуцированной гастропатии Nrf2 фон
НПВС имеют огромные объемы рецепта в основном на основе следующих двух преимуществ, одно является увеличение пациентов в возрасте требуя НПВС рецепт, чтобы облегчить боль дегенеративных изменений индуцированных, а другой представляет собой дополнительное испытание для любой профилактики полипов толстой кишки или бегства от ишемических сердечно-сосудистых заболеваний [1, 2]. Тем не менее, подавляющее использование НПВС ограничено хлопотно побочных эффектов, таких как эрозия желудка /язвы, осложненной кровотечением из язв, и более серьезных осложнений, возникающих в тонком кишечнике и толстой кишки. Так как фармакологическое действие НПВС через ингибирование простагландин (PG) синтеза через подавление циклооксигеназы (ЦОГ) [3], неразличимы уменьшение гастропротекторного простагландина Е <суб> 2 (ПГЕ <суб> 2) несет ответственность за эти желудочно-кишечного тракта (GI) побочных эффектов. Хотя изобретение селективного ингибитора ЦОГ-2, coxib, чтобы гарантировать безопасность GI была предложена в качестве стратегии решение проблем, это решение также нуждается в улучшении. Хотя НПВС используются в качестве мощных противоязвенных препаратов, дополнительные непокрытые механизмы токсичности НПВС [4, 5] приводят нас к разработке более мощных и безопасных агентов.
В настоящее время является лучшим выбором для профилактики НПВС, связанных с Г.И. токсичность является либо комбинация НПВС и ингибиторов протонной помпы (ИПП) или выбор коксибами [6, 7]. Поскольку целительная скорость GI язв при непрерывном использовании НПВС было больше в ИПП группе, чем типа гистамина 2 антагониста рецептора (H2-RA) группы, ИЦП был предпочтительным, чем H2-RA, чтобы справиться с неблагоприятным влиянием НПВС [8, 9 ]. Помимо основных кислотных подавляющие действия ИПН, некоторые функции были выявлены, которые являются снижение проапоптотического сигнализации, кислотно-независимого восстановления пролиферирующих и ремонта путей [10], уменьшение слизистого окислительного повреждения, излечивая поощрения действий, и эндоплазматической сети механизм снятия напряжений [11-16]. Хам и др.
[17-19] также сообщили, что ИЦП показывают потенциальную деятельность в качестве противораковых терапевтических средств на основе селективной индукции апоптоза, анти-ангиогенеза против Helicobacter Pylori
-associated канцерогенеза, а также прямых анти-мутагенные действия во время онкогенеза. Однако механизмы, ответственные за защитные эффекты ИЦП в НПВС-индуцированное повреждение желудка, еще предстоит определить.
Гемоксигеназы-1 (HO-1), индуцируемый для первого и фермент, ограничивающий скорость деградации гема, был известно, для защиты от цитотоксичности окислительного стресса и апоптотической гибели клеток, а также воспалительные состояния [20, 21]. Основные защитные эффекты HO-1 против воспаления опосредуется через анти-окислительной деградации гема, но и связано с производством противовоспалительных медиаторов, для которых окислительно-восстановительной зависимой активатор транскрипции, NF-E2-связанной фактор 2 (Nrf2), и его фосфорилирования /активации, а также окисление Kelch-как ECH-ассоциирования белок 1 (Keap1) является механистически предложил [22-24]. Так как экспрессия HO-1 был вызван анти-окислительной, противовоспалительным и ишемических реакций, ослабляющие, в настоящем исследовании, мы предположили, что защитные эффекты ИЦП против НПВП-индуцированного повреждения желудка могут быть связаны с HO-1 и, как следствие ангиогенез за подавления врожденной кислоты. В целом, полученные результаты демонстрируют новые механизмы, которые ИЦП индуцируют экспрессию HO-1 через активацию Nrf2 /дезактивирующих Keap1 сопровождается вознаграждением ишемического изменения и ослабления воспалительных медиаторов, облегчая тем самым защиту от индометацин-индуцированное повреждение желудка.
методов
материалы и клеточных культур
Индометацин был приобретен у фирмы Sigma Aldrich (Сент-Луис, Миссури) и пантопразола была предоставлена ​​из Amore тихоокеанского Фармасьютикал Ко (Сеул, Корея). Антитела для бета-актина, HO-1, α-тубулина, Keap1, Nrf2 и СЭФР были получены от Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Клетки РГМ-1 слизистой желудка нормальной крысы были предоставлены профессором Хирофуми Matsui, MD, PhD (Tsukuba Univ., Япония), культивировали в модифицированной среде Дульбекко Игла (DMEM), содержащей 10% (об
/об
) фетальной бычьей сыворотки, 100 ед /мл пенициллина. Пуповинным эндотелиальные клетки сосудов (HUVECs) культивировали в среде M199 (InnoPharma экран, Сеул, Корея). Клетки выдерживали при 37 ° С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO <суб> 2. Соответствующие количества клеток РГМ-1 или HUVECs были посеяны и инкубировали в течение 24 ч, а затем их обрабатывали указанной дозы пантопразола или индометацин, и инкубировали в течение указанных промежутков времени. HUVECs были перенесены на 1% O <суб> 2 и 5% CO <суб> 2 гипоксией камере и инкубируют в течение 0-12 ч для экстракорпорального
формирования трубки пробирного.
Электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) спектроскопии и РОС измерения поколения
Различные концентрации пантопразола до общего объема 200 мкл, содержащем 0,05 мМ FeSO <суб> 4, 1 мМ Н <суб> 2O <суб> 2, 1 мМ 5,5-dimethylpyrroline-N-оксид (ДМПО, Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури), и 50 мМ фосфата натрия при рН 7,4 при комнатной температуре. Реакции инициировали добавлением H <суб> 2O <суб> 2. После инкубации в течение 1 мин, аликвоты реакции переносили в кварцевую кювету и спектр DMPO-OH исследовали с помощью СОЭ спектрофотометр (JES-TE300, JEOL, Токио, Япония) при следующих условиях: магнитное поле, 338,0 ± 5,0 мТл; СВЧ-мощности, 4,95 мВт; частота, 9.421700 ГГц; амплитудной модуляции, 5 мТл; время развертки, 0,5 мин; и постоянная времени, 0.03 s. содержание Клеточная ROS измеряли путем инкубирования управления или пантопразол лечение РГМ-1 клеток с 10 мкМ H <суб> 2DCF-DA (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) в течение 30 мин. Измеряют флуоресценцию с использованием конфокальной лазерной микроскопии (LSM710, Карл Цейс, Оберкохен, Германия).
Вестерн-блот-анализ
Обработанные клетки дважды промывали ПБС, а затем подвергали лизису в охлажденном льдом буфере для лизиса клеток (Cell Signaling Technology), содержащего 1 мМ фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ, Sigma Aldrich). Белки в лизаты разделяли с помощью SDS-PAGE и переносили на поливинилиденфторид (PVDF) мембранах, которые были инкубированы с первичными антителами, промывают, инкубируют с пероксидаза-конъюгированными вторичными антителами, вновь промыты, а затем визуализировали с помощью усиленной хемилюминесценции системы (ECL) ( GE Healthcare, Бакингемшир, Великобритания).
Электрофорезная подвижности в геле сдвиг анализа (EMSA)
Ядерные и цитоплазматические фракции экстрагировали с помощью NE-PER ядра и цитоплазмы реагентов (Pierce, Rockford, IL), в соответствии с инструкциями изготовителя. Антиоксидант элемент ответа (ARE) олигонуклеотидный зонд, 5'-ТТТ ТСТ GCT GAG ТСА ТСС AGG G-3 ', и HIF-1α олигонуклеотидный зонд, 5'-TCT ГТА ВКТ GAC CAC ACT CAC CTC-3', метили с помощью [ ,,,0],γ- 32P] АТФ с использованием Т4 полинуклеотидкиназу (Promega, Madison, WI) и отделен от некорпоративное [γ- 32Р] АТР путем гель-фильтрации с использованием колонки спина ника (GE Healthcare). Перед добавлением 32Р-олигонуклеотид (1x10 5 СРМ), 10 мкг ядерного экстракта выдерживают на льду в течение 15 мин в гель сдвига буфера связывания. Для того, чтобы определить специфичность последовательности взаимодействия ДНК NF-kB, мы добавили избыток немеченых олигонуклеотидов. Через 20 мин инкубации при комнатной температуре добавляли 2 мкл 0,1% бромофенолового синего, и образцы подвергали электрофорезу на 6% неденатурирующем ПААГ при 150 V в холодном помещении. И, наконец, гели сушили и экспонировали на рентгеновской пленке (Kodak, Рочестер, штат Нью-Йорк).
Иммуноцитохимическая
Обработанные клетки в камере слайдов фиксируют на 3,7% формальдегида в течение 15 мин. После промывки клетки были блокированы в 5% -ном растворе БСА в PBS, содержащем 0,1% Тритон Х-100 в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем инкубировали с первичным антителом (1: 100) в течение 12 ч при температуре 4 ° С. Затем клетки промывали 3 раза, инкубировали с вторичным антителом (1: 300) в течение 1 ч, а затем с 4'-6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI, 100 нг /мл) в течение 1 мин при комнатной температуре. После промывки 3 раза, клетки были установлены с Продлить Gold antifade реагента (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Флуоресцентный визуализировали под конфокальной лазерной микроскопии (LSM710, Carl Zeiss).
Выделение РНК и количественный обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (QRT-ПЦР)
После обработки среду удаляли отсасыванием и клетки промывали фосфатно-Дульбекко -buffered физиологический раствор (DPBS) дважды. RiboEX (Джин Все, Seoul, Korea) добавляют к пластинам, которые затем инкубировали в течение 10 мин при температуре 4 ° С. RiboEX собирали и помещали в 1,5 мл пробирку и добавляли хлороформ и осторожно перемешивают. После инкубации в течение 10 мин на льду, образцы центрифугировали при 10000 • g в течение 30 мин. Супернатанты извлекали и смешивали с изопропиловым спиртом, и смеси инкубировали при 4 ° С в течение 1 ч. После центрифугирования при 13000 г
в течение 30 мин, осадок промывают 70% (об /об

) этанола. Дав этанол испарится полностью, гранулы растворили в диэтиленгликоль пирокарбоната (ДЭФЦ) -обработанной воде (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). кДНК получали с использованием обратной транскриптазы, полученный из мышиного вируса лейкемии Малони (Promega, Madison, WI), в соответствии с инструкциями изготовителя. ПЦР проводили более 30 циклов: 94 ° C в течение 20 сек, 58 ° C в течение 30 сек и при 72 ° С в течение 45 сек. Олигонуклеотидные праймеры для ПЦР (таблица 1) были приобретены у Bioneer (Тэджон, Корея). Все эксперименты QRT-PCR повторяли в трех экземплярах и количественное определение было показано в среднем ± SD.Table 1 Последовательность ПЦР-праймеров
GAPDH
Результаты Форвард 5'-GGT GCT GAG TAT GTC GTG GA -3 '
Обратный 5'-ТТС AGC TCT GGG ATG ACC TT-3 '
HO-1
Форвард 5'-GAG AGC ATG TCC CAG GAT TT-3'
Обратный 5'-GGT TCT GCT TGT TTC GCT CT -3 '
ЦОГ-2
Форвард 5'-GAA ATG GCT GCA GAG TTG AA -3'
Обратный 5'-TCA TCT AGT CTG GAG TGG GA -3 '
HIF-1α
Форвард 5'-AAC AAA CAG AAT CTG TCC TC-3 '
Обратный 5'-GGT ААТ GGA GAC ATT GCC AG-3'
VEGF
Форвард 5'-CAA TGA TGA AGC ЧМТ GGA GT-3 '
Обратный 5'-GAT TTC TTG CGC ТТТ ВКТ TT-3'
PDGF
Форвард 5'-AGG AAG CCA TTC CCG CAG TT-3 '
Обратный 5'-СТА ACC TCA CCT GGA CCT CT -3 '
bFGF
Форвард 5'-TAT GGA GAA AGA TGG ACG GC-3'
Обратный 5'-AAC AGT ATG GCC TTC TGT CC -3 '
IL-1β
Форвард 5'-CAT TGT GGC TGT GAA GGA G-3 '
Обратный 5'-ATC ATC CCA CGA GTC ACA GA -3'
IL-8
Форвард 5'- CAG GTG ACA GCA GGG ATT CA-3 '
Обратный 5'-TTG GGG ACA CCC ТТТ AGC AT-3'
TNF-alpha
Результаты Форвард 5'-TAC TGA TCG ACT GGG TGA TT -3 '
Обратный 5'-CAG CCT TCT CCC AAG TTG AG-3 '
ICAM-1
Форвард 5'-TGT GCT TTG AGA ACT GTG GC-3'
Обратный 5'-GGT TCT GTC CAA СТТ СТС AG -3 '
VCAM-1
Форвард 5'-GAG ACA AAA CAG AAG TGG AAT-3'
Обратный 5'-TAC AAG TGG TCC ACT ТАТ ТТС -3 '
NOX1
Форвард 5'-GAG AAA TTC TCG CTG GAA CC-3 '
Обратный 5'-TGT TGG СТТ СТА CTG TAG CG-3'
In Vitro
ангиогенеза анализа
Этот анализ проводили с использованием коммерческого набора в соответствии с инструкцией изготовителя (Millipore, Billerica, MA). Для гипоксических условиях, ECMatrix и Разбавитель буфер смешивали, чтобы сделать твердый гель, который затем помещали в 96-луночных микропланшетов. Пупочной вены человека эндотелиальных клеток (HUVEC, 1,0 × 10 5 /мл) высевали с контрольной, индометацин, индометацин плюс пантопразол, индометацин плюс пантопразола плюс ZnPPIX инкубировали при 37 ° С в течение 4 ч. формирование Трубку наблюдали под световым микроскопом.
Индометацин-индуцированную модель повреждений желудка
Всего 48 крыс были приобретены у Charles River (Осака, Япония). Животные были обработаны в аккредитованной вивария в соответствии с ассоциацией по оценке и аккредитации лабораторных животных Care International (AAALAC International) руководящих принципов в рамках объекта по имени CaCu (Центр уходу и использованию животных) Ли Гил Я. Рака и института диабета, Gachon университет после одобрения этическими комитетами по этике. Животные были разделены на четыре группы, каждая из которых состояла из 12 крыс и подвергали голоданию в течение 24 ч до начала экспериментов следующим образом; У всех крыс вводили внутрибрюшинно инъекции индометацина (10 мг /кг), чтобы спровоцировать желудочные повреждения, вторую группу с внутрибрюшинным введением 10 мг /кг пантопразола, третья группа с внутрибрюшинным введением 30 мг /кг пантопразола, а четвертый группа с внутрибрюшинным введением 30 мг /кг пантопразола и 5 мг /кг ZnPPIX для ингибирования активности HO-1. Животных умерщвляли через 16 ч после каждого введения. Желудки крыс были удалены, и открыты вдоль большой кривизны, а затем промывали охлажденным льдом фосфатно-буферном растворах. Числа либо эрозий или язв определялись при увеличенных фотографий. Гомогенаты, полученные из поцарапанные слизистой оболочки желудка содержались в баке жидкого азота до анализа.
Статистический анализ
Результаты выражены в виде среднего значения ± SD. Данные анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа, и статистическая значимость между группами определяли с помощью теста множественного диапазона Дункана. Статистическая значимость была принята в P &
ЛТ; 0.05.
Результаты
Пантопразол увеличилось HO-1 выражение через Nrf2 активации
На основе предварительного исследования, мы обнаружили пантопразол показали самую высокую индукцию HO-1 выражение в АГР-1 клеток среди ИПН, лансопразол, рабепразол , омепразол, пантопразол и (данные не показаны). Пантопразол повышал экспрессию HO-1 мРНК и белка в зависимости от дозы образом (фиг.1А) и иммуногистохимический анализ также показал, что уровень HO-1 была значительно увеличена путем пантопразола обработки в цитоплазме RGM-1 клеток в дозе -зависимая образом (Фигура 1В). Для того, чтобы понять механизмы, лежащие в основе повышающей регуляции HO-1 по выражению пантопразола, мы исследовали его воздействие на активацию Nrf2, основного фактора транскрипции, который опосредует ARE /EpRE-Driven экспрессию антиоксидантных ферментов. Когда мы измерили уровень экспрессии keap1, репрессором Nrf2 в цитоплазматической фракции обрабатывали 300 мкМ пантопразола в другой момент времени, значительно уменьшилось экспрессия Keap1 наблюдалась в 1 ч (рис 2А), предполагая, что HO-1 могут быть расшифрованы после того, как пантопразола лечения через активацию Nrf2 и инактивации Keap1. Как показано на фигуре 2А, ​​Nrf2 ядерная совместная локализация была очевидна в клетках РГМ-1, обработанных пантопразола. Максимальное ARE-связывающая активность Nrf2 была увеличена в течение 1 часа, а также его ядерной локализации, индуцированных пантопразола (Фигура 2В). Для того, чтобы установить ядерное накопление Nrf2, мы провели иммуноцитохимический анализ с использованием анти-Nrf2 антитела. Как показано на фиг.2С, Nrf2 был транслокации в ядро ​​с 300 мкМ пантопразола лечения. Эти результаты последовательно предположил, что пантопразол может увеличить уровни HO-1 через транскрипционной активации Nrf2 в крысиных эпителиальных клеток желудка. На рисунке 1 пантопразол индуцирует экспрессию HO-1. (А) ОТ-ПЦР и Вестерн-блот для HO-1 экспрессии в соответствии с различными дозирования пантопразола, 30, 100, и 300 мкМ, соответственно. Эти цифры являются представителями результатов, полученных в 3-х независимых экспериментов. (B) конфокальной визуализации HO-1. Пантопразол увеличил экспрессию HO-1 в зависимости от дозы в нормальной крысы слизистой оболочки желудка клеток RGM-1. Рисунок 2
Pantoprazole повышенную Nrf2 ядерную транслокацию и цитоплазматический инактивацию keap1, привело к значительному антиокислительные. (А) Вестерн-блоты для любого цитозольного Keap1 или ядерным Nrf2 в другое время, в присутствии 300 мкМ пантопразола. (B) Электрофорезная сдвиг подвижности анализ (EMSA) для ARE-ДНК связывающей активности. Значительно увеличена ДНК-связывание Nrf2 было отмечено через 60 мин после введения пантопразола. (С) конфокальной визуализации Nrf2 после того, как различные дозировки пантопразола, 100 мкМ и 300 мкМ. (D) электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) измерения для Фентона реакции сгенерированных гидроксильных радикалов. (Е) Изменения ДДП-DA флуоресценции после различной дозировки пантопразола, 30, 100 и 300 мкМ. Пантопразол значительно снизилась H2O2-индуцированного окислительного флуоресценцию.
Поскольку биологическое значение HO-1 пантопразол обладает антиоксидантным действием, связанной с HO-1 индукции. измерение ESR был лучший способ проследить генерирование свободных радикалов с помощью спинового аддукта, для которого мы сгенерировали гидроксильные радикалы, используя DMPO в качестве аддуктора при реакции Фентона. Как показано на рисунке 2D, 3 мМ пантопразол, оказываемое действие четкую способность поглощать ДМПО-аддукт генерирующим гидроксильных радикалов. Поскольку измерение СОЭ было выполнено в химическое состояние реакция не биологической системы и пантопразол не является профессиональным антиоксидантом, он определенно способствовал роются гидроксильные радикалы, даже если она является относительно высокая концентрация пантопразола в роются активных форм кислорода. Эти химические результаты исследования ЭПР были дополнительно подтверждена с биологической тест с использованием измерения флуоресценции DCF-DA, показывая, что пантопразол показали значительное снижение DCF-DA в зависимости от дозы (P &
л; 0,05, рис 2E).
Ангиогенные действия как следствие пантопразола-индуцированной HO-1
ИПН увеличили выражения мРНК VEGF и белка в клетках RGM-1 (рис 3А). Для того, чтобы документировать ли инкрементальный индукция VEGF с ИЦП связано с HO-1 индукции, мы повторили опыты с только PPI или совместного лечения пантопразол и цинка протопорфирина (ZnPPIX) в качестве ингибитора HO-1. Как показывают результаты, мы могли бы подтвердить экспрессию VEGF, индуцированного пантопразол и накопительным совместного лечения ZnPPIX явно снижала экспрессию ИКО-индуцированной VEGF в зависимости от дозы образом (рис 3б). Далее, мы исследовали изменения представительных ангиогенных факторов, bFGF, PDGF и HIF-1 и наблюдали эти выражения, имеющие отношение к пантопразол-индуцированной HO-1 на рисунке 3C. Как и ожидалось, пантопразол значительно увеличили эти выражения нескольких факторов ангиогенеза. Кроме того, эти индукций bFGF и PDGF были значительно ослабляется при совместном лечении пантопразола и ZnPPIX. Для того чтобы проверить, являются ли эти индукций ангиогенного фактора после пантопразол на самом деле были связаны с ангиогенезом, в пробирке
ангиогенез анализ был сделан (рисунок и 3D). Формирование труб значительно ослабляется с 500 мкМ индометацин в HUVECs, тогда как 100 мкМ пантопразол может преодолеть эти ангиогенеза расстройствами, получавших индометацин. Тем не менее, дополнительное лечение с ZnPPIX отменили эти преимущества преодоления ангиогенез пантопразола под управлением индометацин. Эти результаты свидетельствуют о том, что пантопразола с компенсацией НПВС-индуцированных дефектный ангиогенез через HO-1 индукционный способности. Рисунок 3 Pantoprazole индуцированное развитие кровеносных сосудов факторы, связанные с HO-1 индукции. (А) ОТ-ПЦР и Вестерн-блот для VEGF. Значительные индукций VEGF были с пантопразола отмечено, что значительно после того, как 300 мкМ пантопразола (р &; 0,05 ЛТ
). Эти цифры являются представителями результатов, полученных в 3-х независимых экспериментов. (Б) Изменения СЭФР и HO-1 с использованием только пантопразол или комбинации пантопразола и ZnPPIX. Индукция VEGF после пантопразола была значительно ослаблена с ингибитором HO-1, означающий подтекст HO-1 в PPI-индуцированной VEGF. Эти цифры являются представителями результатов, полученных в 3-х независимых экспериментов. (C) Другие ангиогенные факторы, связанные с пантопразола. bFGF и VEGF все больше выражены с пантопразола, но эти индукциями были ослаблены с ингибитором HO-1. Эти цифры являются представителями результатов, полученных в 3-х независимых экспериментов. (D) в пробирке
ангиогенез анализа. образование пробки из HUVEC значительно снизилась с 50 мкМ индометацина. Пантопразол компенсацией индометацином индуцированных дефектный ангиогенез, как оценивали с процентом формирования трубки, в то время как ингибитор HO-1 отменен эти преодоления пантопразола-индуцированный ангиогенез. Эти цифры являются представителями результатов, полученных в 3-х независимых экспериментов.
Пантопразол-индуцированную HO-1 ослабленный индометацином связанный воспалительный нападение
Хотя индометацин является противовоспалительным средством, оно было известно, что НПВС индуцированное повреждение желудка через повышенные выражения медиаторов воспаления, включая TNF-alpha, IL-1, IL-8, и NADPH-оксидаза-1 (NOX-1). Как показано на рисунке 4A, 500 мкМ индометацина значительно увеличили выразительности TNF-alpha, IL-1 и IL-8 в желудочных эпителиальных клеток, в то время как оно уменьшало экспрессию HO-1, подтверждая, что посредники при воспалении, могут быть механистически связан с индометацин-индуцированной эпители желудка повреждения клеток. В этом состоянии, совместное введение 500 мкМ индометацин и 300 мкМ пантопразола значительно уменьшил проявления TNF-alpha, IL-1 и IL-8 в сопровождении со статистически значимыми повышений HO-1 выражение. Кроме того, индометацин задача значительно увеличили выражения NOX-1, в котором пантопразол значительно ослабило повышенную экспрессию NOX-1, предполагая, что пантопразол-индуцированное HO-1, налагаемые противовоспалительными действия под индометацин. Далее, для того, чтобы в дальнейшем доказать, являются ли эти значения затухания медиаторов воспаления после пантопразола являются результатом HO-1 индукции, мы повторили эти опыты с администрацией ZnPPIX. Как видно на рисунке 4B, совместное лечение ZnPPIX в присутствии пантопразола значительно отменили преимущества противовоспалительного действия. Приростные индукций ICAM-1 и VCAM после индометацин лечения были ответственны за ишемией и отягчающих органа повреждений, в которых занимаются либо сосудистое воспаление или повышенное скопление лейкоцитов. Лечение индометацином значительно увеличило выражения ICAM-1 и VCAM в HUVEC, но со-вызов индометацин и пантопразола значительно уменьшились индометацин-индуцированной ICAM-1 экспрессию, имеющую отношение к увеличению индукции HO-1 (рис 4С). В этом состоянии, ZnPPIX не накладывали ослабление ICAM или VCAM, несмотря на лечение пантопразола, дополнительно обеспечивая действие бенефициаром пантопразола, связанного с HO-1 индукции. Рисунок 4 пантопразол ослабляется индометацином индуцированных медиаторов воспаления через HO-1. (А) ОТ-ПЦР для TNF-alpha, IL-1, IL-8, и HO-1. 500 мкМ индометацина усиливает экспрессию медиаторов воспаления, включая TNF-alpha, IL-1, IL-8, но значительно снизилась HO-1 экспрессию. NOX-1 был значительно увеличен с индометацином. Эти цифры являются представителями результатов, полученных в 3-х независимых экспериментов. (B) Pantoprazole значительно снизилась индометацин-индуцированной IL-1 и TNF-alpha, но эти действия бенефициарными пантопразола были отменены с ZnPPIX, что приводит к выводу, что противовоспалительные действия пантопразола были вследствие HO-1 индукции. Эти цифры являются представителями результатов, полученных в 3-х независимых экспериментов. (C) Pantoprazole значительно снизилась индометацин-индуцированной ICAM-1 и VCAM в клетках HUVEC, но эти действия бенефициарными пантопразола также были отменены с ZnPPIX в качестве ингибитора HO-1. Эти цифры являются представителями результатов, полученных в 3 независимых экспериментах.
Pantoprazole-индуцированный HO-1 ослабленные индометацин-индуцированной травмы желудка
Чтобы исследовать защитный эффект пантопразола в естественных условиях
, индометацин (10 мг /кг ) вводили внутрибрюшинно в течение 16 ч у крыс. Лечение с индометацином значительно спровоцированы слизистой оболочки желудка травмы, включая геморрагических эрозий и изъязвлений. Тем не менее, эти желудочные патологии, спровоцированные с индометацином были значительно ослаблены с внутрибрюшинным введением 30 мг /кг пантопразола (фиг.5А). Поскольку эти защитные эффекты 30 мг /кг пантопразола против индометацином индуцированных повреждений желудка были значительно отменены при совместном лечении внутрибрюшинном введении 5 мг /кг ZnPPIX, мы подтвердили, что защитное действие пантопразола было основано на его способности HO-1 индукционная , Когда выражения HO-1 и ICAM-1, были измерены в слизистой оболочке гомогенатах из каждой группы, индометацин администрация значительно уменьшила выражения HO-1 и повышал экспрессию ICAM-1. Тем не менее, из-за роста выражений HO-1 после пантопразола, а также значительно ослабленными уровни ICAM-1, индометацин-индуцированное повреждение желудка было пропорционально улучшилось, несмотря на индометацин вызов (Фиг.5В). Чтобы продемонстрировать, как пантопразол улучшила дефектный ангиогенез и ишемию, спровоцированную индометацин, EMSA с помощью HIF-1α была выполнена (5С). HIF-1α-ДНК связывающая активность была существенно увеличена в группе только индометацин, которая была значительно уменьшилась в желудочном гомогенатах пантопразола группы лечения, означающий пантопразола значительно облегчал гипоксического состояния, вызванное индометацином. Взятые вместе, ИЦП оказывали сильную защиту от индометацин-индуцированного повреждения желудка слизистой оболочки через значительные HO-1 индукции, которое выходит за пределы действия подлинной подавляющих кислоты, хотя мы не измеряли изменения кислотности желудочного сока. Рисунок 5 пантопразол мешает индометацин-индуцированное повреждение желудка через в зависимости от индукции HO-1. (А) Средний индекс индометацин-индуцированной повреждений желудка. (Б) ОТ-ПЦР для HO-1 и ICAM-1 в соответствии с группой. (С) EMSA для HIF-1 в соответствии с группой. Индометацин значительно увеличилась HIF-1-ДНК связывания, в то время как пантопразол значительно уменьшилось связывание в зависимости от дозы HIF-1-ДНК.
Обсуждение
Перед текущего расследования, некоторые исследователи опубликовали, что ИЦП может предотвратить желудка травмы слизистой оболочки другими механизмами за пределами действия его специфического ингибирования кислоты [11, 14, 25-28], мы могли бы добавить больше доказательств относительно защитного действия ИПН против НПВС. Пантопразол существенно индуцирует экспрессию HO-1 через активацию Nrf2, имеющей отношение к противовоспалительным, антиоксидантным и ишемией освободив действий. Роман находка этого исследования отличается от других исследований, является то, что пантопразол показывает защитные действия к НПВС-индуцированные повреждения либо через коррекцию ангиогенном гандикапа или ослабление воспаления предрасположенности.
Becker JC и др.
[16] было показано, что оба омепразол и лансопразол защищены эпителия желудка и эндотелиальные клетки человека от окислительного стресса, аналогичного нашему исследованию, но использовали различные виды ИПН. Так как этот эффект был аннулирован в присутствии ингибитора HO-1, ZnPPIX, HO-1, как представляется, право мишенью ИПН в эндотелиальных и эпителиальных клеток желудка. В данном исследовании мы наблюдали нетронутые новый вывод о том, что HO-1, индуцированный ИЦП пониженную НПВС несением воспаление и кровеносных сосудов психоз. Все авторы читали и одобрили окончательный вариант рукописи.

• Вирус Эпштейна-Барр, связанный карциномы желудка: отчет из Ирана в течение последних четырех десятилетий
• Ассоциация между RUNX3 метилирования промотора и рака желудка: мета-анализ