En mulig involvering av Nrf2-mediert heme oksygenase-1 oppregulering i beskyttende effekt av protonpumpeinhibitoren pantoprazol mot indometacin-indusert gastrisk skade i rats

En mulig involvering av Nrf2-mediert heme oksygenase-1 oppregulering i beskyttende effekt av protonpumpeinhibitor pantoprazol mot indometacin-indusert gastrisk skade hos rotter
Abstract
Bakgrunn
proton pumpe er en integrert membranprotein som er allestedsnærværende ATP-bindende kassett (ABC) involvert i mange transportprosesser i alle levende organismer, blandt som en spesialisert form for pumpe, såkalte p
-type proton pump, eksisterer i parietalcellene av magen. Selv om protonpumpehemmere (PPI) er ofte foreskrevet for å hindre ikke-steroide antiinflammatoriske midler (NSAIDs) indusert gastrisk skade, gjør de sure undertrykkende handlinger ikke nok til å forklare.
Metoder
For å dokumentere effektene av pantoprazol , en av PPIer, på NSAID-indusert gastrisk skade, in vitro og in vivo

studier ble utført. Immunocytokjemi, Western blot-analyse, elektroforetisk mobilitet skift analyse og RT-PCR ble utført for å evaluere induksjon av heme oksygenase-1 (HO-1) gjennom Nrf2 aktivering i normale mageslimhinne RGM-1-celler eller in vivo
mage vev fra rotter som ble behandlet med indometacin og /eller pantoprazol. Search Results
pantoprazol aktivert Nrf2 gjennom inaktivering av Keap1, hvoretter ekspresjon av HO-1 ble betydelig øket på en doseavhengig måte i RGM-1-celler. Økt ARE-DNA-bindende aktivitet ble observert ved maksimalt 1 time med 300 uM av pantoprazol. Ekspresjonen av HO-1 indusert med pantoprazol var signifikant assosiert med øket in vitro
rør formasjon (P
< 0,05) og angiogene faktorer, inkludert VEGF, bFGF, og HIF-1α. Indometacin markant økt uttrykk av TNF-α, IL-1ss, IL-8, NOX-1, ICAM-1 og VCAM, mens pantoprazol betydelig redusert uttrykk av indometacin-induserte disse inflammatoriske mediatorer i samsvar med pantoprazol-indusert HO-1 (P
< 0,05) som dokumentert med HO-1 hemmer. In vivo
modell av indometacin-indusert gastrisk skade kunne bekrefte in vitro
-drawn resultat som pantoprazol bemerkelsesverdig beskyttet mot indometacin-indusert gastrisk skade, hvori sink protoporfyrin (5 mg /kg, ip
) i betydelig grad opphevet den beskyttende effekt av pantoprazol.
Konklusjon
Disse resultater viser at Nrf2-mediert HO-en induksjon av PPIer ga en betydelig beskyttende effekt mot NSAID-indusert gastrisk skade utover syre suppressive handlinger.
nøkkelord
Heme oxygenase-en protonpumpehemmer NSAIDs-indusert gastropathy Nrf2 Bakgrunn
NSAIDs har store reseptbelagte volumer for det meste basert på følgende to fordeler, er en en økning av eldre pasienter som nødvendig NSAIDs resept for å lindre degenerativ forandring utløst smerte og den andre er en ekstra prøvelse for enten forebygging av kolon polypper eller flukt fra iskemisk hjerte- og karsykdommer [1, 2]. Imidlertid er det store bruk av NSAID begrenset av plagsomme ugunstige effekter slik som gastrisk erosjon /ulcer, blødning fra komplisert sår, og mer alvorlige komplikasjoner som oppstår på tynntarmen og tykktarmen. Siden den farmakologiske virkningen av NSAIDs er gjennom hemming av prostaglandin (PG) syntese via undertrykkelse av cyklo (COX) [3], indiscernible reduksjon av magesekk prostaglandin E 2 (PGE 2) er ansvarlig for disse gastrointestinal (GI) bivirkninger. Selv om oppfinnelsen av selektive COX-2-inhibitor, coxib, for å garantere sikkerhet GI er blitt foreslått som den løse strategi, må denne løsning også for å forbedre. Selv om NSAIDs brukes som potente anti-sår narkotika, de ytterligere avdekket mekanismer for NSAID toksisitet [4, 5] leder oss til å utvikle mer potente og sikrere midler.
I det nåværende tidspunkt, er det beste valget for å forebygge NSAID-relaterte GI toksisitet er enten kombinasjonen av NSAIDs og protonpumpehemmere (PPI) eller valg av coxibs [6, 7]. Siden den helbredende frekvensen av GI sår ved kontinuerlig bruk av NSAIDs var større i PPIs gruppe enn 2 reseptor antagonist (H2-RA) gruppe histamin type, PPIs ha blitt foretrukket enn H2-RA til å takle den negative effekten av NSAIDs [8, 9 ]. I tillegg til de grunnleggende syre suppressive virkninger av PPIer flere funksjoner er blitt avslørt som er reduksjon av pro-apoptotiske signalering, syreuavhengig restaurering av prolifererende og reparasjon av veier [10], en reduksjon i slimhinne oksidativ skade, helbredelse fremmende virkning, og endoplasmatiske retikulum stress lindrende mekanisme [11-16]. Hahm et al.
[17-19] Det er også rapportert at PPIs vise potensielle aktiviteter som kreftbehandling basert på selektiv induksjon av apoptose, anti-angiogenese mot Helicobacter pylori
-associated kreftutvikling, og direkte anti-mutagene handlinger under tumorigenesis. Men de mekanismene som er ansvarlige for de beskyttende virkninger av PPIer i NSAID-indusert gastrisk skade gjenstår å bli bestemt.
Heme oksygenase-1 (HO-1), en induserbar for den første og hastighetsbegrensende enzym i heme nedbrytning, har vært kjent for å beskytte mot cytotoksisiteten av oksidativt stress og apoptotisk celledød, så vel som inflammatorisk tilstand [20, 21]. Grunnleggende beskyttende effekter av HO-1 mot inflammasjon formidles via anti-oksidativ heme nedbrytning, men også i forbindelse med produksjonen av de anti-inflammatoriske mediatorer, hvor redoks avhengig transkripsjonen aktivator, NF-E2-relatert faktor to (Nrf2), og sin fosforylering /aktivisering, og oksidasjon av Kelch lignende ECH-assosiere protein 1 (Keap1) er mekanistisk slått [22-24]. Siden ekspresjonen av HO-1 har blitt indusert ved anti-oksidativ, anti-inflammatorisk, og ischemiske lindre responser, i denne studien, hypotese vi at de beskyttende effekter av PPIer mot NSAID-indusert gastrisk skade kan være relatert til HO-1 og påfølgende angiogenese utover medfødt syre undertrykkelse. Til sammen våre resultater viser de nye mekanismene som PPIs induserer ekspresjon av HO-1 gjennom aktivering Nrf2 /inaktivere Keap1 akkompagnert med avlønning av iskemisk endring og demping av inflammatoriske mediatorer, og dermed tilrettelegge for beskyttelse mot indometacin gastrisk skade.
metoder
Materialer og cellekulturer
Indometacin ble kjøpt fra Sigma Aldrich (Saint Louis, MO) og pantoprazol ble gitt fra Amore Pacific Pharmaceutical Co. (Seoul, Korea). Antistoffer for β-aktin, HO-1, α-tubulin, Keap1, Nrf2 og VEGF ble alle oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Normal rotte gastrisk slimhinne RGM-1-celler ble levert av Prof. Hirofumi Matsui, MD, PhD (Tsukuba Univ., Japan), ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) inneholdende 10% (v
/v
) føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin. Menneske navle vaskulære endotelceller (HUVECs) ble dyrket i M199 medium (InnoPharma Screen, Seoul, Korea). Celler ble opprettholdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO 2. Passende mengder av RGM-1-celler eller HUVECs ble podet og inkubert i 24 timer, deretter ble de behandlet med den angitte dose av pantoprazol eller indometacin og inkubert i de angitte tidsrom. HUVECs ble flyttet til 1% O 2 og 5% CO 2 hypoksi kammeret og inkubert i 0-12 timer for in vitro
rør dannelsesbestemmelsen.
Med elektronspinnresonans (ESR) spektroskopi og ROS generasjon måling
Forskjellige konsentrasjoner av pantoprazol tilsatt til et totalt volum på 200 ul inneholdende 0,05 mM FeSO 4, 1 mM H 2o 2, 1 mM 5,5-dimethylpyrroline-N-oksid (DMPO, Sigma Aldrich, St. Louis, MO), og 50 mM natriumfosfat ved pH 7,4 ved romtemperatur. Reaksjonene ble initiert ved å legge H 2o 2. Etter inkubering i 1 minutt, ble aliquoter av reaksjonene overført til en kvarts-celle og spekteret av DMPO-OH ble undersøkt ved bruk av en ESR spektrofotometer (JES-TE300, JEOL, Tokyo, Japan) under de følgende betingelser: magnetfelt, 338,0 ± 5.0 mT; mikrobølgeeffekt, 4,95 mW; frekvens, 9.421700 GHz; modulasjon amplitude, 5 mT; feie tid, 0,5 min; og tidskonstanten, 0,03 s. Cellular ROS Innholdet ble målt ved å inkubere kontroll eller pantoprazol behandlet RGM-1-celler med 10 pM H 2DCF-DA (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) i 30 min. Fluorescens ble målt ved anvendelse av en konfokal laser-mikroskop (LSM710, Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland).
Western blot-analyse
Behandlede celler ble vasket to ganger med PBS og deretter lysert i iskald cellelyseringsbuffer (Cell Signaling Technology) inneholdende 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF, Sigma Aldrich). Proteiner i lysatet ble separert ved SDS-PAGE og overført til polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner, som ble inkubert med primære antistoffer, vasket, inkubert med peroksidase-konjugert sekundært antistoff, ettervaskes og deretter visualisert ved hjelp av en forsterket kjemiluminescens (ECL) system ( GE Healthcare, Buckinghamshire, UK).
Elektro mobilitet gel shift-analyse (EMSA)
Kjerne- og cytoplasmatiske fraksjoner ble hentet ved hjelp av NE-PER Kjerne- og cytoplasmatiske reagenser (Pierce, Rockford, IL), i henhold til produsentens instruksjoner. Antioksydant responselement (ER) oligonukleotidprobe, 5'-TTT TCT GCT GAG TCA AGG TCC G-3 ', og HIF-1α oligonukleotidprobe, 5'-TCT GTA CGT GAC CAC ACT CAC CTC-3', ble merket med [ ,,,0],γ- 32P] ATP ved hjelp av T4 polynukleotidkinase (Promega, Madison, WI) og atskilt fra unincorporated [γ- 32P] ATP ved gelfiltrering bruke en nick spin kolonne (GE Healthcare). Før tilsetning av 32P-oligonukleotid (1x10 5 cpm), 10 ug av kjerneekstrakt ble holdt på is i 15 minutter i gel-skift bindingsbuffer. For å bestemme sekvensen spesifisiteten av NF-kB-DNA interaksjon, tilsatte vi et overskudd av umerkede oligonukleotider. Etter 20 min inkubering ved romtemperatur ble 2 ul av 0,1% bromfenolblått tilsatt, og prøvene ble underkastet elektroforese gjennom 6% ikke-denaturerende PAGE ved 150 V i et kaldt rom. Til slutt, geler ble tørket og eksponert for røntgenfilm (Kodak, Rochester, NY).
Immunocytochemistry
behandlede celler i kammers objektglass ble fiksert med 3,7% formaldehyd i 15 minutter. Etter vasking ble cellene blokkert i 5% BSA-oppløsning inneholdende 0,1% Triton X-100 i PBS i 1 time ved romtemperatur, og deretter inkubert med primært antistoff (1: 100) i 12 timer ved 4 ° C. Cellene ble deretter vasket 3 ganger, inkubert med sekundært antistoff (1: 300) i 1 time, og deretter med 4'-6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, 100 ng /ml) i 1 min ved romtemperatur. Etter vask 3 ganger, ble cellene montert med Forleng Gold antifade reagens (Invitrogen Livet Technologies, Carlsbad, California). Fluorescens ble visualisert under en konfokal laser-mikroskop (LSM710, Carl Zeiss).
RNA isolering og kvantitativ revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon (QRT-PCR)
Etter behandlingen ble mediet fjernet ved sug og cellene ble vasket med Dulbeccos fosfat -buffered saltløsning (DPBS) to ganger. RiboEX (Gene Alle, Seoul, Korea) ble satt til plater, som deretter ble inkubert i 10 minutter ved 4 ° C. RiboEX ble høstet og plassert i et 1,5 ml rør, og kloroform ble tilsatt og forsiktig blandet. Etter inkubering i 10 minutter på is, ble prøvene sentrifugert ved 10.000 x g i 30 min. Supernatanter ble ekstrahert og blandet med isopropanol, og blandingene ble inkubert ved 4 ° C i 1 time. Etter sentrifugering ved 13.000 g
i 30 minutter, ble pelleten vasket med 70% (v
/volum
) etanol. Etter at etanol for å fordampe fullstendig, ble pellets oppløst i dietylenglykol pyrocarbonate (DEPC) -behandlet vann (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). cDNA ble fremstilt ved bruk av revers transkriptase avledet fra murin leukemivirus Maloney (Promega, Madison, WI) i henhold til produsentens instruksjoner. PCR ble utført over 30 sykluser: 94 ° C i 20 sekunder, 58 ° C i 30 sek, og 72 ° C i 45 sek. Oligonukleotid primere for PCR (tabell 1) ble kjøpt fra Bioneer (Daejeon, Korea). Alle QRT-PCR eksperimenter ble gjentatt tre ganger og kvantifisering ble vist i gjennomsnitt ± SD.Table en Sekvensen av PCR-primere
GAPDH
Forward 5'-GGT GCT GAG TAT GTC GTG GA -3 '
Omvendt 5'-TTC AGC TCT GGG ATG ACC TT-3 '
HO-1
Forward 5'-GAG AGC ATG TCC CAG GAT TT-3'
Omvendt 5'-GGT TCT GCT TGT TTC GCT CT -3 '
COX-2
Forward 5'-GAA ATG GCT GCA GAG TTG AA -3'
Omvendt 5'-TCA TCT AGT CTG GAG TGG GA -3 '
HIF-1α
Videre 5'-AAC AAA CAG AAT CTG TCC TC-3 '
Omvendt 5'-GGT AAT GGA GAC ATT GCC AG-3'
VEGF
Forward 5'-CAA TGA TGA AGC CCT GGA GT-3 '
Omvendt 5'-GAT TTC TTG CGC TTT CGT TT -3'
PDGF
Forward 5'-AGG AAG CCA TTC CCG CAG TT-3 '
Omvendt 5'-CTA ACC TCA CCT GGA CCT CT -3 '
bFGF
Forward 5'-TAT GAA GGA AGA TGG ACG GC-3'
Omvendt 5'-AAC AGT ATG GCC TTC TGT CC -3 '
IL-1β
Forward 5'-CAT TGT GGC TGT GGA GAA G-3 '
Omvendt 5'-ATC ATC CCA CGA GTC ACA GA -3'
IL-8
Forward 5' CAG ACA GTG GCA GGG ATT CA-3 '
Omvendt 5'-TTG GGG ACA CCC TTT AGC AT-3'
TNF-α
Forward 5'-TAC TGA ACT TCG GGG TGA TT -3 '
Omvendt 5'-CAG CCT TCT CCC TTG AAG AG-3 '
ICAM-1
Forward 5'-TGT GCT TTG AGA ACT GTG GC-3'
Omvendt 5'-GGT TCT GTC CAA CTT CTC AG -3 '
VCAM-1
Forward 5'-GAG ACA AAA CAG AAG TGG AAT-3'
Omvendt 5'-TAC AAG TGG TCC ACT TAT TTC -3 '
NOX1
Forward 5'-GAG AAA TTC TCG GAA CTG CC-3 '
Omvendt 5'-TGT TGG CTT CTA CTG Tags CG -3'
In vitro
angiogenese analysen
Denne analysen ble utført ved hjelp av et kommersielt kit i henhold til produsentens instruksjoner (Millipore, Billerica, MA). For hypoksiske betingelser, ECMatrix og fortynningsmiddel-buffer ble blandet for å lage en fast gel, som deretter ble sådd ut i 96 brønners mikroplater. Humane umbilikalvene endotelceller (HUVEC, 1,0 x 10 5 /ml) ble sådd med kontroll, Indomethacin, indometacin pluss pantoprazol, indometacin pluss pantoprazol pluss ZnPPIX inkubert ved 37 ° C i 4 timer. Tube dannelse ble observert under et lysmikroskop.
Indometacin gastrisk skademodell
Totalt 48 rotter ble kjøpt fra Charles River (Osaka, Japan). Dyrene ble håndtert på en akkreditert dyr anlegg i henhold til Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC International) retningslinjer under anlegget heter CACU (The Center of Animal Care og bruk) av Lee Gil Ya kreft og diabetes Institute, Gachon Universitetet etter Institutional Etikk Review Board godkjenning. Dyrene ble delt inn i fire grupper som hver består av 12 rotter og ble sultet i 24 timer før eksperimenteringen som følger; Alle rotter ble administrert med intraperitoneal injeksjon av indometacin (10 mg /kg) for å provosere gastriske skader, andre gruppe med intraperitoneal injeksjon av 10 mg /kg av pantoprazol, den tredje gruppe med intraperitoneal injeksjon av 30 mg /kg av pantoprazol, og den fjerde gruppe med intraperitoneal injeksjon av 30 mg /kg av pantoprazol og 5 mg /kg av ZnPPIX å inhibere aktiviteten av HO-1. Dyrene ble avlivet 16 timer etter hver administrasjon. Magen på rotter ble fjernet og åpnet langs den store kurvatur, og deretter vasket med iskald fosfatbufret løsninger. Antallet enten erosjoner eller sår ble bestemt under det forstørrede fotografier. Homogenater oppnådd fra skrapet mageslimhinnen ble oppbevart i flytende nitrogen tank inntil analysen.
Statistisk analyse
Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Dataene ble analysert ved en-veis ANOVA, og den statistiske signifikans mellom gruppene ble bestemt av Duncans multiple range test. Statistisk signifikans ble akseptert på P
< 0.05.
Resultater
pantoprazol økt HO-1 uttrykk gjennom Nrf2 aktivering
Basert på foreløpige studien, har vi funnet pantoprazol viste den høyeste induksjon av HO-1 uttrykk i RGM-1 celler blant PPIs, lansoprazol, rabeprazol , omeprazol, pantoprazol og (data ikke vist). Pantoprazol øket ekspresjon av HO-1 mRNA og protein på en doseavhengig måte (figur 1A) og immuncytokjemisk analyse avslørte også at nivået av HO-1 ble signifikant øket ved pantoprazol behandling i cytoplasma av RGM-1-celler på en dose -avhengig måte (figur 1B). For å forstå mekanismene bak oppregulering av HO-1 uttrykk av pantoprazol, undersøkte vi dens virkninger på aktivering av Nrf2, en stor transkripsjon faktor som formidler ARE /EpRE drevet uttrykk for antioksidant enzymer. Når vi målte ekspresjonsnivået av keap1, en repressor av Nrf2 i cytoplasmiske fraksjon ble behandlet med 300 uM pantoprazol i et annet tidspunkt, betydelig redusert ekspresjon av Keap1 ble observert i 1 time (figur 2A), noe som tyder på at HO-1 kan bli transkribert etter pantoprazol behandling gjennom Nrf2 aktivering og Keap1 inaktivering. Som illustrert i figur 2A, Nrf2 atom co-lokalisering var tydelig i RGM-1-celler behandlet med pantoprazol. Den maksimale ER-bindingsaktiviteten Nrf2 ble øket i 1 time, så vel som dens nukleære lokaliserings indusert av pantoprazol (figur 2B). For å finne den kjernefysiske opphopning av Nrf2, gjennomførte vi en immunocytokjemisk analyse ved hjelp av anti-Nrf2 antistoff. Som vist i figur 2C, ble Nrf2 translokert til kjernen med 300 pM pantoprazol behandling. Disse resultatene konsekvent antydet at pantoprazol kan øke HO-1-nivå gjennom transcriptional aktivering av Nrf2 i rotte mage epitelceller. Figur 1 Pantoprazol indusert ekspresjon av HO-1. (A) RT-PCR og Western blot for HO-1-ekspresjonen i henhold til forskjellig dosering av pantoprazol, 30, 100, uM og 300, respektivt. Disse tallene er representanter for de resultater som ble oppnådd i 3 uavhengige eksperimenter. (B) Confocal avbildning av HO-1. Pantoprazol øket ekspresjon av HO-1 på en doseavhengig måte i normal rottemageslimhinne RGM-1-celler.
Figur 2 pantoprazol øket Nrf2 nukleær translokasjon og cytoplasmisk keap1 inaktivering, førte til signifikant anti-oksidasjon. (A) Western blot for enten cytosoliske eller kjerne Keap1 Nrf2 på et annet tidspunkt i nærvær av 300 pM pantoprazol. (B) Elektro mobilitet shift-analyse (EMSA) for ARE-DNA bindingsaktivitet. Betydelig økt DNA-binding av Nrf2 ble notert 60 min etter pantoprazol administrasjon. (C) Confocal avbildning av Nrf2 etter forskjellig dosering av pantoprazol, 100 uM og 300 uM. (D) elektronspinn resonans (ESR) måling for Fenton reaksjon generert hydroksyl radikaler. (E) De forandringer av DCF-DA fluorescens etter forskjellig dosering av pantoprazol, 30, 100, og 300 uM. Pantoprazol sunket betraktelig H2O2-indusert oksidativ fluorescens.
Siden den biologiske betydningen av HO-1 pantoprazol besitter en anti-oksidativ handling knyttet til HO-en induksjon. ESR måling var ultimate måten å spore frie radikaler generasjon bruker spinn addukt, som vi genererte hydroksylradikaler bruker DMPO som en adductor henhold Fenton reaksjon. Som vist i figur 2D, 3 mM pantoprazol som utøves klar fangende virkning av DMPO-addukt-genererende hydroksylradikaler. Ettersom ESR måling ble utført i kjemisk reaksjon tilstand ikke biologisk system, og pantoprazol er ikke en profesjonell antioksidant, det absolutt bidratt til å nøytralisere hydroksylradikaler, selv om det er forholdsvis høy konsentrasjon av pantoprazol for å nøytralisere oksygenradikaler. Disse kjemiske Resultatene fra undersøkelsen ESR ble ytterligere bekreftet med biologisk test ved hjelp av DCF-DA fluorescens-måling, som viser at pantoprazol viste signifikant DCF-DA reduksjon på en doseavhengig måte (P
< 0,05, figur 2E).
angiogene handlinger påfølgende til pantoprazolinduserte HO-1
PPIs økte uttrykk for VEGF mRNA og protein i RGM-1 celler (figur 3A). For å dokumentere om den trinnvise induksjon av VEGF med PPIer er relatert til HO-1-induksjon, vi gjentatt eksperimenter med PPI alene eller samtidig behandling av pantoprazol og sink protoporfyrin (ZnPPIX) som HO-1-inhibitor. Som resultat kunne bekrefte ekspresjonen av VEGF-indusert av pantoprazol og inkrementell samtidig behandling av ZnPPIX tydelig redusert ekspresjon av PPI-indusert VEGF på en doseavhengig måte (figur 3B). Deretter undersøkte vi endringer av representative angiogene faktorer, bFGF, PDGF, og HIF-1α og observert disse uttrykkene som er relevante for pantoprazol-indusert HO-1 i figur 3C. Som forventet, pantoprazol økt betydelig disse uttrykkene for flere angiogene faktorer. Også disse induksjoner av bFGF og PDGF ble betydelig svekket med co-behandling av pantoprazol og ZnPPIX. For å verifisere hvorvidt disse induksjoner av angiogen faktor etter pantoprazol faktisk var relatert til angiogenese, in vitro
angiogenese-analysen ble utført (figur 3D). Tube formasjon ble betydelig svekket med 500 mikrometer indometacin i HUVECs, mens 100 mikrometer pantoprazol kan overvinne disse derangements av angiogenese behandlet med indometacin. Men tilleggsbehandling med ZnPPIX avskaffet disse fordelene overvinne angiogenese ved pantoprazol henhold indometacin administrasjon. Disse resultatene tyder på at pantoprazol kompensert NSAIDs-indusert defekt angiogenese gjennom sin HO-1 induksjon evne. Figur 3 pantoprazol indusert angiogene faktorer knyttet til HO-en induksjon. (A) RT-PCR og Western blot for VEGF. Betydelige induksjoner av VEGF ble observert med pantoprazol, betydelig etter 300 mikrometer pantoprazol (p < 0,05
). Disse tallene er representanter for de resultater som ble oppnådd i 3 uavhengige eksperimenter. (B) Endringene av VEGF og HO-en med pantoprazol alene eller kombinasjon av pantoprazol og ZnPPIX. Induksjon av VEGF etter pantoprazol ble betydelig svekket med HO-1-hemmer, som betegner implikasjonen av HO-1 i PPI-indusert VEGF. Disse tallene er representanter for de resultater som ble oppnådd i 3 uavhengige eksperimenter. (C) Andre angiogene faktorer knyttet til pantoprazol. bFGF og VEGF ble stadig uttrykt med pantoprazol, men disse inductions ble svekket med HO-1 hemmer. Disse tallene er representanter for de resultater som ble oppnådd i 3 uavhengige eksperimenter. (D) in vitro
angiogenese analysen. Tube dannelsen av HUVEC ble signifikant redusert med 50 mikrometer indometacin. Pantoprazol kompensert indometacin-indusert defekt angiogenese som vurderes med prosentandelen av røret formasjonen, mens HO-1 inhibitor kansellert disse vinne av pantoprazol-indusert angiogenese. Disse tallene er representanter for de resultater som ble oppnådd i 3 uavhengige eksperimenter.
Pantoprazol-indusert HO-1 svekkede indomethacin-assosiert inflammatorisk automat
Selv om indomethacin er et anti-inflammatorisk middel, har det vært kjent at NSAID-indusert gastrisk skade igjennom økt uttrykk for inflammatoriske mediatorer, inkludert TNF-α, IL-1β, IL-8, og NADPH oksidase-1 (NOX-1). Som vist i figur 4A, 500 uM indometacin økte signifikant uttrykk for TNF-α, IL-1β, og IL-8 i gastriske epitel-celler, mens den reduserte ekspresjon av HO-1, som bekrefter at inflammatoriske mediatorer kan være mechanistically tilknyttet indometacin-indusert gastrisk epitelial celleskade. I denne tilstanden, samtidig administrering av 500 mikrometer indometacin og 300 mikrometer pantoprazol betydelig redusert uttrykk av TNF-α, IL-1β og IL-8 akkompagnert med statistisk signifikant økning av HO-1 uttrykk. I tillegg, indometacin utfordring økte signifikant uttrykk for NOX-1, hvori pantoprazol vesentlig svekkede den økte ekspresjon av NOX-1, noe som tyder på at pantoprazolinduserte HO-1 pålagte anti-inflammatorisk handlinger i henhold til indometacin. Deretter For ytterligere å påvise hvorvidt disse dempninger av inflammatoriske mediatorer etter pantoprazol er et resultat av HO-1-induksjon, vi gjentok disse forsøk med ZnPPIX administrasjon. Som vist i figur 4B, ko-behandling av ZnPPIX i nærvær av pantoprazol i betydelig grad opphevet fordelene med anti-inflammatorisk virkning. De inkrementelle induksjoner av ICAM-1 og VCAM etter indometacin behandling var ansvarlige for iskemi og grovt organskader, der enten vaskulær inflammasjon eller økt leukocytter aggregering ble engasjert. Behandling med indometacin økte signifikant uttrykk for ICAM-1 og VCAM på HUVEC, men ko-utfordring av indometacin og pantoprazol signifikant redusert indometacin-indusert ICAM-1-ekspresjon som er relevante for økt induksjon av HO-1 (figur 4C). I denne tilstanden, gjorde ZnPPIX ikke pålegge demping av ICAM eller VCAM på tross av pantoprazol behandling, ytterligere sikre betalingsmottakeren handling av pantoprazol forbundet med HO-1 induksjon. Figur 4 pantoprazol dempes indometacin-induserte inflammatoriske mediatorer gjennom HO-1. (A) RT-PCR for TNF-α, IL-1β, IL-8, og HO-1. 500 uM indometacin økt ekspresjon av inflammatoriske mediatorer, inkludert TNF-α, IL-1β, IL-8, men signifikant redusert HO-1-ekspresjon. NOX-en ble betydelig økt med indometacin. Disse tallene er representanter for de resultater som ble oppnådd i 3 uavhengige eksperimenter. (B) Pantoprazol signifikant redusert indometacin-indusert IL-1β og TNF-α, men disse mottaker virkninger av pantoprazol ble opphevet med ZnPPIX, som fører til den konklusjon at anti-inflammatoriske virkninger av pantoprazol ble på grunn av HO-1-induksjon. Disse tallene er representanter for de resultater som ble oppnådd i 3 uavhengige eksperimenter. (C) Pantoprazole betydelig redusert indometacin-indusert ICAM-1 og VCAM i HUVEC celler, men disse mottaker handlingene til pantoprazol ble også avskaffet med ZnPPIX som HO-1 hemmer. Disse tallene er representanter for de resultatene som er oppnådd i 3 uavhengige eksperimenter.
Pantoprazolinduserte HO-en svekket indometacin gastrisk skade
å undersøke den beskyttende effekten av pantoprazol in vivo
, indometacin (10 mg /kg ) ble administrert intraperitonealt i 16 timer hos rotter. Behandling med indometacin betydelig provosert mageslimhinneskader inkludert hemoragisk erosjoner og sår. Men disse gastrisk patologi provosert med indometacin ble betydelig svekket med intraperitoneal injeksjon av 30 mg /kg pantoprazol (figur 5A). Siden disse beskyttende effekt av 30 mg /kg pantoprazol mot indometacin-induserte gastriske skader var signifikant opphevet med samtidig behandling av intraperitoneal administrert 5 mg /kg ZnPPIX vi bekreftet at den beskyttende virkning av pantoprazol var basert på dens evne til HO-1-induksjon . Når uttrykkene i HO-1 og ICAM-1 ble målt i slimhinne homogenater fra hver gruppe, indometacin administrering signifikant redusert uttrykk for HO-1 og øket ekspresjonen av ICAM-1. Imidlertid, på grunn av økte HO-1 uttrykk etter pantoprazol, så vel som vesentlig svekkede nivåer av ICAM-1, indometacin-indusert gastrisk skade ble proporsjonalt forbedret til tross for indomethacin utfordring (figur 5B). For å demonstrere hvordan pantoprazol forbedret defekt angiogenese og iskemi provosert av indometacin, EMSA hjelp HIF-1α ble utført (figur 5C). Den HIF-1α-DNA bindingsaktiviteten ble sterkt økt i indometacin alene gruppen, som var betydelig redusert i mage homogenates av pantoprazol behandlingsgruppen, som betegner pantoprazol betydelig lettet hypoksisk tilstand indusert av indometacin. Til sammen PPIs utøves sterk beskyttelse mot indometacin-indusert mage mucosal skade gjennom betydelig HO-en induksjon, som er utenfor autentisk syre undertrykkende handling, selv om vi ikke måle endringer av mage surhet. Figur 5 pantoprazol hindrer den indometacin-indusert gastrisk skade gjennom avhengig av induksjon av HO-1. (A) Gjennomsnittlig indeks av indometacin-indusert gastrisk skade. (B) RT-PCR for HO-1 og ICAM-1 ifølge gruppen. (C) EMSA for HIF-1α ifølge gruppen. Indometacin betydelig økt HIF-1α-DNA-binding, mens pantoprazol betydelig redusert HIF-1α-DNA binding på en doseavhengig måte.
Diskusjon
Før dagens etterforskning, har flere forskere publisert som PPIs kan hindre mage mucosal skade av andre mekanismer utover handlingen av sin spesielle syreinhibering [11, 14, 25-28], kan vi legge til flere bevis vedrørende beskyttende virkning av PPIs mot NSAIDs. Pantoprazol signifikant induserte ekspresjon av HO-en gjennom Nrf2 aktivering relevant for anti-inflammatorisk, anti-oksyderende, og iskemi stillende handlinger. Novel funn av denne studien forskjellig fra andre undersøkelser er at pantoprazol viser beskyttelses tiltak til NSAIDs-indusert skade gjennom enten korrigering av angiogene handicap eller demping av betennelse tilbøyelighet.
Becker JC et al.
[16] demonstrert at både omeprazol og lansoprazol beskyttet menneskelige mage epiteliale og endotelceller mot oksidativt stress lik vår studie, men brukes forskjellige typer PPIs. Etter denne effekten ble opphevet i nærvær av HO-1-inhibitor, ZnPPIX, virker HO-en for å være en rett mål av PPIer i både endotel- og gastrisk epitelceller. I denne studien ble det observert urørt nytt funn som HO-1 indusert av PPIs redusert NSAIDs-pådratt betennelse og angiogenic sinnsforvirring. Alle forfattere lese og godkjent den endelige manuskriptet.

• Epstein-Barr virus assosiert magekreft: en rapport fra Iran i løpet av de siste fire tiårene
• Sammenheng mellom RUNX3 promoter metylering og magekreft: en meta-analyse