Mahdollinen osallistuminen Nrf2-välitteinen hemioksigenaasi-1 up-asetuksen suojaava vaikutus protonipumpun estäjä pantopratsoli vastaan ​​indometasiinin aiheuttamaa mahalaukun vaurioita rats

mahdollinen osallistuminen Nrf2-välitteinen hemioksigenaasi-1 up-sääntelyn suojaavaa vaikutusta protonipumpun estäjä pantopratsoli vastaan ​​indometasiinin aiheuttamaa mahalaukun vaurioita rotilla
tiivistelmä
tausta
protonipumpun on kiinteä kalvo proteiini, joka on läsnä ATP: n sitoutuminen kasetti (ABC) mukana monissa liikenteen prosesseja kaikki elävät organismit, joukossa joka erikoistunut muoto pumppu, niin kutsuttu p
-tyyppinen protonipumpun, olemassa parietaalisoluihin vatsaan. Vaikka protonipumpun estäjät (PPI) määrätään usein estämään steroideihin kuulumattomien tulehduskipulääkkeiden (NSAID) aiheuttaman mahalaukun vaurioita, happo tukahduttava toimet eivät riitä selittämään. Tool Menetelmät
Tavoitteena dokumentoida vaikutukset pantopratsolin yksi PPI-lääkkeitä, on tulehduskipulääkkeiden aiheuttamaa mahalaukun vaurioita in vitro
ja in vivo
tutkittu. Immunosytokemia, Western blot-analyysi, elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän määrityksellä ja RT-PCR tehtiin arvioimaan induktion hemioksigenaasi-1 (HO-1) kautta Nrf2 aktivaation normaalilta mahan limakalvon RgM-1-soluja tai in vivo
mahan kudoksissa rotilla, jotka saivat indometasiinia, ja /tai pantopratsolia.
tulokset
pantopratsoli aktivoitu Nrf2 kautta inaktivaation Keap1, jonka jälkeen ilmentymistä HO-1 on merkittävästi lisääntynyt annoksesta riippuvalla tavalla RgM-1-soluissa. Lisääntynyt ARE-proteiinin DNA havaittiin maksimaalisesti 1 h 300 uM pantopratsolia. Ekspressio HO-1 indusoima pantopratsolin liittyi merkitsevästi lisääntynyt in vitro
putken muodostumiseen (P
< 0,05) ja angiogeenisten tekijöiden, mukaan lukien VEGF, bFGF, ja HIF-1α. Indomethacin selvästi lisäsi ilmaisuja TNF-α, IL-1SS, IL-8, NOX-1, ICAM-1 ja VCAM, kun taas pantopratsolin vähensi ilmaisuja indometasiinin aiheuttamaa nämä tulehduksen välittäjäaineiden sopusoinnussa pantopratsolin aiheuttamiin HO-1 (P
< 0,05) kuin dokumentoitu HO-1-estäjä. In vivo
malli indometasiinin aiheuttaman mahavaurion voi vahvistaa in vitro
-drawn tulokset pantopratsoli huomattavasti suojattu indometasiinin aiheuttamaa mahavauriota, jossa sinkkiprotoporfyriini (5 mg /kg, ip
) merkittävästi poistetaan suojaava pantopratsolin tehokkuutta.
Päätelmä
Nämä tulokset osoittavat, että Nrf2-välitteinen HO-1 induktio PPI saatiin merkittävä suojaava vaikutus tulehduskipulääkkeiden aiheuttamaa mahalaukun vaurioita jälkeen hapan ehkäisevästä toimia.
avainsanat
Heme oksigenaasi 1 protonipumpun estäjä tulehduskipulääkkeiden aiheuttama gastropathy Nrf2 Background
NSAID on valtava reseptiä määriä perustuu pääasiassa seuraaviin kahteen edut, yksi on kasvua vuotiaiden potilaiden edellyttää tulehduskipulääkkeiden reseptiä lievittää rappeuttavia muutoksia aiheuttama kipu ja toinen on ylimääräinen oikeudenkäynti joko ehkäisyyn paksusuolen polyypit tai paeta iskeemiseen sydän- ja verisuonitaudit [1, 2]. Kuitenkin suurin käyttö tulehduskipulääkkeiden rajoittavat hankala haitallisia vaikutuksia kuten mahan eroosio /haavauma, monimutkainen verenvuotoa haavaumat, ja enemmän vakavia komplikaatioita ilmenneistä ohutsuolen ja paksusuolen. Koska farmakologinen vaikutus NSAID on kautta prostaglandiini (PG) synteesin kautta tukahduttaminen syklo (COX) [3], huomaamaton pienenemistä gastroprotective prostaglandiini E 2 (PGE 2) on vastuussa näistä ruoansulatuskanavan (GI) haittavaikutuksia. Vaikka keksintöä on selektiivinen COX-2-estäjän, koksibien takaamiseksi GI turvallisuus on ehdotettu ratkaiseminen strategiaa, tämä ratkaisu on myös parannettava. Vaikka NSAID käytetään voimakkaita vatsahaavalääkkeet, lisäksi kattamaton mekanismit NSAID myrkyllisyys [4, 5] meidät kehittämään tehokkaampia ja turvallisempia aineita.
Hetkellä paras valinta estää tulehduskipulääkkeiden liittyvien GI myrkyllisyys on joko yhdistelmä tulehduskipulääkkeiden ja protonipumpun estäjät (PPI) tai valinta koksibit [6, 7]. Koska paranemista maha-suolikanavan haavaumat jatkuvassa tulehduskipulääkkeiden käyttö oli suurempi PPI-lääkkeiden ryhmässä kuin histamiini tyypin 2 reseptorin antagonisti (H2-RA) ryhmä, protonipumpun estäjiä ovat parempana kuin H2-RA selviytyäkseen haitallinen vaikutus tulehduskipulääkkeiden [8, 9 ]. Lisäksi olennainen happo tukahduttava toimia PPI, useita toimintoja on paljastunut, jotka ovat vähentäminen proapoptoottisten signalointi, happo-riippumaton palauttaminen lisääntyvien ja korjaamisesta reittejä [10], vähentämään limakalvon hapettumista, paranemista edistävä vaikutus, ja Endoplasmakalvosto jännitystenpoistohehkutus mekanismi [11-16]. Hahm ym.
[17-19] ovat myös ilmoittaneet, että PPI-lääkkeet aiheutuvat mahdolliset toimet syöpää terapeuttisina perustuu valikoivaan apoptoosi antiangiogeneettiset vastaan ​​helikobakteeri
-associated syövän synnyn, ja suora anti-mutageenisia toimet aikana tuumorigeneesin. Kuitenkin mekanismit vastaava suojavaikutus protonipumpun tulehduskipulääkkeiden aiheuttama mahalaukun vaurioita jäävät vielä.
Hemioksigenaasi-1 (HO-1), indusoituva ensimmäistä ja nopeutta rajoittava entsyymi hemin hajoamista, on ollut tunnettua suojaamaan sytotoksisuutta oksidatiivisen stressin ja apoptoottisen solukuoleman sekä tulehdustila [20, 21]. Fundamental suojaavia vaikutuksia HO-1 vastaan ​​tulehduksen välittyvät anti-oksidatiivisen hemin hajoamista, mutta liittyy myös tuotannon anti-inflammatoristen välittäjien, jonka redox-riippuvaisen transkription aktivaattori, NF-E2 liittyvä tekijä 2 (Nrf2), ja sen fosforylaatio /aktivointi ja hapettaminen Kelch kaltaisen ECH liittyvän proteiinin 1 (Keap1) on mekaanisesti ehdotti [22-24]. Koska ilmaus HO-1: n on indusoitu anti-oksidatiivisen, tulehdusta, ja iskeeminen nitystenpoistohehkutus vasteita, nykyisessä tutkimuksessa olemme arveltu, että suojaavia vaikutuksia protonipumpun estäjien vastaan ​​tulehduskipulääkkeiden aiheuttamaa mahalaukun vaurioita voivat liittyä HO-1 ja seurauksena angiogeneesi jälkeen synnynnäinen happo tukahduttaminen. Kaikkiaan tuloksemme osoittavat romaani mekanismeja, PPI-lääkkeet indusoida HO-1 aktivoimalla Nrf2 /inaktivoivat Keap1 kera palkkioista iskeemisen muutoksen ja vaimennus tulehduksellisten välittäjäaineiden, mikä helpottaa suojan indometasiinin aiheuttamaa mahalaukun vaurioita.
menetelmät
Materiaalit ja soluviljelmissä
indometasiinia ostettiin Sigma Aldrich (Saint Louis, MO) ja pantopratsolin tarjoamia Amore Tyynenmeren Pharmaceutical Co (Seoul, Korea). Vasta-aineet β-aktiini, HO-1, α-tubuliinin, Keap1, Nrf2: n ja VEGF saatiin kaikki Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Normaali rotan mahalaukun limakalvon RgM-1-solut toimitti professori Hirofumi Matsui, LKT (Tsukuba Univ., Japani), viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM), joka sisälsi 10% (v
/v
) naudan sikiön seerumia, 100 U /ml penisilliiniä. Ihmisen napanuoran verisuonten endoteelisolujen (HUVEC) viljeltiin M199 (InnoPharma Screen, Seoul, Korea). Soluja pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO 2. Sopivat määrät RGM-1-soluja tai HUVEC-ympättiin ja inkuboitiin 24 tunnin ajan, sitten niitä käsiteltiin osoitetulla annoksella pantopratsolin tai indometasiinin, ja niitä inkuboitiin osoitetut ajat. HUVEC siirrettiin 1% O 2 ja 5% CO 2 hypoksia kammioon ja inkuboitiin 0-12 h in vitro
putken muodostumiseen määrityksessä.
Electron spin resonanssi (ESR) spektroskopia ja ROS: n syntyminen mittaus
eri pitoisuuksia pantopratsolin lisättiin yhteensä 200 ui, joka sisälsi 0,05 mM FeSO 4, 1 mM H 2O 2, 1 mM 5,5-dimethylpyrroline-N-oksidi (DMPO, Sigma Aldrich, Saint Louis, MO), ja 50 mM natriumfosfaattia pH: ssa 7,4 huoneen lämpötilassa. Reaktiot aloitettiin lisäämällä H 2O 2. Kun oli inkuboitu 1 min, alikvootit reaktiot siirrettiin kvartsikennoon ja spektri DMPO-OH tutkittiin käyttäen ESR spektrofotometriä (JES-TE300, JEOL, Tokio, Japani) seuraavissa olosuhteissa: magneettikenttä, 338,0 ± 5.0 mT; mikroaaltoteholla, 4,95 mW; taajuus, 9.421700 GHz; modulaatio amplitudi, 5 mT; lakaista aikaa, 0,5 min; ja aikavakio, 0,03 s. Cellular ROS sisällöt mitattiin inkuboimalla ohjaus tai pantopratsolin käsiteltiin RgM-1-solujen kanssa 10 uM H 2DCF-DA (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) 30 minuutin ajan. Fluoresenssi mitattiin käyttäen konfokaalista laser- mikroskoopilla (LSM710, Carl Zeiss, Oberkochen, Saksa).
Western blot-analyysi
Käsitellyt solut pestiin kahdesti PBS: llä ja sitten hajotettiin jääkylmässä soluhajotuspuskurin (Cell Signaling Technology) joka sisälsi 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF, Sigma Aldrich). Proteiinit lysaatit erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi (PVDF), joita inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla, pestiin, inkuboitiin peroksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-aineita, pestään uudelleen, ja sitten visualisoidaan käyttäen parannetun kemiluminesenssin (ECL) järjestelmä ( GE Healthcare, Buckinghamshire, UK).
elektroforeettisen liikkuvuuden geeli shift (EMSA) B Nuclear ja sytoplasman fraktiot uutettiin käyttäen NE-PER ydin- ja sytoplasman reagenssit (Pierce, Rockford, IL), mukaan valmistajan ohjeiden. Antioksidantit vaste-elementin (ARE) oligonukleotidikoetin, 5'-TTT TCT GCT GAG TCA AGG TCC G-3 ', ja HIF-1α oligonukleotidikoettimen 5'-TCT GTA CGT GAC CAC ACT CAC CTC-3', leimattiin [ ,,,0],γ- 32P] ATP käyttäen T4 polynukleotidikinaasia (Promega, Madison, WI) ja erotettu rekisteröimättömät [γ- 32P] ATP geelisuodatuksella käyttäen nick -fuugipylväässä (GE Healthcare). Ennen lisäämällä 32P-oligonukleotidi (1x10 5 cpm), 10 ug tumauutetta pidettiin jäillä 15 minuutin ajan geelin shift sitovaa puskuria. Sekvenssin määrittämiseksi spesifisyyden NF-KB: n DNA-vuorovaikutus, lisäsimme ylimäärä leimaamatonta oligonukleotideja. Kun 20 min inkuboinnin jälkeen huoneenlämpötilassa, 2 ui 0,1% bromifenolisinistä, lisättiin, ja näytteet ajettiin elektroforeesilla 6% ei-denaturoivaa PAGE 150 V kylmähuoneessa. Lopuksi, geelit kuivattiin ja altistettiin röntgenfilmille (Kodak, Rochester, NY).
Immunosytokemia
Käsitelty solut kammiossa Leikkeitä kiinnitettiin 3,7% formaldehydillä 15 minuutin ajan. Pesun jälkeen soluja blokattiin 5% BSA: ta, joka sisälsi 0,1% Triton X-100 PBS: ssä 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, ja sitten niitä inkuboitiin primäärisen vasta-aineen (1: 100) 12 tuntia 4 ° C: ssa. Solut pestiin sitten 3 kertaa, inkuboitiin sekundaarisen vasta-aineen (1: 300) 1 tunnin ajan, ja sitten 4'-6-diamino-2-fenyyli (DAPI, 100 ng /ml) 1 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Pesun jälkeen 3 kertaa, solut asennettu Prolong Gold mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää reagenssia (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Fluoresenssi visualisoitiin konfokaalisella laser mikroskoopilla (LSM710, Carl Zeiss).
RNA: n eristys ja kvantitatiivinen RT-PCR (qRT-PCR) B-hoidon jälkeen, väliaine poistettiin imulla ja solut pestiin Dulbeccon fosfaatti puskuroitua suolaliuosta (DPBS) kahdesti. RiboEX (Gene Kaikki, Seoul, Korea) lisättiin levyille, joita sitten inkuboitiin 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. RiboEX kerättiin ja laitettiin 1,5 ml: n putkeen, ja lisättiin kloroformia ja sekoitettiin varovasti. Kun oli inkuboitu 10 min jäillä, näytteet sentrifugoitiin 10000 x g 30 minuuttia. Supernatantit uutetaan ja sekoitettiin isopropanolin, ja seoksia inkuboitiin 4 ° C: ssa 1 h. Sen jälkeen kun oli sentrifugoitu 13000 g
30 min, pelletti pestiin 70% (v
/tilavuus
) etanolia. Sen jälkeen, kun etanoli haihtua täysin, pelletit liuotettiin dieteeniglykolin pyrokarbonaattia (DEPC) käsitellyssä vedessä (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). cDNA valmistettiin käyttäen käänteistranskriptaasia johdettu hiiren Maloney leukemia-viruksen (Promega, Madison, WI), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. PCR suoritettiin 30 sykliä: 94 ° C 20 sekuntia, 58 ° C 30 sekuntia ja 72 ° C: ssa 45 sekuntia. Oligonukleotidialukkeita PCR (taulukko 1) ostettiin Bioneer (Daejeon, Korea). Kaikki qRT-PCR Kokeet toistettiin kolmena kappaleena ja kvantitointi esitetään keskiarvona ± SD.Table 1 sekvenssi PCR-alukkeiden
GAPDH
Eteenpäin 5'-GGT GCT GAG TAT GTC GTG GA -3 '
Reverse 5'-TTC AGC TCT GGG ATG ACC TT-3 '
HO-1
Forward 5'- GAG AGC ATG TCC CAG GAT TT-3'
Reverse 5'-GGT TCT GCT TGT TTC GCT CT -3 '
COX-2
Eteenpäin 5'- GAA ATG GCT GCA GAG TTG AA -3'
Reverse 5'-TCA TCT AGT CTG GAG TGG GA -3 '
HIF-1α
Forward 5'-AAC AAA CAG AAT CTG TCC TC-3 '
Reverse 5'-GGT AAT GGA GAC ATT GCC AG-3'
VEGF
Eteenpäin 5'-CAA TGA TGA AGC CCT GGA GT-3 '
Reverse 5'-GAT TTC TTG CGC TTT CGT TT -3'
PDGF
Eteenpäin 5'- AGG AAG CCA TTC CCG CAG TT-3 '
Reverse 5'-CTA ACC TCA CCT GGA CCT CT -3 '
PAF
Eteenpäin 5'-TAT GAA GGA AGA TGG ACG GC-3'
Reverse 5'-AAC AGT ATG GCC TTC TGT CC -3 '
IL-1β
Forward 5'-CAT TGT GGC TGT GGA GAA G-3 '
Reverse 5'-ATC ATC CCA CGA GTC ACA GA -3'
IL-8
Forward 5'- CAG ACA GTG GCA GGG ATT CA-3 '
Reverse 5'-TTG GGG ACA CCC TTT AGC AT-3'
TNF-α
Forward 5'-TAC TGA ACT TCG GGG TGA TT -3 '
Käänteinen 5'-CAG CCT TCT CCC TTG AAG AG-3 '
ICAM-1
Forward 5'- TGT GCT TTG AGA ACT GTG GC-3'
Reverse 5'-GGT TCT GTC CAA CTT CTC AG -3 '
VCAM-1
Forward 5'- GAG ACA AAA CAG AAG TGG AAT-3'
Reverse 5'-TAC AAG TGG TCC ACT TAT TTC -3 '
NOX1
Eteenpäin 5'- GAG AAA TTC TCG GAA CTG CC-3 '
Reverse 5'- TGT TGG CTT CTA CTG TAG CG -3'
In vitro
angiogeneesimääritys
määritys suoritettiin käyttäen kaupallista pakkausta mukaisesti valmistajan ohjeiden (Millipore, Billerica, MA). Sillä hypoksisissa olosuhteissa, ECMatrix ja liuotinta puskuria sekoitettiin tehdä kiinteä geeli, joka sen jälkeen maljattiin 96-kuoppaisille mikrolevyille. Ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC, 1,0 x 10 5 /ml), ympättiin ohjaus, indometasiini, indometasiini ja pantopratsoli, indometasiini ja pantopratsoli sekä ZnPPIX inkuboitiin 37 ° C: ssa 4 h. -Putken muodostumiseen havaittiin valomikroskoopilla.
Indomethacin-induced mahavaurion mallin
yhteensä 48 rottaa hankittiin Charles River (Osaka, Japani). Eläimet käsiteltiin valtuutettuun eläinpalvelussa mukaisesti Association for arviointi ja akkreditointi Laboratory Animal Care International (AAALAC International) suuntaviivoja laitokseen nimeltään CACU (The Center of Animal Care ja Use) Lee Gil Ya syöpä ja diabetes Institute, Gachon University jälkeen Institutional eettinen Review Board hyväksyntä. Eläimet jaettiin neljään ryhmään, joista kukin koostui 12 rotilla ja nälkiinnytettiin 24 tuntia ennen kokeita seuraavasti; kaikki rotat annettiin intraperitoneaalisesti injektoimalla indometasiinia (10 mg /kg) aiheuttaa mahalaukun vahingoista, toinen ryhmä injektoimalla vatsaonteloon 10 mg /kg pantopratsolin, kolmannen ryhmän, jossa injektoimalla vatsaonteloon 30 mg /kg pantopratsolin, ja neljäs ryhmä injektoimalla vatsaonteloon 30 mg /kg pantopratsolia ja 5 mg /kg ZnPPIX inhiboida HO-1. Eläimet tapettiin 16 h kuluttua jokaisen annon. Vatsat rotat poistettiin ja avattiin suurempaa kaarta pitkin ja pestiin sitten jääkylmällä fosfaattipuskuroidulla ratkaisuja. Lukumäärät joko eroosioita tai haavauma määritettiin alla suurennetun valokuvia. Homogenaatit saatu naarmuuntunut mahan limakalvon pidettiin nestetyppeen säiliöön, kunnes määritys.
Tilastollinen analyysi
Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. Aineisto analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA, ja tilastollisen merkittävyyden ryhmien välillä määritettiin Duncanin useita erilaisia ​​testi. Tilastollinen merkitsevyys hyväksyttiin tasolla P
< 0.05.
Tulokset
Pantopratsoli kasvoi HO-1 ilmentymisen kautta Nrf2 aktivoinnin
Alustavien tutkimus, olemme löytäneet pantopratsolin oli suurinta induktio HO-1 ilmentymisen RGM-1-solujen joukossa protonipumpun estäjiä, lansopratsoli, rabepratsoli omepratsoli, ja pantopratsoli (tietoja ei ole esitetty). Pantopratsoli lisääntynyt ekspressio HO-1-mRNA: n ja proteiinin annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 1A) ja immunosytokemialliset analyysi osoitti myös, että tasolla HO-1 kasvatti merkittävästi pantopratsoli hoidon sytoplasmassa RGM-1-solujen annoksesta -riippuvaista tavalla (kuvio 1 B). Ymmärtää mekanismeista säätely ylöspäin HO-1 ilmentymisen pantopratsoli, tutkimme sen vaikutuksia aktivointi Nrf2, suuri transkriptiotekijä, joka välittää ARE /EpRE perustuvaa ilmaisua antioksidantti entsyymejä. Kun mittasimme ilmentymistason keap1, repressorina Nrf2 sytoplasman osa käsiteltiin 300 uM pantopratsolin eri ajankohtana merkittävästi vähentynyt ilmentyminen Keap1 havaittiin 1 h (kuvio 2A), viittaa siihen, että HO-1 voidaan transkriboida jälkeen pantopratsoli hoidon kautta Nrf2 aktivaation ja Keap1 inaktivaatiota. Kuten on havainnollistettu kuviossa 2A, Nrf2 ydinvoiman kolokalisaation oli ilmeistä RgM-1-soluja käsiteltiin pantopratsolia. Suurin OVAT sitova aktiivisuus Nrf2 suureni 1 h sekä sen tumaanohjaussignaali aiheuttama pantopratsolia (kuvio 2B). Sen varmistamiseksi ydinvoiman kertyminen Nrf2, me tehnyt immunosytokemiallisessa analyysi käyttäen anti-Nrf2 vasta-aine. Kuten kuviossa 2C, Nrf2 oli siirtämisellä osaksi tumaan 300 uM pantopratsolin hoitoa. Nämä tulokset johdonmukaisesti ehdottanut, että pantopratsoli voi lisätä HO-1 tasoilla transkription aktivaation Nrf2 rotan mahalaukun epiteelisolujen. Kuvio 1 pantopratsoli indusoi ilmentymistä HO-1. (A) RT-PCR: llä ja Western blot HO-1 ilmentymisen mukaan eri annostuksen pantopratsolin, 30, 100, ja 300 uM, vastaavasti. Nämä luvut ovat edustajia saatujen tulosten 3 itsenäisestä kokeesta. (B) konfokaali kuvantaminen HO-1. Pantopratsoli lisääntynyt ekspressio HO-1 annoksesta riippuvalla tavalla normaaleissa rotan mahalaukun limakalvon RgM-1-soluissa.
Kuvio 2 pantopratsoli lisääntynyt Nrf2 tumaansiirtymiseen ja sytoplasmisen keap1 inaktivaation, johti merkittävästi anti-hapettumista. (A) Western-blotit joko sytosolin Keap1 tai ydin- Nrf2 eri aikaan läsnäollessa 300 uM pantopratsolin. (B) elektroforeettinen liikkuvuus shift (EMSA) ARE-DNA sitovaa aktiivisuutta. Runsaasti lisää DNA-sitoutumisen Nrf2 todettiin 60 min kuluttua pantopratsolia annon. (C) konfokaali kuvantaminen Nrf2 jälkeen eri annostuksen pantopratsolin 100 uM ja 300 uM. (D) Electron spin resonanssi (ESR) mittaus Fenton reaktion syntyvän hydroksyyliradikaaleja. (E) muutokset on DCF-DA fluoresenssi jälkeen eri annostuksen pantopratsolin 30, 100, ja 300 uM. Pantopratsoli väheni merkittävästi H2O2 aiheuttamaa oksidatiivista fluoresenssi.
Koska biologista merkitystä HO-1: pantopratsoli hallussaan anti-oksidatiivisen liittyviä toimia HO-1 induktio. ESR mittaus oli perimmäinen tapa jäljittää vapaiden radikaalien sukupolvi käyttää spin additiotuotteen, josta meillä tuotetaan hydroksyyliradikaaleihin käyttäen DMPO kuin lähentäjälihasten alla Fenton reaktion. Kuten nähdään kuviossa 2D, 3 mM pantopratsoli kohdistama selkeä huuhteluilman toiminnan DMPO-adduktia tuottaville hydroksyyliradikaaleja. Koska ESR mittaus toteutettiin kemiallisessa reaktiossa kunnossa ei biologisessa järjestelmässä ja pantopratsoli ei ole ammattimainen antioksidantti, se varmasti osaltaan kaivella hydroksyyliradikaaleihin vaikka se on suhteellisen korkea pitoisuus pantopratsolin scavenge reaktiivisia happiradikaaleja. Nämä kemialliset tulokset ESR Tutkimuksen oli vielä validoitu biologisten -testi DCF-DA fluoresenssin mittaus, joka osoittaa, että pantopratsoli osoitti merkittäviä DCF-DA alentaminen annosriippuvaisesti (P ​​
< 0,05, kuvio 2E).
angiogeeninen toimien seurauksena pantopratsolin aiheuttama HO-1
PPI lisäsi ilmaisuja VEGF-mRNA: n ja proteiinin RGM-1-soluissa (kuvio 3A). Jotta asiakirjan onko vähitellen induktio VEGF PPI-lääkkeisiin liittyy HO-1 induktio, me toisti kokeiluja PPI yksin tai yhteistyössä hoitoon pantopratsolin ja sinkkiprotoporfyriini (ZnPPIX) HO-1-estäjä. Kuten tulokset, voisimme vahvistaa uudelleen VEGF: n ilmentymistä indusoi pantopratsolin ja vähitellen co-hoitoon ZnPPIX selvästi vähentynyt ilmentyminen PPI-indusoidun VEGF annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 3B). Seuraavaksi tutkimme muutoksia edustavia angiogeenisten tekijöiden, bFGF, PDGF, ja HIF-1α ja noudatetaan näitä ilmaisuja merkitystä pantopratsolin aiheuttamiin HO-1 kuvassa 3C. Kuten odotettua, pantopratsoli huomattavasti näitä ilmaisuja useita angiogeenisten tekijöiden. Myös nämä induktiot PAF ja PDGF merkittävästi vaimentunut, joilla on samanaikainen hoito pantopratsolia ja ZnPPIX. Sen tarkistamiseksi, ovatko nämä inductions angiogeenisten tekijän jälkeen pantopratsoli tosiasiallisesti liittyvät angiogeneesiin, in vitro
angiogeneesimääritys tehtiin (kuvio 3D). Tube muodostus oli merkittävästi heikennetty 500 uM indometasiinia HUVEC, kun taas 100 uM pantopratsoli voi voittaa nämä derangements angiogeneesin käsitelty indometasiinin. Kuitenkin lisäkäsittelyä ZnPPIX lakkautti nämä hyödyt voittaa angiogeneesin pantopratsoli alle indometasiinin annon. Nämä tulokset viittaavat siihen, että pantopratsoli kompensoitu tulehduskipulääkkeiden aiheuttama puutteellinen angiogeneesin kautta HO-1 induktio ominaisuus. Kuvio 3 Pantopratsoli aiheuttama angiogeenisten tekijöiden liittyvät HO-1 induktio. (A) RT-PCR ja western blot VEGF. Merkittävä inductions VEGF havaittiin pantopratsolin merkittävästi jälkeen 300 uM pantopratsolia (p < 0,05
). Nämä luvut ovat edustajia saatujen tulosten 3 itsenäisestä kokeesta. (B) muutokset VEGF ja HO-1 pantopratsolihoidon yksinään tai yhdistelmänä pantopratsolin ja ZnPPIX. Induktio VEGF jälkeen pantopratsolin oli merkittävästi vaimentunut, jossa HO-1-estäjä, merkitsee implisiittisesti HO-1: PPI-indusoitu VEGF. Nämä luvut ovat edustajia saatujen tulosten 3 itsenäisestä kokeesta. (C) Muut angiogeenisten tekijöiden liittyviä pantopratsolia. bFGF ja VEGF yhä ilmaista pantopratsolia, mutta nämä Indusoinnit vaimentaa HO-1-estäjä. Nämä luvut ovat edustajia saatujen tulosten 3 itsenäisestä kokeesta. (D) in vitro
angiogeneesimääritys. Putken muodostumiseen HUVEC pieneni merkitsevästi 50 uM indometasiinia. Pantopratsoli kompensoitu indometasiinin aiheuttamaa viallinen angiogeneesiä arvioituna prosenttiosuus putken muodostumiseen, kun taas HO-1-estäjä peruutetaan nämä voittaa pantopratsolin angiogeneesissä. Nämä luvut ovat edustajia saatujen tulosten 3 itsenäisestä kokeesta.
Pantopratsolia aiheuttama HO-1 heikennettyjä indometasiinia liittyvän tulehduksellinen hyökkäys
Vaikka indometasiinia on anti-inflammatorinen aine, se on tiedetty, että NSAID aiheuttamaa mahalaukun vaurioita kautta lisääntynyt ilmaisuja tulehduksellisten välittäjäaineiden, kuten TNF-α, IL-1β, IL-8, ja NADPH-oksidaasi-1 (NOX-1). Kuten nähdään kuviossa 4A, 500 uM indometasiinia lisäsi merkittävästi ilmaisuja TNF-α, IL-1β, ja IL-8 mahalaukun epiteeli- soluja, kun taas se aleni ekspressiota HO-1, vahvistettiin, että tulehduksen välittäjäaineita voidaan mekaanisesti liittyvän indometasiinin aiheuttamaa mahalaukun epiteelisoluvauriota. Tässä tilassa samanaikainen 500 uM indometasiinia ja 300 uM pantopratsolin vähensi ilmaisuja TNF-α, IL-1β, ja IL-8 mukana tilastollisesti merkitsevää HO-1 ilme. Lisäksi indometasiini haaste lisäsi merkittävästi ilmaisuja NOX-1, jossa pantopratsolin vaimensi merkittävästi lisääntynyt ilmentyminen NOX-1, mikä viittaa siihen, että pantopratsolin aiheuttamiin HO-1 määrätty tulehdusta toimia indometasiinia. Seuraavaksi jotta edelleen todistaa, ovatko nämä vaimennukset tulehdusväliaineiden jälkeen pantopratsolia johtui HO-1 induktio, me toisti nämä kokeet ZnPPIX annon. Kuten nähdään kuviossa 4B, co-hoito ZnPPIX läsnä pantopratsolin merkittävästi poistettiin edut anti-inflammatorinen vaikutus. Inkrementaalinen inductions ICAM-1 ja VCAM jälkeen indometasiinia hoidon vastasivat iskemian ja törkeästä urut vahinkoja, joissa joko verisuonten tulehdusta tai lisääntynyt leukosyyttien aggregaatio työskentelee. Hoito indometasiini lisäsi merkittävästi ilmaisuja ICAM-1 ja VCAM HUVEC, mutta co-haaste indometasiinia ja pantopratsolin laski merkittävästi indometasiinin indusoiman ICAM-1 ilmentymisen merkitystä lisäsi induktio HO-1 (kuvio 4C). Tässä tilassa ZnPPIX ei aseteta vaimennuksen ICAM tai VCAM huolimatta pantopratsolin hoidon edelleen varmistaen saajan toiminta pantopratsolin liittyy HO-1 induktio. Kuva 4 Pantopratsoli heikennettyä indometasiinin aiheuttamaa tulehduksen välittäjäaineiden kautta HO-1. (A) RT-PCR TNF-α, IL-1β, IL-8, ja HO-1. 500 uM indometasiinia lisääntynyt ekspressio tulehduksellisten välittäjäaineiden, kuten TNF-α, IL-1β, IL-8, mutta laskivat merkittävästi HO-1 ilmentymisen. NOX-1 oli merkitsevästi lisääntynyt indometasiinin. Nämä luvut ovat edustajia saatujen tulosten 3 itsenäisestä kokeesta. (B) Pantopratsoli laski merkittävästi indometasiinin aiheuttamaa IL-1β ja TNF-α, mutta nämä saajan toimista pantopratsolin poistettiin kanssa ZnPPIX, minkä perusteella voidaan päätellä, että tulehdusta toimia pantopratsolin oli takia HO-1 induktio. Nämä luvut ovat edustajia saatujen tulosten 3 itsenäisestä kokeesta. (C) Pantopratsoli laski merkittävästi indometasiinin aiheuttamaa ICAM-1 ja VCAM HUVEC-soluissa, mutta nämä saajan toimista pantopratsolin myös luovuttava ZnPPIX HO-1-estäjä. Nämä luvut ovat edustajia saatujen tulosten 3 itsenäisestä kokeesta.
Pantopratsolia aiheuttama HO-1 enfeebled indometasiinin aiheuttamaa mahalaukun vamman
tutkimiseksi suojaava vaikutus pantopratsolin vivo
, indometasiinia (10 mg /kg ) annettiin vatsaonteloon 16 tunnin rotilla. Hoito indometasiinin merkittävästi provosoi mahalaukun limakalvon vammoista kuten aivoverenvuotoon eroosioita ja haavaumia. Kuitenkin nämä mahalaukun sairaudet provosoi indometasiinilla merkittävästi vaimentaa injektoimalla vatsaonteloon 30 mg /kg pantopratsolia (kuvio 5A). Koska nämä suojaavat vaikutukset 30 mg /kg pantopratsolia vastaan ​​indometasiinin aiheuttamaa mahalaukun vahinkoja merkittävästi kumottiin yhteistyössä hoidossa vatsaonteloon annettiin 5 mg /kg ZnPPIX, varmistimme, että suojaava vaikutus pantopratsolin perustui sen kyky HO-1 induktio . Kun ilmaisuja HO-1 ja ICAM-1 mitattiin limakalvon homogenaatteja kustakin ryhmästä, indometasiini anto vähensi ilmaisuja HO-1 ja lisäsi ICAM-1. Kuitenkin, koska lisääntynyt HO-1 ilmaisuja jälkeen pantopratsoli sekä merkittävästi heikennetty tasoa ICAM-1, indometasiinin aiheuttaman mahavaurion oli suhteellisesti parantunut huolimatta indometasiinin haaste (kuvio 5B). Osoittamaan, miten pantopratsolin paransi viallisen angiogeneesiä ja iskemian aiheuttama indometasiini, EMSA käyttäen HIF-1α suoritettiin (kuvio 5C). HIF-1α-DNA sitoutumisaktiivisuus oli erittäin lisääntynyt indometasiinia yksin ryhmä, joka oli merkittävästi vähentynyt mahalaukun homogenaateissa pantopratsolin testiryhmässä merkitsee pantopratsoli huomattavasti helpottunut hypoksinen ehto aiheuttama indometasiinia. Yhdessä protonipumpun estäjiä kohdistuva voimakas suoja indometasiinin aiheuttamaa mahalaukun limakalvon vaurio läpi merkittäviä HO-1 induktio, joka ylittää aito happo tukahduttava toimintaa, vaikka emme mitata muutoksia mahalaukun happamuutta. Kuvio 5 pantopratsoli estää sen indometasiinin aiheuttamaa mahavauriota kautta riippuen induktio HO-1. (A) keskimääräinen indeksi indometasiinin aiheuttamaa mahalaukun vahingot. (B) RT-PCR HO-1 ja ICAM-1 mukaan ryhmään. (C) EMSAn HIF-1α mukaan ryhmään. Indomethacin huomattavasti HIF-1α-DNA: n sitoutuminen, kun taas pantopratsoli laski merkittävästi HIF-1α-DNA: n sitoutuminen on annosriippuvaisesti.
Keskustelu
Ennen tutkimuksessa, useat tutkijat ovat julkaisseet, että PPI-lääkkeet voisivat estää mahalaukun limakalvon vauriota muilla mekanismeilla kuin toiminta sen erityisen hapon esto [11, 14, 25-28], voisimme lisätä todisteita koskien suojaava vaikutus PPI-lääkkeiden vastaan ​​tulehduskipulääkkeitä. Pantopratsoli merkittävästi indusoi ilmentymistä HO-1: stä Nrf2 aktivoinnin kannalta anti-inflammatorisia, anti-hapettava, ja iskemia lievittää toimia. Novel löydös eroaa muista tutkimuksista on, että pantopratsoli osoittaa suojaavia toimia NSAID aiheuttama vahinko joko korjaamista angiogeenisten haitan tai vaimennus tulehduksen taipumuksesta.
Becker JC et al.
[16] osoitti että sekä omepratsoli ja lansopratsoli suojattu ihmisen mahalaukun epiteeli- ja endoteelisolujen oksidatiivista stressiä vastaan ​​samanlainen tutkimuksessamme mutta käyttää erilaisia ​​PPI-lääkkeitä. Koska tämä vaikutus kumottiin läsnä ollessa HO-1-estäjä, ZnPPIX, HO-1 näyttää olevan oikea tavoite PPI sekä endoteeli- ja mahalaukun epiteelisolujen. Tässä tutkimuksessa havaitsimme koskematon uusi havainto, että HO-1 aiheuttama tuottajahintaindekseillä laski tulehduskipulääkkeiden-syntyneet tulehdus ja angiogeenisen häiriintyneisyys. Kaikki kirjoittajat luettu ja hyväksytty lopullinen käsikirjoitus.

• Epstein-Barrin virus liittyvät mahakarsinoo-: raportti Iranista viimeisten neljän vuosikymmenen
• Association välillä RUNX3 promoottorin metylaation ja mahasyövän: meta-analyysi