Um possível envolvimento de Nrf2 mediada por heme oxigenase-1-regulação no efeito protetor do pantoprazol inibidor da bomba de protões contra lesões gástricas induzidas por indometacina em ratos

Um possível envolvimento de Nrf2 mediada por heme oxigenase-1-regulação no efeito protetor do pantoprazol inibidor da bomba de protões contra lesões gástricas induzidas por indometacina em ratos
Abstract Background
bomba de protões é uma proteína de membrana integral que é ubíqua cassete de ligação de ATP (ABC) envolvido em muitos processos de transporte em todos os organismos vivos, entre os quais uma forma especializada de bomba, chamados p
-tipo bomba de protões, existe nas células parietais do estômago. Embora os inibidores da bomba de protões (IBP) são frequentemente prescritos para prevenir não-esteróides anti-inflamatórios não esteróides (AINEs) induzida por lesões gástricas, as acções de supressão ácida não são suficientes para explicar.
Métodos
Para documentar os efeitos de pantoprazol , um de IPP, sobre os danos gástricos induzidos pelas NSAIDs-, in vitro e in vivo
foram realizados estudos
. Imunocitoquímica, análise de mancha de Western, ensaio de desvio de mobilidade electroforética e RT-PCR foram realizadas para avaliar a indução da heme oxigenase-1 (HO-1) através da activação do Nrf2 em células normais da mucosa gástrica RGM-1 ou in vivo
tecidos de estômago os ratos tratados com indometacina e /ou pantoprazole.
Resultado
pantoprazol Nrf2 activado através de inactivação Keap1, após o que a expressão de HO-1 foi significativamente aumentada de uma maneira dependente da dose em células RGM-1. O aumento da atividade de ligação são-DNA foi observada no máximo a 1 h com 300 mm de pantoprazol. A expressão da HO-1 induzida por pantoprazol foi significativamente associada com o aumento in vitro
formação do tubo (P Art < 0,05) e fatores angiogênicos incluindo VEGF, bFGF, e HIF-1α. Indometacina marcadamente aumentou a expressão de TNF-α, IL-1ß, IL-8 e de NOX-1, ICAM-1 e VCAM, ao passo que o pantoprazol diminuiu significativamente as expressões de induzida por indometacina estes mediadores inflamatórios de acordo com induzida por pantoprazol HO-1 (P
< 0,05) como documentado com HO-1 de inibidor. No modelo in vivo
de lesões gástricas induzidas por indometacina podia validar in vitro
-drawn resultados que o pantoprazol notavelmente protegidas contra lesões gástricas induzidas por indometacina, em que a protoporfirina de zinco (5 mg /kg, ip
) suprimiram significativamente a eficácia protectora de pantoprazol.
Conclusão
Estes resultados demonstram que Nrf2 mediada por HO-1 indução de PPIs proporcionou um efeito protetor significativo contra lesões gástricas induzidas NSAIDs-além das ações de supressão ácida.
Palavras-chave
Heme oxigenase-1 Proton inibidor da bomba de NSAIDs induzida gastropathy fundo Nrf2
NSAIDs têm enormes volumes de prescrição principalmente com base nos dois benefícios seguintes, um é um aumento de pacientes com idade necessitando de NSAIDs prescrição para aliviar a dor induzida por alterações degenerativas e o outro é um teste adicional para tanto a prevenção de pólipos do cólon ou a fuga de doenças cardiovasculares isquêmicos [1, 2]. No entanto, a vasta utilização de NSAIDs está limitada por efeitos adversos perturbadores, tais como a erosão gástrica /úlcera, complicado hemorragia de úlceras, e as complicações mais graves que surgem no intestino delgado e cólon. Uma vez que a acção farmacológica dos NSAIDs é, através da inibição de prostaglandina síntese (PG) através da supressão de ciclo-oxigenases (COX) [3], diminuição indiscernível de gastroprotetora prostaglandina E 2 (PGE 2) é responsável por estes gastrintestinal (GI) efeitos adversos. Embora a invenção de um inibidor selectivo da COX-2, coxib, para garantir a segurança gastrointestinal tem sido sugerida como a estratégia de resolução, esta solução também tem de melhorar. Embora AINEs são utilizados como potentes fármacos anti-ulcerosos, os mecanismos descobertas adicionais de toxicidade AINE [4, 5] levar-nos para desenvolver agentes mais potentes e mais seguras.
No presente momento, o GI a melhor escolha para a prevenção de AINEs relacionada- toxicidade é ou a combinação dos AINEs e inibidores da bomba de protões (IBP) ou a escolha de coxibes [6, 7]. Uma vez que a taxa de cicatrização de úlceras gastrointestinais durante o uso contínuo de AINEs foi maior no grupo PPIs que o grupo Tipo de histamina antagonista do receptor 2 (H2-RA), PPIs foram preferido do que H2-RA para lidar com os efeitos adversos dos AINEs [8, 9 ]. Além de acções supressivas de ácido fundamentais de IPP, várias funções têm sido revelado que são a redução de sinalização pró-apoptótica, restauração ácido-independente da proliferação e reparação de vias [10], uma redução em danos oxidativos das mucosas, a cura das acções de promoção, e retículo endoplasmático alívio de tensões mecanismo [11-16]. Hahm et al.
[17-19] também relataram que os IPP mostrar as atividades potenciais como agentes terapêuticos anticancerígenos baseados em indução seletiva da apoptose, anti-angiogênese contra a Helicobacter pylori
carcinogênese -associated, e as ações anti-mutagénicas directas durante a tumorigênese. No entanto, os mecanismos responsáveis ​​para os efeitos protectores de IPP em AINEs induzida por lesão gástrica ainda não foram determinados.
Heme oxigenase-1 (HO-1), um induzível pela primeira e limitante da velocidade da enzima de degradação da heme, tem sido conhecido para proteger contra a citotoxicidade do stress oxidativo e morte celular por apoptose, bem como doença inflamatória [20, 21]. efeitos protectores Fundamentais de HO-1 contra inflamação são mediadas através de degradação do heme anti-oxidante, mas também está relacionado com a produção dos mediadores anti-inflamatórios, para o qual redox dependente de factor activador de transcrição, NF-E2 relacionada-2 (Nrf2), e sua fosforilação /ativação e oxidação de Kelch-like protein-associando ECH 1 (Keap1) é mecanicamente sugeriu [22-24]. Desde a expressão da HO-1 foi induzida por anti-oxidante, anti-inflamatória e respostas aliviar isquêmicos, no estudo atual, a hipótese de que os efeitos protetores dos PPIs contra lesões gástricas induzidas NSAIDs-pode estar relacionado a HO-1 e consequente angiogênese além supressão de ácido inata. Ao todo, os nossos resultados demonstram os novos mecanismos que PPIs induzem a expressão da HO-1 através da activação do Nrf2 /inativação Keap1 acompanhado com a remuneração da mudança isquêmica e a atenuação de mediadores inflamatórios, facilitando assim a protecção contra lesões gástricas induzidas por indometacina.
métodos
Materiais e culturas de células
indometacina foi adquirido de Sigma Aldrich (Saint Louis, MO) e pantoprazol foi fornecido a partir Amore Pacific Pharmaceutical Co. (Seul, Coréia). Anticorpos para β-actina, HO-1, α-tubulina, Keap1, Nrf2 e VEGF foram todos obtidos da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). células da mucosa gástrica RGM-1 normal de rato foram fornecidas pelo Prof. Hirofumi Matsui, MD, PhD (Tsukuba Univ., Japão), foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 10% (v
/v
) de soro fetal bovino, 100 U /ml de penicilina. células vasculares umbilicais humanos endoteliais (HUVECs) foram cultivadas em meio M199 (Tela InnoPharma, Seoul, Coreia do Sul). As células foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO 2. As quantidades apropriadas de células RGM-1 ou HUVEC foram semeadas e incubadas durante 24 h, em seguida, eles foram tratados com a dose indicada de pantoprazole ou indometacina e incubadas durante os tempos indicados. HUVECs foram transferidas para 1% O 2 e 5% CO câmara 2 hipóxia e incubado por 0-12 h para a vitro
ensaio de formação do tubo em.
Ressonância de spin de elétrons (ESR) e espectroscopia medição de geração de ROS
Várias concentrações de pantoprazole adicionado a um volume total de 200 ul contendo 0,05 mM de FeSO 2O 2, 1 mM de 5,5-dimethylpyrroline-N-óxido 4, 1 mM de H (DMPO, Sigma Aldrich, Saint Louis, MO), e 50 mM de fosfato de sódio a pH 7,4 à temperatura ambiente. As reacções foram iniciadas pela adição de H 2O 2. Após incubação durante 1 min, alíquotas das reacções foram transferidas para uma célula de quartzo e o espectro de DMPO-OH foi examinada utilizando um espectrofotómetro de ESR (Jes-TE300, JEOL, Tóquio, Japão), sob as seguintes condições: o campo magnético, 338,0 ± 5.0 mT; potência de microondas, 4,95 mW; frequência, 9.421700 GHz; modulação de amplitude, 5 milhões de toneladas; varrer tempo, 0,5 min; e constante de tempo, 0,03 s. conteúdo celular ROS foram medidos por incubação de controlo ou tratados pantoprazol RGM-1 células com 10 ^ M H 2DCF-DA (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) durante 30 min. A fluorescência foi medida usando um microscópio confocal a laser (LSM710, Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha).
Análise de Western blot
células tratadas foram lavadas duas vezes com PBS e depois lisadas em tampão de lise celular gelada (Cell Signaling Technology) contendo 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF, Sigma Aldrich). Proteínas em lisados ​​foram separados por SDS-PAGE e transferidos para o fluoreto de polivinilideno (PVDF) membranas, que foram incubadas com anticorpos primários, lavadas, incubadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase, lavada de novo, e então visualizadas utilizando um quimioluminescência aumentada sistema (ECL) ( GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido).
ensaio de gel shift mobilidade eletroforética (EMSA)
Nuclear e frações citoplasmáticos foram extraídos utilizando reagentes citoplasmáticos (Pierce, Rockford, IL) NE-PER Nuclear e, de acordo com as instruções do fabricante. elemento de resposta antioxidante (ARE) sonda oligonucleotídica, 5'-TTT TCT GCT GAG TCA TCC AGG G-3 ', e HIF-1α sonda oligonucleotídica, 5'-TCT GTA CGT GAC CAC ACT CAC CTC-3', foi marcado com [ ,,,0],γ- 32P] ATP utilizando quinase de polinucleótido T4 (Promega, Madison, WI) e separado do não incorporada [γ- 32P] ATP por filtração em gel utilizando uma coluna de rotação com entalhe (GE Healthcare). Antes de adicionar o 32P-oligonucleótido (1x10 5 cpm), 10? G de extracto nuclear foi mantida em gelo durante 15 min em tampão de ligação de desvio em gel. Para determinar a especificidade da sequência da interacção de ADN de NF-kB, que adicionado um excesso de oligonucleótidos não marcados. Após 20 min de incubação à temperatura ambiente, adicionou-se 2 ul de 0,1% de azul de bromofenol, e as amostras foram sujeitas a electroforese através de 6% PAGE não-desnaturante em 150 V numa sala fria. Finalmente, os geles foram secos e expostos a filme de raios X (Kodak, Rochester, NY).
Imunocitoquímica
células tratadas, em lâminas de câmaras foram fixadas em 3,7% de formaldeído, durante 15 min. Após lavagem, as células foram bloqueadas em solução de BSA a 5% contendo 0,1% de Triton X-100 em PBS durante 1 h à temperatura ambiente, e, em seguida, incubadas com anticorpo primário (1: 100) durante 12 h a 4 ° C. As células foram então lavadas 3 vezes, incubadas com o anticorpo secundário (1: 300) durante 1 h, e, em seguida, com 4'-6-diamidino-2-fenilindole (DAPI, a 100 ng /ml) durante 1 min à temperatura ambiente. Depois de lavar 3 vezes, as células foram montadas com reagente antifade Prolong Gold (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). A fluorescência foi visualizada sob um microscópio confocal de laser (LSM710, Carl Zeiss).
Isolamento de RNA e reacção em cadeia da polimerase inversa transcrição quantitativo (qRT-PCR)
Após o tratamento, o meio foi removido por aspiração e as células foram lavadas com fosfato de Dulbecco salina -buffered (DPBS) duas vezes. RiboEX (Gene Todos, Seul, Coreia) foi adicionada às placas, que foram em seguida incubadas durante 10 min a 4 ° C. RiboEX foi recolhido e colocado num tubo de 1,5 mL, e adicionou-se clorofórmio e misturou-se suavemente. Após incubação durante 10 min em gelo, as amostras foram centrifugadas a 10000 × g durante 30 min. Os sobrenadantes foram extraídos e misturou-se com isopropanol, e as misturas foram incubadas a 4 ° C durante 1 h. Após centrifugação a 13000 g durante 30 min
, sedimento foi lavado com 70% (v
/v
) etanol. Depois de permitir que o etanol se evaporar completamente, os sedimentos foram dissolvidos em dietilenoglicol pirocarbonato (DEPC) tenha sido tratada com água (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). O ADNc foi preparado utilizando transcriptase reversa derivada do vírus da leucemia de murino de Maloney (Promega, Madison, WI), de acordo com as instruções do fabricante. A PCR foi realizada durante 30 ciclos de: 94 ° C durante 20 seg, 58 ° C durante 30 seg, e 72 ° C durante 45 seg. Os iniciadores oligonucleotídicos para PCR (Tabela 1) foram adquiridos a Bioneer (Daejeon, Coreia do Sul). Todos os experimentos qRT-PCR foram repetidas em triplicado e quantificação foi mostrado em média ± SD.Table 1 A sequência dos iniciadores de PCR
GAPDH
Atacante 5'-GGT GCT GAG TAT GTC GTG GA -3 '
Reversa 5'-TTC AGC TCT GGG ATG ACC TT-3 '
HO-1

• Epstein-Barr vírus carcinoma gástrico associado: um relatório do Irã nos últimos quatro decades
• Associação entre a metilação do promotor RUNX3 e câncer gástrico: uma meta-análise