Une éventuelle implication de Nrf2 médiée par l'hème oxygénase-1-régulation dans l'effet protecteur de la pompe à protons inhibiteur de pantoprazole contre les dommages gastriques induites par l'indométhacine chez le rat

Une éventuelle implication de Nrf2 médiée par l'hème oxygénase-1-régulation dans l'effet protecteur de la pompe à protons inhibiteur de pantoprazole contre les dommages gastriques induites par l'indométacine-in Abstract
Contexte rats
pompe à protons est une protéine membranaire intégrale qui est binding cassette omniprésente ATP (ABC) impliqué dans de nombreux processus de transport dans tous les organismes vivants, parmi lesquels une forme spécialisée de la pompe, que l'on appelle p
-type la pompe à protons, existe dans les cellules pariétales de l'estomac. Bien que les inhibiteurs de la pompe à protons (IPP) sont fréquemment prescrits pour prévenir les médicaments anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) induite par des lésions gastriques, les actions suppressives acide ne suffisent pas à expliquer.
Méthodes
Afin de documenter les effets de pantoprazole , l'un des IPP, sur les dommages gastriques AINS induite, in vitro et in vivo

études ont été réalisées. L'immunocytochimie, l'analyse par transfert de Western, un dosage de décalage de mobilité électrophorétique et RT-PCR a été réalisée pour évaluer l'induction de l'hème oxygénase-1 (HO-1) par l'activation Nrf2 dans la muqueuse des cellules normales gastriques RGM-1 ou in vivo
tissus de l'estomac à partir de les résultats de rats traités avec l'indométhacine et /ou le pantoprazole.
pantoprazole activés Nrf2 par inactivation de Keap1, après quoi l'expression de la HO-1 est significativement augmentée de façon dose-dépendante RGM-1 cellules. l'activité de liaison ARE-ADN accrue a été observée au maximum à 1 h avec 300 uM de pantoprazole. L'expression de HO-1 induite par le pantoprazole a été associée de manière significative avec l'augmentation vitro
formation en tube (P
< 0,05) et les facteurs angiogéniques, y compris VEGF, bFGF et HIF-1α. Indomethacin nettement augmenté les expressions de TNF-α, IL-1ß, IL-8, NOX-1, ICAM-1 et VCAM, alors que le pantoprazole a diminué de manière significative les expressions de ces médiateurs inflammatoires induite par l'indométhacine en accord avec induit pantoprazole-HO-1 (P
< 0,05) comme documenté avec HO-1 inhibiteur. Dans le modèle de lésions gastriques induites par indométacine-vivo
pourrait valider in vitro
-drawn résultats dans ce pantoprazole remarquablement protégés contre les lésions gastriques induites par l'indométhacine, dans lequel protoporphyrine de zinc (5 mg /kg, ip
) significativement supprimée l'efficacité protectrice du pantoprazole.
Conclusion
Ces résultats démontrent que Nrf2 médiée HO-1 induction des IPP a donné un effet protecteur significatif contre les AINS induite par des lésions gastriques au-delà des actions suppressives acides.
Mots-clés
Heme oxygénase-1 Proton inhibiteur de la pompe AINS induite par gastropathie Nrf2 Contexte
AINS ont d'énormes volumes de prescription pour la plupart basés sur les deux avantages suivants, on est une augmentation de patients âgés nécessitant des AINS sur ordonnance pour soulager la douleur induite par le changement dégénérative et l'autre est un essai supplémentaire soit pour la prévention des polypes du côlon ou de l'évasion de maladies cardiovasculaires ischémiques [1, 2]. Cependant, la grande utilisation des AINS est limitée par des effets indésirables gênants tels que l'érosion gastrique /ulcère, compliqué saignements des ulcères et des complications plus graves qui se posent sur le petit intestin et du côlon. Puisque l'action pharmacologique des AINS est par l'inhibition de la prostaglandine (PG) synthèse via la suppression des cyclooxygénases (COX) [3], la diminution indiscernable de gastroprotective prostaglandine E 2 (PGE 2) est responsable de ces gastro-intestinal (GI) des effets indésirables. Bien que l'invention de sélectifs de la COX-2 inhibitor, coxib, pour garantir la sécurité GI a été suggéré que la stratégie de résolution, cette solution doit également améliorer. Bien que les AINS sont utilisés comme médicaments anti-ulcéreux puissants, les mécanismes découverts supplémentaires de toxicité AINS [4, 5] nous conduire à développer des agents plus puissants et plus sûrs.
Dans l'heure actuelle, GI le meilleur choix pour la prévention des AINS liés à la toxicité est soit la combinaison d'AINS et d'inhibiteurs de la pompe à protons (IPP) ou le choix des coxibs [6, 7]. Puisque le taux de guérison des ulcères gastro-intestinaux lors de l'utilisation continue des AINS était supérieure dans le groupe de PPIs de type histamine 2 antagoniste des récepteurs (H2-RA) groupe, les IPP ont été préférés à H2-RA pour faire face à l'effet défavorable des AINS [8, 9 ]. Outre les actions suppressives acides fondamentaux des IPP, plusieurs fonctions ont été révélées qui sont la réduction de la signalisation pro-apoptotique, restauration acide indépendante de la prolifération et de la réparation des voies [10], une réduction de la muqueuse des dommages oxydatifs, la guérison action visant à promouvoir, et le réticulum endoplasmique soulager le stress mécanisme [11-16]. Hahm et al.
[17-19] ont également rapporté que les IPP montrent les activités potentielles comme agents thérapeutiques anticancéreux basés sur l'induction sélective de l'apoptose, anti-angiogénèse contre Helicobacter pylori
carcinogenèse -Associated, et les actions anti-mutagènes directs lors de la tumorigenèse. Toutefois, les mécanismes responsables des effets protecteurs de l'IPP dans AINS induite par des lésions gastriques restent à déterminer.
Hème oxygénase-1 (HO-1), un inductible pour la première et enzyme limitante de la dégradation de l'hème, a été connu pour protéger contre la cytotoxicité du stress oxydatif et à la mort cellulaire apoptotique ainsi que l'état inflammatoire [20, 21]. effets protecteurs fondamentaux de la HO-1 contre l'inflammation sont médiés par l'intermédiaire de la dégradation de l'hème l'anti-oxydant, mais également associées à la production des médiateurs anti-inflammatoires, pour lesquelles oxydoréduction dépendant de facteur activateur de la transcription NF-E2 liée 2 (Nrf2) et sa phosphorylation /activation, et l'oxydation des Kelch-like ECH-associant la protéine 1 (Keap1) est mécaniste suggéré [22-24]. Depuis l'expression de HO-1 a été induite par anti-oxydante, anti-inflammatoire, et les réponses d'allégement ischémiques, dans la présente étude, nous avons supposé que les effets protecteurs des IPP contre les lésions gastriques AINS-induits peuvent être liés à HO-1 et de l'angiogenèse par conséquent au-delà de la suppression de l'acide innée. Au total, nos résultats démontrent les nouveaux mécanismes qui induisent PPIs l'expression de HO-1 à l'activation de Nrf2 /inactiver Keap1 accompagné de la rémunération du changement ischémique et l'atténuation des médiateurs de l'inflammation, ce qui facilite la protection contre les lésions gastriques induites par l'indométacine.
Méthodes de les matériaux et indométacine de cultures cellulaires ont été achetés auprès de Sigma Aldrich (Saint Louis, MO) et le pantoprazole a été fourni de Amore Pacific Pharmaceutical Co. (Séoul, Corée). Anticorps pour β-actine, HO-1, α-tubuline, Keap1, Nrf2 et VEGF ont tous été obtenus à partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). rat normal de la muqueuse gastrique cellules RGM-1 ont été fournies par le professeur Hirofumi Matsui, MD, PhD (Tsukuba Univ., Japon), ont été cultivées dans Eagle modifié du milieu de Dulbecco (DMEM) contenant 10% (v
/v
) de sérum bovin fœtal, 100 U /ml de pénicilline. les cellules vasculaires endothéliales ombilicales humaines (HUVEC) ont été cultivées dans du milieu M199 (écran InnoPharma, Séoul, Corée). Les cellules ont été maintenues à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO 2. Des quantités appropriées de RGM-1 ou des cellules HUVEC ont été ensemencées et incubées pendant 24 heures, puis ils ont été traités avec la dose indiquée de pantoprazole ou l'indométhacine et incubées pendant les durées indiquées. HUVEC ont été déplacés à 1% O 2 et 5% de CO chambre 2 hypoxie et incubé pendant 0-12 h pour la vitro
formation du tube test in.
Résonance de spin électronique (ESR) et la spectroscopie la mesure de la production d'ERO
Diverses concentrations de pantoprazole ajouté à un volume total de 200 ul contenant 0,05 mM de FeSO 4, 1 mM de H 2 O 2, 1 mM de 5,5-dimethylpyrroline N-oxyde de (DMPO, Sigma Aldrich, Saint Louis, MO), et 50 mM de phosphate de sodium à pH 7,4 à température ambiante. Les réactions ont été initiées en ajoutant H 2O 2. Après incubation pendant 1 min, des aliquotes des réactions ont été transférées dans une cellule en quartz et le spectre de DMPO-OH a été étudiée à l'aide d'un spectrophotomètre ESR (JES-TE300, JEOL, Tokyo, Japon) sous les conditions suivantes: champ magnétique, 338,0 ± 5.0 mT; puissance micro-ondes, 4,95 mW; la fréquence, 9.421700 GHz; modulation d'amplitude, 5 mT; le temps de balayage, 0,5 min; et constante de temps, 0,03 s. contenu cellulaire ROS ont été mesurés par incubation de la commande ou de pantoprazole traités RGM-1 cellules avec 10 uM H 2DCF-DA (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) pendant 30 min. La fluorescence a été mesurée à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser (LSM710, Carl Zeiss, Oberkochen, Allemagne).
Analyse par Western blot
Les cellules traitées ont été lavées deux fois avec du PBS, puis lysées dans un tampon de lyse cellulaire glacée (Cell Signaling Technology) contenant 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF, Sigma Aldrich). Les protéines dans les lysats ont été séparés par SDS-PAGE et transférés sur le polyfluorure de vinylidène (PVDF) des membranes qui ont été incubées avec des anticorps primaires, lavé, incubé avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase, relavé, puis visualisé en utilisant une chimioluminescence amplifiée système (ECL) ( GE Healthcare, Buckinghamshire, Royaume-Uni).
électrophorétique essai de déplacement de gel de la mobilité (EMSA)
nucléaire et les fractions cytoplasmiques ont été extraites en utilisant NE-PER nucléaire et réactifs cytoplasmiques (Pierce, Rockford, IL), selon les instructions du fabricant. élément de réponse antioxydante (ARE) sonde d'oligonucléotide, 5'-TTT TCT GCT GAG TCA AGG TCC G-3 ', et HIF-1α sonde oligonucléotidique, 5'-TCT GTA CGT GAC CAC ACT CAC CTC-3', a été marqué avec [ ,,,0],γ- 32P] ATP en utilisant la polynucleotide kinase T4 (Promega, Madison, WI) et séparée de non constituée en société [γ- 32P] ATP par filtration sur gel en utilisant une colonne spin nick (GE Healthcare). Avant d'ajouter le 32P-oligonucléotide (1x10 5 cpm), 10 ug d'extrait nucléaire a été maintenu sur de la glace pendant 15 min dans un tampon de liaison de décalage de gel. Afin de déterminer la spécificité de séquence de l'interaction de l'ADN de NF-kB, on a ajouté un excès d'oligonucléotides non marqués. Après 20 min d'incubation à température ambiante, 2 pi de 0,1% de bleu de bromophénol a été ajouté et les échantillons ont été soumis à une électrophorèse à 6% non dénaturant PAGE à 150 V dans une chambre froide. Enfin, les gels ont été séchés et exposés à un film à rayons X (Kodak, Rochester, NY).
Immunocytochimie
cellules traitées dans les diapositives de la chambre ont été fixées par 3,7% de formaldéhyde pendant 15 min. Après lavage, les cellules ont été bloquées dans une solution de BSA à 5% contenant 0,1% de Triton X-100 dans du PBS pendant 1 h à température ambiante, puis incubées avec l'anticorps primaire (1: 100) pendant 12 h à 4 ° C. Les cellules ont ensuite été lavées 3 fois, incubées avec l'anticorps secondaire (1: 300) pendant 1 h, et ensuite avec le 4'-6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, 100 ng /ml) pendant 1 min à température ambiante. Après 3 lavages, les cellules ont été montées avec un réactif antifade Or Prolong (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). La fluorescence a été visualisé sous un microscope confocal à balayage laser (LSM710, Carl Zeiss).
Isolement de l'ARN et la réaction inverse quantitative en chaîne par polymérase (qRT-PCR)
Après traitement, le milieu a été éliminé par aspiration et les cellules ont été lavées avec du phosphate de Dulbecco saline -buffered (DPBS) deux fois. RiboEX (Gene All, Séoul, Corée) a été ajouté à plaques, qui ont ensuite été incubées pendant 10 min à 4 ° C. RiboEX a été recueilli et placé dans un tube de 1,5 ml et le chloroforme a été ajouté et mélangé doucement. Après incubation pendant 10 min dans la glace, les échantillons ont été centrifugés à 10 000 xg pendant 30 min. Les surnageants ont été extraits et mélangés avec de l'isopropanol et les mélanges ont été incubés à 4 ° C pendant 1 h. Après centrifugation à 13000 g pendant 30 min
, culot a été lavé avec 70% (v
/v
) éthanol. Après avoir laissé l'éthanol pour évaporer complètement, pastilles ont été dissoutes dans pyrocarbonate (DEPC) eau -Traité diéthylène (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). L'ADNc a été préparé en utilisant la transcriptase inverse provenant murine leukemia virus Maloney (Promega, Madison, WI), selon les instructions du fabricant. La PCR a été réalisée sur 30 cycles de: 94 ° C pendant 20 s, 58 ° C pendant 30 secondes et 72 ° C pendant 45 secondes. Les amorces oligonucléotidiques pour la PCR (tableau 1) ont été achetés chez Bioneer (Daejeon, Corée). Toutes les expériences qRT-PCR ont été répétées en triple et la quantification a été montré en moyenne ± SD.Table 1 La séquence d'amorces de PCR
GAPDH
Forward 5'-GGT GCT GAG TAT GTC GTG GA -3 '
Inverser 5'-TTC AGC TCT GGG ATG ACC TT-3 '
HO-1
Forward 5'-GAG CAG ATG TCC CAG GAT TT-3'
inverse 5'-GGT TCT GCT TGT TTC GCT CT -3 '
COX-2
Forward 5'-GAA ATG GCT GCA GAG TTG AA -3'
inverse 5'-TCA TCT AGT CTG GAG TGG GA -3 '
HIF-1α
Forward 5'-AAC AAA CAG AAT CTG TCC TC-3 '
inverse 5'-GGT AAT GGA GAC ATT GCC AG-3'
Forward 5'-CAA TGA TGA AGC CCT GGA de VEGF GT-3 '
inverse 5'-GAT TTC TTG CGC TTT CGT TT -3'
PDGF
Forward 5'-AGG AAG CCA TTC GCC CAG TT-3 '
inverse 5'-CTA ACC TCA CCT GGA CCT CT -3 '
bFGF
Forward 5'-TAT GAA GGA AGA TGG ACG GC-3'
inverse 5'-AAC AGT ATG GCC TTC TGT CC -3 '
IL-1β
Forward 5'-CAT TGT GGC TGT GGA GAA G-3 '
inverse 5'-ATC ATC CCA CGA GTC ACA GA -3'
IL-8
Forward 5' CAG ACA GTG GCA GGG ATT CA-3 '
inverse 5'-TTG GGG ACA CCC TTT AGC AT-3'
TNF-α
Forward 5'-TAC TGA ACT TCG GGG TGA TT -3 '
inverse 5'-ACG CCT TCT CCC TTG AAG AG-3 '
ICAM-1
Forward 5'-TGT GCT TTG AGA ACT GTG GC-3'
inverse 5'-GGT TCT GTC CAA CTT CTC AG -3 '
VCAM-1
Forward 5'-GAG ACA AAA CAG AAG TGG AAT-3'
inverse 5'-TAC AAG TGG TCC ACT TAT TTC -3 '
NOX1
Forward 5'-GAG AAA TTC TCG GAA CTG CC-3 '
inverse 5'-TGT TGG CTT CTA CTG TAG CG -3'
In vitro
angiogenèse test
Ce test a été réalisée en utilisant un kit commercial selon les instructions du fabricant (Millipore, Billerica, MA). Pour des conditions hypoxiques, ECMatrix et le tampon de Diluant ont été mélangés pour faire un gel solide, qui a ensuite été plaqué en microplaques 96 puits. les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC, 1,0 x 10 5 /ml) ont été ensemencées avec le contrôle, indométacine, indométacine, plus pantoprazole, indométacine, plus pantoprazole, plus ZnPPIX incubés à 37 ° C pendant 4 h. la formation du tube a été observé sous un microscope optique.
Indomethacin induite modèle de lésions gastriques
Un total de 48 rats ont été achetés chez Charles River (Osaka, Japon). Les animaux ont été traités dans une animalerie accrédité conformément à l'Association pour l'évaluation et l'accréditation des animaux de laboratoire Care International (AAALAC International) des lignes directrices dans le cadre du centre nommé CACU (Le Centre de soins et de l'utilisation des animaux) de Lee Gil Cancer Ya et Diabetes Institute, Gachon Université après l'approbation du Conseil d'examen éthique institutionnelle. Les animaux ont été divisés en quatre groupes constitués chacun de 12 rats et ont été privés de nourriture pendant 24 heures avant l'expérimentation de la manière suivante; tous les rats ont reçu une injection intrapéritonéale de l'indométhacine (10 mg /kg) pour provoquer des dommages gastriques, deuxième groupe avec une injection intrapéritonéale de 10 mg /kg de pantoprazole, le troisième groupe avec une injection intrapéritonéale de 30 mg /kg de pantoprazole, et le quatrième groupe à injection intrapéritonéale de 30 mg /kg de pantoprazole et 5 mg /kg de ZnPPIX pour inhiber l'activité de la HO-1. Les animaux ont été sacrifiés 16 h après chaque administration. Les estomacs des rats ont été prélevés et ouverts le long de la grande courbure et ensuite lavées avec des solutions tamponnées au phosphate froid de la glace. Le nombre de soit érosions ou des ulcères ont été déterminées dans les photographies agrandies. Broyats obtenus à partir de la muqueuse gastrique rayé ont été maintenus dans un réservoir d'azote liquide jusqu'à l'analyse. Les résultats de ce membre analyse statistique sont exprimés par la moyenne ± écart-type. Les données ont été analysées par ANOVA à une voie, et la signification statistique entre les groupes a été déterminée par un test de gamme multiple de Duncan. La signification statistique a été acceptée à P
< Résultats de 0,05.
Pantoprazole augmenté HO-1 expression par Nrf2 activation
Basé sur une étude préliminaire, nous avons trouvé le pantoprazole a montré la plus forte induction de HO-1 expression dans RGM-1 cellules entre PPIs, lansoprazole, rabéprazole , l'oméprazole, le pantoprazole et (données non représentées). Pantoprazole a augmenté l'expression de la HO-1 ARNm et de protéine dans une relation dose-dépendante manière (figure 1A) et l'analyse par immunocytochimie a révélé que le niveau de la HO-1 est significativement augmentée par un traitement de pantoprazole dans le cytoplasme des RGM-1 des cellules dans une dose de façon dépendante (figure 1B). Pour comprendre les mécanismes sous-jacents de la régulation à la hausse de HO-1 expression par pantoprazole, nous avons examiné ses effets sur l'activation de Nrf2, un facteur de transcription majeur qui médie l'expression ARE /EPRE axée sur des enzymes antioxydantes. Quand on a mesuré le niveau de KEAP1 d'expression, un répresseur de Nrf2 dans la fraction cytoplasmique traitées avec 300 uM de pantoprazole en un point temporel différent significativement diminué l'expression de Keap1 a été observée dans 1 h (figure 2A), ce qui suggère que la HO-1 peut être transcrit après le traitement pantoprazole par l'activation Nrf2 et Keap1 inactivation. Comme cela est illustré sur la figure 2A, Nrf2 co-localisation nucléaire était évidente dans RGM-1 des cellules traitées avec le pantoprazole. Le maximum SONT-obligatoire activité de Nrf2 a été augmentée en 1 h, ainsi que sa localisation nucléaire induites par le pantoprazole (figure 2B). Pour déterminer l'accumulation nucléaire de Nrf2, nous avons effectué une analyse immunocytochimique en utilisant l'anticorps anti-Nrf2. Comme on le voit sur la figure 2C, Nrf2 est transloqué dans le noyau avec 300 pM de traitement pantoprazole. Ces résultats constamment suggéré que le pantoprazole pourrait augmenter HO-1 niveaux grâce à l'activation transcriptionnelle de Nrf2 dans les cellules épithéliales gastriques chez le rat. Figure 1 Pantoprazole induit l'expression de HO-1. (A) RT-PCR et transfert de Western pour HO-1 expression selon différentes doses de pantoprazole, 30, 100 et 300 uM, respectivement. Ces chiffres sont représentatifs des résultats obtenus dans 3 expériences indépendantes. (B) d'imagerie confocale de la HO-1. Pantoprazole a augmenté l'expression de la HO-1 d'une manière dépendante de la dose dans la muqueuse gastrique de rat normal des cellules RGM-1.
Figure 2 pantoprazole augmente la translocation nucléaire de Nrf2 et cytoplasmiques KEAP1 inactivation conduit à anti-oxydation significative. (A) Western blots soit pour Keap1 cytosolique ou nucléaire de Nrf2 à un moment différent, en présence de 300 pM pantoprazole. (B) électrophorétique essai de décalage de mobilité (EMSA) pour l'activité de liaison sont-ADN. Une augmentation significative de liaison à l'ADN de Nrf2 a été noté 60 minutes après l'administration du pantoprazole. (C) confocale imagerie de Nrf2 après différentes doses de pantoprazole, 100 uM et 300 uM. résonance de spin (D) électronique (ESR) de mesure pour Fenton réaction généré par les radicaux hydroxyles. (E) Les changements de DCF-DA fluorescence après différents dosage de pantoprazole, 30, 100, et 300 uM. Pantoprazole a diminué de manière significative la fluorescence par oxydation induite par H2O2.
Etant donné que l'importance biologique de la HO-1 pantoprazole possède une action anti-oxydantes associées à l'induction de HO-1. mesure ESR était ultime moyen de retracer la génération de radicaux libres à l'aide de spin produit d'addition, pour lesquels nous avons généré des radicaux hydroxyles utilisant DMPO comme un adducteur sous réaction de Fenton. Comme on le voit sur la figure 2D, mM pantoprazole 3 exerce une action de balayage claire de DMPO produit d'addition générant des radicaux hydroxyles. Comme la mesure ESR a été exécuté dans un état de réaction chimique système non biologique et pantoprazole est pas un antioxydant professionnel, il a certainement contribué à piéger les radicaux hydroxyles, même si elle est relativement forte concentration de pantoprazole à piéger les espèces réactives de l'oxygène. Ces résultats chimiques de l'étude ESR ont ensuite été validés par test biologique utilisant DCF-DA mesure de fluorescence, montrant que le pantoprazole a montré une réduction significative DCF-DA d'une manière dose-dépendante (P
< 0,05, figure 2E).
actions angiogéniques conséquente à induite par pantoprazole-HO-1
IPP a augmenté l'expression de l'ARNm du VEGF et de protéines dans RGM-1 cellules (figure 3A). Afin de documenter si l'induction incrémentale du VEGF avec les IPP est lié à HO-1 induction, nous avons répété les expériences avec PPI seul ou co-traitement de pantoprazole et protoporphyrine de zinc (ZnPPIX) HO-1 inhibiteur. En tant que résultat, nous avons pu confirmer l'expression de VEGF induite par le pantoprazole et le co-traitement incrémentiel de ZnPPIX nettement diminué l'expression de VEGF induite par l'IPP d'une manière dépendante de la dose (figure 3B). Ensuite, nous avons étudié les changements de facteurs représentatifs angiogéniques, bFGF, PDGF et HIF-1α et observé ces expressions se rapportant à HO-1 dans la figure 3C induite par pantoprazole. Comme prévu, le pantoprazole a considérablement augmenté ces expressions de plusieurs facteurs angiogéniques. Aussi ces inductions de bFGF et PDGF ont été considérablement atténuées avec le co-traitement de pantoprazole et ZnPPIX. Afin de vérifier si ces inductions de facteur angiogénique après pantoprazole ont été effectivement liés à l'angiogenèse, l'angiogenèse in vitro
test a été fait (Figure 3D). la formation du tube a été significativement atténuée avec 500 uM indométacine dans HUVEC, tandis que 100 uM pantoprazole pourrait surmonter ces troubles de l'angiogenèse traité avec l'indométacine. Cependant, le traitement supplémentaire avec ZnPPIX aboli ces avantages de surmonter l'angiogenèse par pantoprazole sous administration de l'indométacine. Ces résultats suggèrent que les AINS pantoprazole compensée induite par angiogenèse défectueuse grâce à sa capacité d'induction de la HO-1. Figure 3 Pantoprazole induit des facteurs angiogéniques liés à HO-1 induction. (A) RT-PCR et transfert de Western pour le VEGF. inductions importantes de VEGF ont été observées avec le pantoprazole, de manière significative après 300 uM pantoprazole (p < 0,05
). Ces chiffres sont représentatifs des résultats obtenus dans 3 expériences indépendantes. (B) Les changements de VEGF et HO-1 avec pantoprazole seul ou combinaison de pantoprazole et ZnPPIX. L'induction de VEGF après pantoprazole a été significativement atténuée avec HO-1 inhibiteur, ce qui signifie l'implication de HO-1 dans VEGF PPI-induite. Ces chiffres sont représentatifs des résultats obtenus dans 3 expériences indépendantes. (C) Autres facteurs angiogéniques liés à pantoprazole. bFGF et VEGF a été de plus en plus exprimé avec le pantoprazole, mais ces inductions ont été atténuées avec HO-1 inhibiteur. Ces chiffres sont représentatifs des résultats obtenus dans 3 expériences indépendantes. (D) in vitro
angiogenèse test in. la formation du tube de HUVEC a été significativement diminuée avec 50 uM indométacine. Pantoprazole compensée angiogenèse induite par défaut indométhacine évaluée avec le pourcentage de formation de tubes, alors que la HO-1 inhibiteur annulation de ceux-ci surmontent l'angiogenèse induite par le pantoprazole. Ces chiffres sont représentatifs des résultats obtenus dans 3 expériences indépendantes.
Agression pantoprazole induite par l'indométhacine associé HO-1 atténué inflammatoire
Bien que l'indométacine est un agent anti-inflammatoire, il a été connu que les AINS lésions gastriques induites par l'augmentation des expressions de médiateurs inflammatoires, comprenant le TNF-α, IL-1β, IL-8 et de la NADPH oxydase 1 (NOX-1). Comme on le voit sur la figure 4A, 500 uM d'indométhacine a considérablement augmenté l'expression de TNF-α, IL-1β et IL-8 dans les cellules epitheliales gastriques, alors qu'il diminue l'expression de la HO-1, ce qui confirme que les médiateurs de l'inflammation peuvent être mécaniquement associés à indométhacine induit des lésions des cellules épithéliales gastriques. Dans cette condition, la co-administration de 500 uM d'indométhacine et 300 uM pantoprazole a diminué de manière significative l'expression de TNF-α, IL-1β et IL-8 accompagnés d'une augmentation statistiquement significative de l'expression de la HO-1. En outre, le défi indométacine a augmenté de manière significative les expressions de NOX-1, dans lequel le pantoprazole atténué de façon significative l'expression accrue de NOX-1, suggérant que HO-1 des actions anti-inflammatoires induites par le pantoprazole imposées en vertu de l'indométacine. Ensuite, afin de prouver en outre si ces atténuations de médiateurs inflammatoires après pantoprazole sont résultaient de HO-1 induction, nous avons répété ces expériences avec l'administration ZnPPIX. Comme on le voit sur la figure 4B, le co-traitement des ZnPPIX en présence du pantoprazole supprimé de manière significative les avantages d'une action anti-inflammatoire. Les inductions supplémentaires de ICAM-1 et VCAM après traitement indométacine étaient responsables de l'ischémie et d'organes graves dommages, dans lequel soit l'inflammation vasculaire ou de l'agrégation leucocytaire accrue a été engagé. Le traitement avec l'indométhacine a considérablement augmenté l'expression d'ICAM-1 et VCAM dans HUVEC, mais co-challenge de l'indométacine et le pantoprazole a diminué de manière significative induite par l'indométhacine-ICAM-1 expression correspondant à une augmentation de l'induction de la HO-1 (figure 4C). Dans cette condition, ZnPPIX n'a ​​pas imposé l'atténuation de l'ICAM ou VCAM en dépit du traitement pantoprazole, assurant en outre l'action de bénéficiaire de pantoprazole associé à HO-1 induction. Figure 4 Pantoprazole atténuée médiateurs inflammatoires induite indométhacine par HO-1. (A) RT-PCR pour le TNF-α, IL-1β, IL-8, et HO-1. 500 pM d'indométhacine ont augmenté l'expression de médiateurs inflammatoires, comprenant le TNF-α, IL-1β, IL-8, mais a diminué de manière significative l'expression de HO-1. NOX-1 a été augmenté de façon significative avec l'indométacine. Ces chiffres sont représentatifs des résultats obtenus dans 3 expériences indépendantes. (B) Pantoprazole a diminué de manière significative induite par l'indométacine-IL-1β et de TNF-α, mais ces actions bénéficiaires de pantoprazole ont été supprimés avec ZnPPIX, conduisant à la conclusion que les actions anti-inflammatoires de pantoprazole étaient dues à HO-1 induction. Ces chiffres sont représentatifs des résultats obtenus dans 3 expériences indépendantes. (C) Pantoprazole a diminué de manière significative induite par l'indométacine-ICAM-1 et VCAM dans les cellules HUVEC, mais ces actions bénéficiaires de pantoprazole ont également été aboli avec ZnPPIX comme HO-1 inhibiteur. Ces chiffres sont des représentants des résultats obtenus dans 3 expériences indépendantes.
Pantoprazole induite par HO-1 induite par l'indométacine-affaibli lésions gastriques
Pour étudier l'effet protecteur de pantoprazole in vivo
, indométacine (10 mg /kg ) a été administré par voie intrapéritonéale pendant 16 heures chez le rat. Le traitement par l'indométhacine a provoqué de manière significative les blessures de la muqueuse gastrique, y compris les érosions hémorragiques et des ulcérations. Cependant, ces pathologies gastriques provoquées par indométacine ont été sensiblement atténués par injection intrapéritonéale de 30 mg /kg de pantoprazole (figure 5A). Étant donné que ces effets protecteurs de 30 mg /kg de pantoprazole contre les dommages gastriques induites par l'indométhacine ont été significativement supprimée avec le co-traitement de intrapéritonéale administré 5 mg /kg ZnPPIX, nous avons confirmé que l'action protectrice du pantoprazole est basé sur sa capacité de la HO-1 par induction . Quand l'expression de la HO-1 et ICAM-1 ont été mesurés dans des homogénats de la muqueuse de chaque groupe, l'administration d'indométhacine a diminué de manière significative l'expression de la HO-1 et a augmenté l'expression d'ICAM-1. Cependant, en raison de l'augmentation HO-1 expressions après pantoprazole, ainsi que des niveaux significativement atténués de ICAM-1, lésions gastriques induites par l'indométhacine a été proportionnellement améliorée en dépit de défi indométacine (figure 5B). Pour démontrer comment pantoprazole amélioré l'angiogenèse défectueuse et de l'ischémie provoquée par l'indométacine, l'EMSA utilisant HIF-1α a été réalisée (Figure 5C). La-1α-ADN HIF activité de liaison a été fortement augmenté dans le groupe seul indométacine, qui était significativement diminuée dans les homogénats gastriques du groupe de traitement pantoprazole, signifiant pantoprazole état hypoxique considérablement soulagé induite par l'indométacine. Pris ensemble, les IPP ont exercé une forte protection contre les lésions de la muqueuse gastrique induite par l'indométacine-through significative HO-1 induction, qui est au-delà authentique action suppressive de l'acide, bien que nous ne mesurons pas les changements de l'acidité gastrique. La figure 5 pantoprazole empêche l'lésions gastriques induites par l'indométhacine par fonction sur l'induction de HO-1. (A) l'indice moyen des dommages gastriques induites par l'indométhacine. (B) RT-PCR pour HO-1 et ICAM-1 en fonction du groupe. (C) EMSA pour HIF-1α selon le groupe. Indomethacin Discussion
a augmenté considérablement-1α-ADN HIF liaison, alors que le pantoprazole a diminué significativement-1α-ADN HIF liaison d'une manière dose-dépendante.
Avant l'enquête en cours, plusieurs chercheurs ont publié que les IPP pourraient prévenir les blessures de la muqueuse gastrique par d'autres mécanismes au-delà de l'action de son inhibition spécifique de l'acide [11, 14, 25-28], nous pourrions ajouter plus de preuves concernant des mesures de protection des IPP contre les AINS. Pantoprazole a induit significativement l'expression de la HO-1 par l'activation Nrf2 pertinente pour l'anti-inflammatoire, anti-oxydantes et soulager l'ischémie actions. conclusion Novel de cette étude diffère des autres enquêtes est que le pantoprazole montre des mesures de protection à la blessure des AINS induite soit par la correction du handicap angiogénique ou l'atténuation de l'inflammation propension.
Becker JC et al.
[16] ont démontré que les deux oméprazole et lansoprazole protégés des cellules épithéliales et endothéliales gastriques humaines contre le stress oxydatif similaire à notre étude, mais utilisé différents types d'IPP. Puisque cet effet a été abrogée en présence de l'inhibiteur de HO-1, ZnPPIX, HO-1 semble être une bonne cible des IPP dans les deux endothéliales et les cellules épithéliales gastriques. Dans cette étude, nous avons observé intacte nouvelle découverte que HO-1 induite par les IPP a diminué AINS-engagés inflammation et trouble angiogénique. Takagi T et al.
[25] ont également étudié le rôle de Nrf2, sa phosphorylation /activation, et l'oxydation des Keap1 dans HO-1 jusqu'à la régulation en utilisant même lignée cellulaire avec nous, RGM-1 des cellules induites par le lansoprazole. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

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