Een mogelijke betrokkenheid van Nrf2-gemedieerde heem oxygenase-1 up-regeling in beschermende effect van de protonpompremmer pantoprazol tegen-indomethacine geïnduceerde maagschade in rats

Een mogelijke betrokkenheid van Nrf2-gemedieerde heem oxygenase-1 up-regeling in beschermende effect van de protonpompremmer pantoprazol tegen-indomethacine geïnduceerde maag- schade bij ratten
Abstracte achtergrond
proton pomp is een integraal membraaneiwit dat is alomtegenwoordig ATP binding cassette (ABC) betrokken bij vele transportprocessen in alle levende organismen, onder die een gespecialiseerde vorm van de pomp, de zogenaamde p
type proton pomp, bestaat in de pariëtale cellen van de maag. Hoewel protonpompremmers (PPI) vaak voorgeschreven om te voorkomen dat niet-steroïdale anti-inflammatoire geneesmiddelen (NSAID's) geïnduceerde gastrische schade kan het zuur onderdrukkende maatregelen niet voldoende te leggen.
Methods
Om de effecten van pantoprazol documenteren één van protonpompremmers, op de NSAID-geïnduceerde gastrische schade in vitro en in vivo

werden uitgevoerd. Immunocytochemie, Western blotanalyse elektroforetische mobiliteit verschuiving assay en RT-PCR werd uitgevoerd om de inductie van heem oxygenase-1 (HO-1) tot Nrf2 activatie in normale maagslijmvlies RGM-1 cellen of in vivo
maag weefsels evalueren ratten behandeld met indomethacine en /of pantoprazol.
Resultaten
pantoprazol actieve Nrf2 tot inactivatie van Keap1, waarna de expressie van HO-1 sterk op een dosis-afhankelijke wijze werd verhoogd RGM-1 cellen. Verhoogde ARE-DNA bindingsactiviteit werd maximaal waargenomen na 1 uur met 300 pM van pantoprazol. De expressie van HO-1 geïnduceerd door pantoprazol was significant geassocieerd met de verhoogde in vitro
buisvorming (P
< 0,05) en angiogene factoren, waaronder VEGF, bFGF, en HIF-1α. Indomethacine duidelijk toegenomen uitingen van TNF-α, IL-1ß, IL-8, NOX-1, ICAM-1 en VCAM, dat pantoprazol significant af uitingen van indomethacine geïnduceerde deze ontstekingsmediatoren in overeenstemming met pantoprazol geïnduceerde HO-1 (P Restaurant < 0,05) zoals gedocumenteerd met HO-1-remmer. In vivo model van
indomethacine geïnduceerde gastrische schade kan valideren in vitro
-drawn resultaten die opmerkelijk pantoprazol beschermd tegen door indomethacine geïnduceerde gastrische schade, waarbij zink protoporfyrine (5 mg /kg, ip
) aanzienlijk afgeschaft de beschermende werkzaamheid van pantoprazol.

Conclusie Deze resultaten demonstreren dat Nrf2-gemedieerde HO-1 inductie van protonpompremmers leverde een significant beschermend effect tegen door NSAID geïnduceerde gastrische schade dan zuuronderdrukkende acties.
Sleutelwoorden
Heme oxygenase-1 protonpompremmer NSAID-geïnduceerde gastropathy Nrf2 Achtergrond
NSAID's hebben enorme recept volumes voornamelijk gebaseerd op de volgende twee voordelen, een is een stijging van de leeftijd van de patiënten noodzakelijk NSAIDs recept degeneratieve-verandering veroorzaakte pijn te verlichten en de andere is een extra proces voor zowel de preventie van darmpoliepen of de ontsnapping van ischemische hart- en vaatziekten [1, 2]. Echter, de uitgestrekte gebruik van NSAID beperkt door vervelende bijwerkingen zoals de gastrische erosie /ulcus bemoeilijkt bloedingen zweren en ernstigere complicaties in de dunne darm en colon. Daar de farmacologische werking van NSAIDs is door de remming van prostaglandine (PG) -synthese via de onderdrukking van cyclooxygenase (COX) [3], te onderscheiden vermindering van gastrobeschermende prostaglandine E 2 (PGE 2) is verantwoordelijk voor deze gastrointestinale (GI) bijwerkingen. Hoewel de uitvinding van selectieve COX-2 inhibitor, coxib, GI veiligheid te waarborgen heeft als de oplossing strategie voorgesteld, deze oplossing moet ook verbeteren. Hoewel NSAID's gebruikt worden als krachtige anti-ulcer middelen, extra onbedekte mechanismen van toxiciteit NSAID [4, 5] ons tot sterkere en veiligere middelen te ontwikkelen.
In de huidige tijd, de beste keuze voor het voorkomen van NSAID-gerelateerde GI toxiciteit of de combinatie van NSAIDs en protonpompremmers (PPI) of de keuze van coxibs [6, 7]. Omdat de genezing tarief van GI zweren bij continu gebruik van NSAID's was groter in PPI-groep dan het type histamine 2-receptor antagonist (H2-RA) groep, PPI's zijn voorkeur dan H2-RA om te gaan met het nadelige effect van NSAID's [8, 9 ]. Naast fundamentele zuuronderdrukkende acties van protonpompremmers, meerdere functies zijn geopenbaard ter beperking van de pro-apoptotische signalering, zuur-onafhankelijk herstel van prolifererende en reparatie pathways [10], een vermindering van mucosale oxidatieve schade, genezing bevorderende werking en endoplasmatisch reticulum zijn stress verlichten mechanisme [11-16]. Hahm et al.
[17-19] hebben ook gemeld dat PPI's tonen het potentieel werkzaamheden als antikanker therapieën gebaseerd op de selectieve inductie van apoptose, anti-angiogenese tegen Helicobacter pylori
geassocieerde carcinogenese, en directe anti-mutagene acties tijdens het ontstaan ​​van tumoren. Maar de mechanismen verantwoordelijk voor de beschermende effecten van protonpompremmers in NSAID-geïnduceerde gastrische schade nog worden vastgesteld.
Heme oxygenase-1 (HO-1), een induceerbare de eerste en snelheidsbepalende enzym heem degradatie, is bekend te beschermen tegen de cytotoxiciteit van oxidatieve stress en apoptotische celdood en ontsteking [20, 21]. Fundamentele beschermende effecten van HO-1 tegen ontstekingen worden gemedieerd via antioxidatieve heem degradatie, maar ook bij de productie van de anti-inflammatoire mediatoren, waarvan redox-afhankelijke transcriptionele activator, NF-E2-gerelateerde factor 2 (Nrf2) en haar fosforylering /activering, en oxidatie van Kelch-like-ECH associëren eiwit 1 (Keap1) wordt mechanistisch voorgesteld [22-24]. Aangezien de expressie van HO-1 werd geïnduceerd door anti-oxidatieve, anti-inflammatoire en ischemische verlichten reacties in de huidige studie, veronderstelden we dat de beschermende effecten van protonpompremmers tegen door NSAID geïnduceerde gastrische schade kan worden gerelateerd aan HO-1 en de daaruit voortvloeiende angiogenese daarbuiten aangeboren zuur onderdrukking. In totaal tonen onze resultaten aan de nieuwe mechanismen die PPI induceren de expressie van HO-1 tot activerende Nrf2 /inactiverende Keap1 samen met de beloning van ischemische veranderingen en de verzwakking van inflammatoire mediatoren, waardoor bescherming tegen door indomethacine geïnduceerde gastrische schade vergemakkelijken.
methoden
Materialen en celculturen
Indometacine werd gekocht bij Sigma Aldrich (Saint Louis, MO) en pantoprazol werd voorzien van Amore Pacific Pharmaceutical Co. (Seoul, Korea). Antilichamen voor β-actine, HO-1, α-tubuline, Keap1, Nrf2 en VEGF werden alle verkregen van Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Normale rat maagslijmvlies RGM-1 cellen door Prof. Hirofumi Matsui, MD, PhD (Tsukuba Univ., Japan), werden gekweekt in gemodificeerd Eagle's medium van Dulbecco (DMEM) dat 10% (v
/v
) foetaal bovien serum, 100 U /ml penicilline. Menselijke navelstreng vasculaire endotheliale cellen (HUVEC) werden gekweekt in M199 medium (InnoPharma Screen, Seoul, Korea). Cellen werden bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO 2 gehandhaafd. Geschikte hoeveelheden RGM-1 cellen of HUVECs werden gezaaid en gedurende 24 uur, vervolgens werden ze behandeld met de aangegeven dosis pantoprazol of indomethacine en geïncubeerd gedurende de aangegeven tijden. HUVEC's werden naar 1% O 2 en 5% CO 2 hypoxie kamer en gedurende 0-12 uur voor de in vitro
buisvorming assay.
Elektronspinresonantie (ESR) spectroscopie en ROS generatie meting
Verschillende concentraties van pantoprazol toegevoegd tot een totaal volume van 200 ul bevattende 0,05 mM FeSO 4, 1 mM H 2O 2, 1 mM 5,5-dimethylpyrroline-N-oxide (DMPO, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en 50 mM natriumfosfaat bij pH 7,4 bij kamertemperatuur. Reacties werden geïnitieerd door toevoeging van H 2O 2. Na incubatie gedurende 1 min, werden hoeveelheden van de reacties overgebracht in een kwarts cel en het spectrum van DMPO-OH werd onderzocht met behulp van een ESR spectrofotometer (JES-TE300, JEOL, Tokyo, Japan) onder de volgende voorwaarden: magneetveld, 338,0 ± 5,0 mT; magnetron macht, 4,95 mW; frequentie, 9.421700 GHz; modulatie amplitude, 5 mT; sweep tijd, 0,5 min; en de tijd constant, 0,03 s. Cellulaire ROS inhoud werd gemeten door incubatie van de bestrijding of pantoprazol behandeld RGM-1 cellen met 10 uM H 2DCF-DA (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) gedurende 30 min. Fluorescentie werd gemeten met een laser confocale microscoop (LSM710, Carl Zeiss, Oberkochen, Duitsland).
Western blotanalyse
Bewerkte cellen tweemaal met PBS gewassen en vervolgens gelyseerd in ijskoude lysis buffer cellen (Cell Signaling Technology) bevattende 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF, Sigma Aldrich). Eiwitten in lysaten werden gescheiden door SDS-PAGE en overgebracht op polyvinylideen fluoride (PVDF) membranen die werden geïncubeerd met primaire antilichamen, gewassen, geïncubeerd met peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen, nagewassen en vervolgens gevisualiseerd met een versterkte chemiluminescentie (ECL) systeem ( GE Healthcare, Buckinghamshire, UK).
Elektroforetische mobiliteit gel shift assay (EMSA)
nucleaire en cytoplasmatische fracties werden geëxtraheerd met behulp van NE-PER nucleaire en cytoplasmatische reagentia (Pierce, Rockford, IL), volgens de instructies van de fabrikant. Antioxidantreactie element (ARE) oligonucleotideprobe 5'-TTT TCT GCT GAG TCA AGG TCC G-3 'en HIF-1α oligonucleotideprobe 5'-TCT GTA CGT GAC CAC CAC ACT CTC-3', werd gemerkt met [ ,,,0],γ- 32P] ATP onder toepassing van T4 polynucleotidekinase (Promega, Madison, WI) en gescheiden van niet opgenomen [γ- 32P] ATP door middel van gelfiltratie onder toepassing van een nick spinkolom (GE Healthcare). Voor het toevoegen van de 32P-oligonucleotide (1x10 5 cpm), 10 ug van de nucleaire extract op ijs werd gehouden gedurende 15 min in gel shift bindingsbuffer. De sequentiespecificiteit van de NF-kB DNA-interactie bepalen, een overmaat ongelabelde oligonucleotiden toegevoegd we. Na 20 min incubatie bij kamertemperatuur werd 2 pl 0,1% broomfenolblauw toegevoegd en monsters werden geëlektroforeerd over 6% niet-denaturerende PAGE bij 150 V in een koude kamer. Tenslotte werden gels gedroogd en blootgesteld aan röntgenfilm (Kodak, Rochester, NY).
Immunocytochemie
Bewerkte cellen in kamer glaasjes werden gefixeerd met 3,7% formaldehyde gedurende 15 minuten. Na wassen werden de cellen geblokkeerd in 5% BSA-oplossing die 0,1% Triton X-100 in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, en vervolgens geïncubeerd met primair antilichaam (1: 100) gedurende 12 uur bij 4 ° C. Cellen werden daarna 3 keer, geïncubeerd met secundair antilichaam (1: 300) gedurende 1 uur gewassen en daarna met 4'-6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, 100 ng /ml) gedurende 1 min bij kamertemperatuur. Na 3 keer wassen werden cellen gemonteerd Verleng Gold antifade reagens (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Fluorescentie werd gevisualiseerd onder een confocale laser microscoop (LSM710, Carl Zeiss).
RNA-isolatie en kwantitatieve reverse transcriptie polymerase kettingreactie (qRT-PCR)
Na de behandeling werd het medium afgezogen en de cellen werden gewassen met Dulbecco's fosfaat -buffered zoutoplossing (DPBS) tweemaal. RiboEX (Gene All, Seoul, Korea) werd toegevoegd aan platen, die vervolgens werden geïncubeerd gedurende 10 min bij 4 ° C toegevoegd. RiboEX werd geoogst en in een 1,5 ml buis en chloroform werd toegevoegd en voorzichtig gemengd. Na incubatie gedurende 10 min op ijs werden de monsters gecentrifugeerd bij 10.000 xg gedurende 30 min. Supernatanten werden verwijderd en gemengd met isopropanol en mengsels werden gedurende 1 uur geïncubeerd bij 4 ° C. Na centrifugeren bij 13.000 g gedurende 30 min
werd pellet gewassen met 70% (v
/v
) ethanol. Nadat men de ethanol volledig verdampt, werden pellets opgelost in di-carbonaat (DEPC) behandeld water (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). cDNA werd bereid met behulp van reverse transcriptase afkomstig van muizen Maloney leukemievirus (Promega, Madison, WI) volgens de instructies van de fabrikant. PCR werd uitgevoerd over 30 cycli van: 94 ° C gedurende 20 seconden, 58 ° C gedurende 30 sec en 72 ° C gedurende 45 sec. Oligonucleotide primers voor PCR (Tabel 1) werden gekocht bij Bioneer (Daejeon, Korea). Alle qRT-PCR-experimenten werden herhaald in drievoud en kwantificering werd getoond in gemiddelde ± SD.Table 1 De sequentie van PCR-primers
GAPDH
Forward 5'-GGT GCT GAG TAT GTC GTG GA -3 '
Reverse 5'-TTC AGC TCT GGG ATG ACC TT-3 '
HO-1
Forward 5'-GAG AGC ATG TCC CAG GAT TT-3'
Reverse 5'-TCT GGT GCT TGT TTC GCT CT -3 '
COX-2
Forward 5'-GAA ATG GCT GCA GAG TTG AA -3'
Reverse 5'-TCA TCT AGT CTG GAG TGG GA -3 '
HIF-1α
Forward 5'-AAC AAA CAG AAT CTG TCC TC-3 '
Reverse 5'-AAT GGT GGA GAC ATT GCC AG-3'
VEGF
Forward 5'-CAA TGA TGA AGC CCT GGA GT-3 '
Reverse 5'-GAT TTC TTG CGC TTT CGT TT -3'
PDGF
Forward 5'-AGG AAG CCA TTC CCG CAG TT-3 '
Reverse 5'-CTA ACC TCA CCT GGA CCT CT -3 '
bFGF
Forward 5'-TAT GAA GGA AGA TGG ACG GC-3'
Reverse 5'-AAC AGT ATG GCC TTC TGT CC -3 '
IL-1β
Forward 5'-CAT TGT GGC TGT GGA GAA G-3 '
Reverse 5'-ATC ATC CCA CGA GTC ACA GA -3'
IL-8
Forward 5' CAG ACA GTG GCA GGG ATT CA-3 '
Reverse 5'-TTG GGG ACA CCC TTT AGC AT-3'
TNF-α
Forward 5'-TAC TGA ACT TCG GGG TGA TT -3 '
Reverse 5'-CCT CAG TCT CCC TTG AAG AG-3 '
ICAM-1
Forward 5'-GCT TGT TTG AGA ACT GTG GC-3'
Reverse 5'-GGT TCT GTC CAA CTT CTC AG -3 '
VCAM-1
Forward 5'-GAG ACA AAA CAG AAG TGG AAT-3'
Reverse 5'-TAC AAG TGG TCC ACT TAT TTC -3 '
Nox1
Forward 5'-GAG AAA TTC TCG GAA CTG CC-3 '
Reverse 5'-TGT TGG CTT CTA CTG TAG CG -3'
In vitro
angiogenese assay Inloggen Deze test werd uitgevoerd met een commerciële kit volgens instructies van de fabrikant (Millipore, Billerica, MA). Voor hypoxische omstandigheden ECMatrix en verdunningsbuffer werden gemengd tot een vaste gel, die vervolgens werd uitgeplaat in 96 putjes maken. Humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC, 1,0 x 10 5 /ml) werden geënt met controle, Indomethacin, indomethacine plus pantoprazol, indomethacine plus pantoprazol plus ZnPPIX geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 4 uur. Tube formatie werd waargenomen onder een lichtmicroscoop.
Indomethacin-geïnduceerde maagschade model
Een totaal van 48 ratten werden gekocht van Charles River (Osaka, Japan). De dieren werden behandeld in een geaccrediteerde dier faciliteit in overeenstemming met de Vereniging voor evaluatie en accreditatie van Laboratory Animal Care International (AAALAC International) richtsnoeren in het kader van de faciliteit met de naam CaCu (Het Centrum van de Animal Care en gebruik) van Lee Gil Ya Kanker en Diabetes Instituut, Gachon University na Institutional Ethics review Board goedkeuring. De dieren werden verdeeld in vier groepen die elk bestaan ​​uit 12 ratten en waren als volgt uitgehongerd gedurende 24 uur vóór het experiment; Alle ratten werden toegediend met intraperitoneale injectie van indomethacine (10 mg /kg) tegen gastrische schade tweede groep met intraperitoneale injectie van 10 mg lokken /kg pantoprazol, de derde groep met intraperitoneale injectie van 30 mg /kg pantoprazol en vierde groep intraperitoneale injectie van 30 mg /kg pantoprazol en 5 mg /kg ZnPPIX om de activiteit van HO-1 remmen. De dieren werden gedood 16 uur na elke toediening. De maag van ratten werden verwijderd en geopend langs de grotere kromming en vervolgens gewassen met ijs- koude met fosfaat gebufferde oplossingen. Het aantal of erosies of zweren werden bepaald onder de vergrote foto. Homogenaten verkregen van krassen maagslijmvlies werden in vloeibare stikstof tank tot de bepaling bewaard.

Statistische analyse Resultaten worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD. Gegevens werden geanalyseerd door one-way ANOVA en de statistische significantie tussen de groepen werd bepaald door meerdere trajecttest Duncan. Statistische significantie werd bij P Restaurant <aanvaard; 0.05.
Resultaten
Pantoprazol toegenomen HO-1 expressie door middel van Nrf2 activering
Op basis van vooronderzoek, we hebben gevonden pantoprazol toonde de hoogste inductie van HO-1 expressie in RGM-1-cellen onder de PPI, lansoprazol, rabeprazol omeprazol en pantoprazol (gegevens niet getoond). Pantoprazol verhoogde de expressie van HO-1 mRNA en eiwit in een dosis-afhankelijke wijze (Figuur 1A) en immunocytochemische analyse toonde ook aan dat het niveau van HO-1 significant van pantoprazol behandeling werd verhoogd in het cytoplasma van RGM-1-cellen op een dosis afhankelijke wijze (Figuur 1B). Om de mechanismen die ten grondslag liggen aan de up-regulatie van HO-1 expressie door pantoprazol begrijpen onderzochten we de effecten ervan op de activering van Nrf2, een belangrijke transcriptiefactor die de ARE /EpRE-driven expressie van antioxidant enzymen bemiddelt. Toen we het expressieniveau van KEAP1 gemeten, een repressor van Nrf2 in cytoplasmatische fractie behandeld met 300 uM pantoprazol in een ander tijdstip, significant verminderde expressie van Keap1 werd waargenomen in 1 h (figuur 2A), wat suggereert dat HO-1 kan worden getranscribeerd na pantoprazol behandeling door middel van Nrf2 activering en Keap1 inactivatie. Zoals geïllustreerd in figuur 2A, Nrf2 kern co-lokalisatie bleek uit RGM-1 cellen behandeld met pantoprazol. De maximale ZIJN bindingsactiviteit van Nrf2 verhoogd in 1 h en zijn nucleaire lokalisatie geïnduceerd door pantoprazol (figuur 2B). De nucleaire accumulatie van Nrf2 bepalen, voerden we een immunocytochemische analyse met anti-Nrf2 antilichaam. Zoals getoond in Figuur 2C, werd Nrf2 translocatie in de kern met 300 pM pantoprazol behandeling. Deze resultaten suggereerden dat consistent pantoprazol HO-1 niveaus kan verhogen door transcriptionele activatie van Nrf2 bij ratten maagepitheelcellen. Figuur 1 pantoprazol induceerde de expressie van HO-1. (A) RT-PCR en Western blot voor HO-1 expressie volgens verschillende dosering van pantoprazol, 30, 100 en 300 uM, respectievelijk. Deze cijfers zijn de vertegenwoordigers van de verkregen in 3 onafhankelijke experimenten resultaten. (B) Confocale beeldvorming van HO-1. Pantoprazol verhoogde de expressie van HO-1 in een dosis-afhankelijke manier in normale ratten maagslijmvlies RGM-1 cellen.
Figuur 2 pantoprazol verhoogd Nrf2 nucleaire translocatie en cytoplasmatische KEAP1 inactivering tot significante anti-oxidatie. (A) Western blots voor zowel Keap1 cytosolisch of nucleair Nrf2 in een andere tijd in aanwezigheid van 300 uM pantoprazol. (B) elektroforetische mobiliteit shift assay (EMSA) voor ARE-DNA-bindende activiteit. Aanzienlijk toegenomen DNA-binding van Nrf2 werd opgemerkt 60 min na toediening pantoprazol. (C) Confocale beeldvorming van Nrf2 na verschillende dosering van pantoprazol, 100 pM en 300 pM. (D) elektronspinresonantie (ESR) maat voor Fenton reactie opgewekte hydroxyl radicalen. (E) De veranderingen van DCF-DA fluorescentie na verschillende dosering van pantoprazol, 30, 100 en 300 uM. Pantoprazol verminderde significant H2O2 geïnduceerde oxidatieve fluorescentie.
Aangezien de biologische betekenis van HO-1 pantoprazol bezit een antioxidatieve werking in verband met HO-1 inductie. ESR meting ultieme manier om vrije radicalen te traceren rotatie adduct, waarvoor wij gegenereerde hydroxylradicalen behulp DMPO als adductor onder Fenton reactie. Zoals blijkt uit figuur 2D, 3 mM pantoprazol uitgeoefend duidelijke wegvangende werking van DMPO-adduct-genererende hydroxylradicalen. Aangezien ESR meting chemische reactieomstandigheden niet biologisch systeem is uitgevoerd en pantoprazol is geen professionele antioxidant, het zeker bijgedragen tot het wegvangen van hydroxylradicalen hoewel het betrekkelijk hoge concentratie pantoprazol reactieve zuurstofsoorten wegvangen. Deze chemische resultaten van ESR onderzoek werden verder bevestigd met biologische test met DCF-DA fluorescentiemeting, blijkt dat pantoprazol significante DCF-DA vermindering van de dosis afhankelijke wijze (P
< 0,05, figuur 2E).
angiogene acties consequent to-pantoprazol geïnduceerde HO-1
PPI's verhoogde de uitingen van VEGF mRNA en eiwit in RGM-1-cellen (figuur 3A). Om te documenteren of de marginale inductie van VEGF met protonpompremmers gerelateerd aan HO-1 inductie, herhaalden we de experimenten met PPI alleen of co-behandeling van pantoprazol en zink protoporfyrine (ZnPPIX) als HO-1 remmer. Als resultaat, kunnen we de expressie van VEGF geïnduceerd door pantoprazol en incrementele co-behandeling van ZnPPIX bevestigen duidelijk verminderde de expressie van PPI-geïnduceerde VEGF op een dosis afhankelijke wijze (Figuur 3B). Vervolgens onderzochten we de veranderingen van representatieve angiogene factoren, bFGF, PDGF, en HIF-1α en waargenomen deze uitdrukkingen relevant pantoprazol geïnduceerde HO-1 in Figuur 3C. Zoals verwacht, pantoprazol aanzienlijk toegenomen deze uitingen van diverse angiogene factoren. Bekijk ook deze inducties van bFGF en PDGF waren significant verzwakt met co-behandeling van pantoprazol en ZnPPIX. Om na te gaan of deze inductie van angiogene factor na pantoprazol waren eigenlijk in verband met angiogenese, in vitro
angiogenese test werd gedaan (Figuur 3D). Tube formatie was significant verzwakt met 500 uM indomethacine in HUVEC's, terwijl 100 uM pantoprazol deze verstoringen van angiogenese behandeld met indometacine kan overwinnen. Echter, extra behandeling met ZnPPIX afgeschaft deze voordelen van het overwinnen van angiogenese door pantoprazol onder indomethacine bestuur. Deze resultaten suggereren dat pantoprazol gecompenseerd NSAID-geïnduceerde angiogenese door het defecte HO-1 inductie capaciteit. Figuur 3 pantoprazol geïnduceerde angiogene factoren gerelateerd aan HO-1 inductie. (A) RT-PCR en western blot voor VEGF. Aanzienlijke inductie van VEGF werden genoteerd met pantoprazol, significant na 300 pm pantoprazol (p < 0.05
). Deze cijfers zijn de vertegenwoordigers van de verkregen in 3 onafhankelijke experimenten resultaten. (B) De veranderingen van VEGF en HO-1 met pantoprazol alleen of combinatie van pantoprazol en ZnPPIX. De inductie van VEGF na pantoprazol significant verzwakt met HO-1 remmer, betekent de implicatie van HO-1 in PPI-geïnduceerde VEGF. Deze cijfers zijn de vertegenwoordigers van de verkregen in 3 onafhankelijke experimenten resultaten. (C) andere angiogene factoren in verband met pantoprazol. bFGF en VEGF werd steeds uitgedrukt pantoprazol, maar deze inducties werden verzwakt met HO-1 remmer. Deze cijfers zijn de vertegenwoordigers van de verkregen in 3 onafhankelijke experimenten resultaten. (D) in vitro
angiogenese assay. Vaatvorming van HUVEC significant verlaagd met 50 uM indomethacine. Pantoprazol gecompenseerd-indomethacine geïnduceerde gebrekkige angiogenese zoals gemeten met het percentage van de buis formatie, terwijl HO-1 remmer deze overwinnen van pantoprazol geïnduceerde angiogenese geannuleerd. Deze cijfers zijn vertegenwoordigers van de verkregen 3 onafhankelijke experimenten gevonden.
Pantoprazol geïnduceerde HO-1 verzwakt indomethacine geassocieerde inflammatoire aanval
Hoewel indomethacine is een anti-inflammatoir middel, is het bekend dat NSAID geïnduceerde gastrische schade door verhoogde uitdrukking van inflammatoire mediatoren zoals TNF-α, IL-1β, IL-8 en NADPH oxidase-1 (NOX-1). Zoals blijkt uit figuur 4A, 500 uM indomethacine aanzienlijk toegenomen uitingen van TNF-α, IL-1β en IL-8 in maagepitheelcellen, dat het de expressie van HO-1 daalde, hetgeen bevestigt dat ontstekingsmediatoren mechanistisch geassocieerd zijn aan indomethacine geïnduceerde gastrische epitheliale celschade. In deze toestand, gelijktijdige toediening van 500 uM indomethacine en 300 uM pantoprazol significant af uitingen van TNF-α, IL-1β en IL-8 samen met statistisch significante verhogingen van HO-1 expressie. Bovendien, indomethacine uitdaging aanzienlijk toegenomen uitingen van NOX-1, waarbij pantoprazol aanzienlijk verhoogde expressie van NOX-1 verzwakt, wat suggereert dat pantoprazol geïnduceerde HO-1 opgelegde ontstekingsremmende werking onder indomethacine. Vervolgens, teneinde verder te bewijzen of deze verzwakkingen van ontstekingsmediatoren na pantoprazol gevolg van HO-1 inductie, herhaalden we deze experimenten met ZnPPIX toediening. Zoals blijkt uit figuur 4B, de co-behandeling van ZnPPIX in aanwezigheid van pantoprazol aanzienlijk schafte de voordelen van anti-inflammatoire werking. De incrementele inducties van ICAM-1 en VCAM na indomethacine behandeling waren verantwoordelijk voor ischemie en verergerde orgel schade, waarbij ofwel vasculaire ontsteking of verhoogde leukocyten aggregatie bezig was. De behandeling met indomethacine aanzienlijk toegenomen uitingen van ICAM-1 en VCAM in HUVEC, maar co-uitdaging van indomethacine en pantoprazol aanzienlijk gedaald-indomethacine geïnduceerde ICAM-1-expressie tot een verhoogde inductie van HO-1 (Figuur 4C) relevant. In deze toestand heeft ZnPPIX geen verzwakking van ICAM en VCAM leggen ondanks pantoprazol behandeling, meer zekerheid de begunstigde werking van pantoprazol geassocieerd met HO-1 inductie. Figuur 4 Pantoprazol verzwakt-indomethacine geïnduceerde ontstekingsmediatoren door middel van HO-1. (A) RT-PCR voor TNF-α, IL-1β, IL-8, en HO-1. 500 uM indomethacine verhoogde de expressie van inflammatoire mediatoren zoals TNF-α, IL-1β, IL-8, maar aanzienlijk verlaagde HO-1 expressie. NOX-1 was significant verhoogd met indomethacine. Deze cijfers zijn de vertegenwoordigers van de verkregen in 3 onafhankelijke experimenten resultaten. (B) pantoprazol significant verlaagd indomethacine geïnduceerde IL-1β en TNF-α, maar deze begunstigde acties van pantoprazol werd afgeschaft ZnPPIX, zodat geconcludeerd dat de anti-inflammatoire werking van pantoprazol werden wegens HO-1 inductie. Deze cijfers zijn de vertegenwoordigers van de verkregen in 3 onafhankelijke experimenten resultaten. (C) pantoprazol significant verlaagd indomethacine geïnduceerde ICAM-1 en VCAM in HUVEC cellen, maar deze begunstigde acties van pantoprazol werden afgeschaft ZnPPIX als HO-1 remmer. Deze cijfers zijn de vertegenwoordigers van de verkregen in 3 onafhankelijke experimenten resultaten.
Pantoprazol geïnduceerde HO-1 verzwakt-indomethacine geïnduceerde maag letsel Belgique Om het beschermende effect van pantoprazol in vivo
, indomethacine (10 mg /kg te onderzoeken ) werd intraperitoneaal toegediend gedurende 16 uur bij ratten. De behandeling met indomethacine aanzienlijk uitgelokt maagslijmvlies verwondingen waaronder hemorragische erosies en zweren. Echter, deze gastrische aandoeningen veroorzaakt met indomethacine significant verzwakt met intraperitoneale injectie van 30 mg /kg pantoprazol (Figuur 5A). Aangezien deze beschermende effecten van 30 mg /kg pantoprazol tegen door indomethacine geïnduceerde gastrische schade significant afgeschaft co-behandeling van intraperitoneale toediening 5 mg /kg ZnPPIX bevestigden we dat de beschermende werking van pantoprazol was gebaseerd op het vermogen van HO-1 inductie . Wanneer de uitingen van HO-1 en ICAM-1 werden gemeten in mucosale homogenaten van elke groep indomethacine toediening significant af uitingen van HO-1 en verhoogde de expressie van ICAM-1. Als gevolg van verhoogde HO-1 blijken na pantoprazol en aanzienlijk verzwakt niveau van ICAM-1, indomethacine geïnduceerde gastrische schade proportioneel verbeterd ondanks indomethacine challenge (figuur 5B). Om te demonstreren hoe pantoprazol verbeterde de defecte angiogenese en ischemie veroorzaakt door indomethacine, EMSA behulp HIF-1α werd uitgevoerd (Figuur 5C). Het HIF-1α-DNA-bindende activiteit werd in indomethacine groep die uitsluitend sterk verhoogd, die aanzienlijk was gedaald in de maag homogenaten van pantoprazol behandelgroep, betekenende pantoprazol aanzienlijk ontlast hypoxische toestand geïnduceerd door indomethacine. Bij elkaar genomen, PPI oefende een sterke bescherming tegen indomethacine veroorzaakte maagslijmvlies schade door significante HO-1-inductie, die buiten authentiek zuur onderdrukkende werking, hoewel we niet de veranderingen van de zuurgraad van de maag niet te meten. Figuur 5 pantoprazol verhindert de indomethacine-induced gastric schade door afhankelijk van de inductie van HO-1. (A) De gemiddelde index van indomethacine geïnduceerde maag schade. (B) RT-PCR voor HO-1 en ICAM-1 naar groep. (C) EMSA voor HIF-1α volgens groep. Indometacine aanzienlijk toegenomen HIF-1α-DNA-bindende, terwijl pantoprazol aanzienlijk gedaald HIF-1α-DNA-binding in een dosis-afhankelijke manier.
Discussie
Voordat het huidige onderzoek, hebben verschillende onderzoekers publiceerden dat PPI's maagslijmvlies letsel kunnen voorkomen door andere mechanismen buiten de werking van de specifieke zuurinhibitie [11, 14, 25-28], kunnen we meer bewijzen betreffende beschermende werking van protonpompremmers tegen NSAID's toe te voegen. Pantoprazol sterk induceerde de expressie van HO-1 tot Nrf2 activatie ontstekingsremmende, anti-oxidatieve en ischemie verlichten acties relevant. Nieuwe bevinding van deze studie verschilt van andere onderzoeken is dat pantoprazol toont beschermende maatregelen om de NSAID-geïnduceerde schade, zowel via de correctie van angiogene handicap of de verzwakking van de ontsteking neiging.
Becker JC et al.
[16] aangetoond dat zowel omeprazol en lansoprazol beschermd menselijke maag epitheliale en endotheliale cellen tegen oxidatieve stress vergelijkbaar met onze studie, maar gebruikt verschillende soorten PPI. Dit effect werd afgeschaft in aanwezigheid van HO-1 remmer, ZnPPIX, HO-1 lijkt een juiste doel van protonpompremmers in zowel endotheliale en maagepitheelcellen zijn. In deze studie hebben we waargenomen onaangetast nieuwe vinding dat HO-1 geïnduceerd door verminderde PPI-NSAID gemaakte ontsteking en angiogene ontregeling. Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.

• Epstein-Barr virus geassocieerde maagcarcinoom: een verslag van Iran in de afgelopen vier decennia
• Associatie tussen RUNX3 promoter methylering en maagkanker: een meta-analyse