Un possibile coinvolgimento di Nrf2-mediata eme ossigenasi-1 up-regulation in effetto protettivo dell'inibitore pantoprazolo pompa protonica contro danno gastrico indometacina indotto in rats

un possibile coinvolgimento di Nrf2-mediata eme ossigenasi-1 up-regulation in effetto protettivo del inibitore della pompa protonica pantoprazolo contro indometacina indotta danno gastrico nei ratti
Abstract
sfondo
della pompa protonica è una proteina integrale di membrana che è onnipresente ATP cassette vincolante (ABC) coinvolto in numerosi processi di trasporto in tutti gli organismi viventi, tra che una forma specializzata di pompa, così chiamato p
tipo di pompa protonica, esiste nelle cellule parietali dello stomaco. Anche se gli inibitori della pompa protonica (PPI) sono spesso prescritti per evitare che i farmaci anti-infiammatori non steroidei (FANS) indotta danno gastrico, le azioni repressive di acido non sono sufficienti a spiegare.
Metodi
Per documentare gli effetti di pantoprazolo , uno di IPP, il danno gastrico FANS indotta, in vitro Comprare e in vivo sono stati condotti studi
. Immunocitochimica, analisi Western Blot, Saggio di ritardo di mobilità elettroforetica e RT-PCR sono stati condotti per valutare l'induzione di eme ossigenasi-1 (HO-1) attraverso l'attivazione Nrf2 in normali delle mucose RGM-1 cellule gastriche o in vivo
tessuti dello stomaco da ratti trattati con indometacina e /o pantoprazolo.
Risultati
pantoprazolo attivati ​​Nrf2 mediante inattivazione di Keap1, dopo di che l'espressione di HO-1 era significativamente aumentata in modo dose-dipendente RGM-1 cellule. L'aumento dell'attività di legame ARE-DNA è stato osservato al massimo a 1 h con 300 micron di pantoprazolo. L'espressione di HO-1 indotta da pantoprazolo era significativamente associato con l'aumento vitro
formazione del tubo in (P
< 0,05) e fattori angiogenici tra VEGF, bFGF, e HIF-1α. Indometacina marcatamente aumentato le espressioni di TNF-α, IL-1ß, IL-8, NOX-1, ICAM-1 e VCAM, mentre pantoprazolo è diminuito in modo significativo le espressioni di indometacina indotta questi mediatori infiammatori in accordo con pantoprazolo indotta HO-1 (P
< 0,05) come documentato con HO-1 inibitore. In vivo
modello del danno gastrico indometacina-indotta potrebbe convalidare in vitro
-drawn risultati che pantoprazolo notevolmente protetti contro i danni gastrici indometacina-indotta, in cui lo zinco protoporphyrin (5 mg /kg, ip
) significativamente abolita l'efficacia protettiva del pantoprazolo.
Conclusione
Questi risultati dimostrano che Nrf2-mediata HO-1 induzione di PPI offriva un effetto protettivo significativo contro i FANS indotta danno gastrico al di là di azioni soppressive acido.
Parole
eme ossigenasi-1 inibitore della pompa protonica FANS indotta gastropatia Nrf2 Sfondo
FANS hanno enormi volumi di prescrizione per lo più sulla base dei seguenti due vantaggi, uno è un aumento di pazienti di età che necessitano FANS prescrizione per alleviare il dolore degenerativa cambiamento indotto e l'altro è un prova supplementare sia per la prevenzione dei polipi del colon o la fuga da malattie cardiovascolari ischemiche [1, 2]. Tuttavia, la maggior uso di FANS è limitato da effetti collaterali fastidiosi come l'erosione gastrica /ulcera, complicata sanguinamento da ulcere, e più gravi complicazioni derivanti al tenue e del colon. Dal momento che l'azione farmacologica dei FANS è attraverso l'inibizione della prostaglandina di sintesi (PG) mediante la soppressione della ciclossigenasi (COX) [3], la diminuzione indistinguibile di gastroprotettivi prostaglandina E 2 (PGE 2) è responsabile di queste gastrointestinale (GI) effetti negativi. Anche se l'invenzione di selettivi della COX-2 inibitori, coxib, per garantire la sicurezza GI è stato suggerito come la strategia solving, questa soluzione ha anche bisogno di migliorare. Sebbene i FANS sono utilizzati come farmaci anti-ulcera potenti, gli ulteriori meccanismi scoperte di tossicità FANS [4, 5] ci portano a sviluppare agenti più potenti e sicuri.
Nel tempo presente, GI la scelta migliore per prevenire FANS correlati tossicità è o la combinazione di FANS e inibitori della pompa protonica (PPI) o la scelta del coxibs [6, 7]. Dal momento che il tasso di guarigione delle ulcere gastrointestinali durante l'uso continuo di FANS è risultato maggiore nel gruppo PPI di tipo istamina 2 antagonista del recettore di gruppo (H2-RA), PPI sono stati preferiti di H2-RA per far fronte con l'effetto negativo di FANS [8, 9 ]. Oltre fondamentali azioni soppressive acidi del PPI, sono state rivelate diverse funzioni che sono la riduzione del segnale pro-apoptotico, restauro acido indipendente di proliferare e riparazione percorsi [10], una riduzione della mucosa danno ossidativo, la guarigione azioni che favoriscono, e reticolo endoplasmatico meccanismo di distensione [11-16]. Hahm et al.
[17-19] hanno anche riferito che i PPI indicano le potenziali attività come terapie antitumorali basati sull'induzione selettiva di apoptosi, anti-angiogenesi contro Helicobacter pylori
carcinogenesi -associated, e le azioni anti-mutagene dirette durante la tumorigenesi. Tuttavia i meccanismi responsabili per gli effetti protettivi del PPI a FANS-indotta danno gastrico restano da determinare.
Eme ossigenasi-1 (HO-1), un inducibile per il primo e rate-limiting enzima di degradazione eme, è stata noto per proteggere contro la citotossicità di stress ossidativo e apoptosi così come condizione infiammatoria [20, 21]. effetti protettivi fondamentali HO-1 contro infiammazione sono mediati attraverso degradazione dell'eme antiossidante, ma anche associati con la produzione dei mediatori antinfiammatori, per cui redox dipendente fattore attivatore trascrizionale NF-E2-correlato 2 (Nrf2), e la sua fosforilazione /attivazione, e l'ossidazione di Kelch-like-ECH associando proteina 1 (Keap1) è meccanicamente suggerito [22-24]. Dal momento che l'espressione di HO-1 è stato indotto da anti-ossidante, anti-infiammatori, e le risposte che allevia le ischemici, in questo studio, abbiamo ipotizzato che gli effetti protettivi del PPI contro i danni gastrici FANS indotta possono essere correlati a HO-1 e conseguente angiogenesi al di là di soppressione acida innata. Complessivamente, i nostri risultati dimostrano i nuovi meccanismi che i PPI indurre l'espressione di HO-1 attraverso l'attivazione Nrf2 /inattivazione Keap1 accompagnato con la remunerazione del cambiamento ischemica e l'attenuazione dei mediatori infiammatori, facilitando in tal modo la protezione contro i danni gastrici indometacina-indotta.
Metodi
Materiali e colture cellulari
indometacina è stato acquistato da Sigma Aldrich (Saint Louis, MO) e pantoprazolo è stato fornito da Amore Pacific Pharmaceutical Co. (Seoul, Corea). Anticorpi per la β-actina, HO-1, α-tubulina, Keap1, Nrf2 e VEGF sono stati tutti ottenuti da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). ratto normale mucosa gastrica RGM-1 le cellule sono stati forniti dal Prof. Hirofumi Matsui, MD, PhD (Tsukuba Univ., Japan), sono state coltivate in mezzo di Dulbecco modificato Eagle (DMEM) contenente il 10% (v
/v
) di siero fetale bovino, 100 U /ml di penicillina. ombelicale vascolari cellule endoteliali umane (HUVEC) sono state coltivate in media M199 (schermo InnoPharma, Seoul, Corea). Le cellule sono state mantenute a 37 ° C in atmosfera umidificata contenente il 5% di CO 2. quantità appropriate di RGM-1 cellule o HUVEC sono state seminate e incubate per 24 ore, poi sono stati trattati con la dose indicata di pantoprazolo o indometacina e incubate per i tempi indicati. HUVECs sono stati spostati al 1% O 2 e il 5% di CO camera 2 ipossia e incubata per 0-12 h per la vitro
saggio di formazione del tubo in. Spettroscopia
risonanza di spin elettronico (ESR) e misura ROS generazione
varie concentrazioni di pantoprazolo aggiunto ad un volume totale di 200 microlitri contenente 0,05 mM FeSO 4, 1 mM H 2O 2, 1 mM 5,5-dimethylpyrroline-N-ossido di (DMPO, Sigma Aldrich, Saint Louis, MO), e 50 mM sodio fosfato a pH 7,4 a temperatura ambiente. Le reazioni sono state avviate con l'aggiunta di H 2O 2. Dopo incubazione per 1 min, aliquote delle reazioni sono stati trasferiti in una cella di quarzo e lo spettro di DMPO-OH è stato esaminato utilizzando uno spettrofotometro ESR (JES-TE300, JEOL, Tokyo, Giappone) nelle seguenti condizioni: campo magnetico, 338,0 ± 5.0 mT; potenza a microonde, 4,95 mW; frequenza, 9.421700 GHz; modulazione di ampiezza, 5 metri; spazzare tempo, 0.5 min; e costante di tempo, 0.03 s. contenuti cellulari ROS sono stati misurati tramite l'incubazione del controllo o pantoprazolo trattati RGM-1 le cellule con 10 mM H 2DCF-DA (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) per 30 minuti. La fluorescenza è stata misurata utilizzando un microscopio laser confocale (LSM710, Carl Zeiss, Oberkochen, Germania).
Analisi Western Blot
cellule trattate sono state lavate due volte con PBS e poi lisate in tampone di lisi cellulare ghiacciata (Cell Signaling Technology) contenente 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF, Sigma Aldrich). Le proteine ​​in lisati sono state separate mediante SDS-PAGE e trasferite su fluoruro di polivinilidene (PVDF) membrane, che sono state incubate con anticorpi primari, lavato, incubate con anticorpi secondari coniugati con perossidasi, rewashed e quindi visualizzato per mezzo di un chemiluminescenza sistema (ECL) ( GE Healthcare, Buckinghamshire, Regno Unito).
elettroforetica saggio di turno gel mobilità (EMSA)
nucleare e frazioni citoplasmatici sono stati estratti con Ne-pER nucleare e reagenti citoplasmatici (Pierce, Rockford, iL), secondo le istruzioni del produttore. sonda oligonucleotide elemento risposta antiossidante (ARE), 5'-TTT TCT GCT GAG TCA AGG TCC G-3 ', e HIF-1α sonda oligonucleotide, 5'-TCT GTA CGT GAC CAC ACT CAC CTC-3', è stato etichettato con [ ,,,0],γ- 32P] ATP utilizzando T4 polinucleotide chinasi (Promega, Madison, WI) e separato dal prive di personalità giuridica [γ- 32P] ATP per filtrazione di gel utilizzando una colonna di spin nick (GE Healthcare). Prima di aggiungere il 32P-oligonucleotide (1x10 5 cpm), 10 mg di estratto nucleare è stato tenuto in ghiaccio per 15 minuti, nei gel shift tampone di legame. Per determinare la specificità di sequenza dell'interazione DNA di NF-kB, abbiamo aggiunto un eccesso di oligonucleotidi non marcati. Dopo 20 minuti di incubazione a temperatura ambiente, è stato aggiunto 2 ml di 0,1% blu di bromofenolo, ei campioni sono stati sottoposti ad elettroforesi a 6% non denaturante PAGE a 150 V in una camera fredda. Infine, i gel sono stati essiccati ed esposti a pellicola a raggi X (Kodak, Rochester, NY).
Immunocitochimica
cellule trattate in camera di diapositive sono state fissate dal 3,7% di formaldeide per 15 min. Dopo il lavaggio, le cellule sono state bloccate in soluzione BSA 5% contenente 0,1% Triton X-100 in PBS per 1 ora a temperatura ambiente, e poi incubate con l'anticorpo primario (1: 100) per 12 ore a 4 ° C. Le cellule sono state poi lavate 3 volte, incubate con anticorpo secondario (1: 300) per 1 h, quindi con 4'-6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, 100 ng /ml) per 1 min a temperatura ambiente. Dopo aver lavato 3 volte, le cellule sono state montate con Prolungare oro antifade reagente (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). La fluorescenza è stato visualizzato al microscopio laser confocale (LSM710, Carl Zeiss).
Isolamento di RNA e la reazione a catena quantitativa inversa trascrizione polimerasi (qRT-PCR)
Dopo il trattamento, i media è stato rimosso mediante aspirazione e le cellule sono state lavate con fosfato di Dulbecco salina -buffered (DPBS) due volte. RiboEX (Gene tutto, Seoul, Corea del Sud) è stato aggiunto al piatti, che sono state poi incubate per 10 minuti a 4 ° C. RiboEX stato raccolto e collocato in una provetta da 1,5 ml, ed è stato aggiunto cloroformio e miscelato delicatamente. Dopo incubazione per 10 min in ghiaccio, i campioni sono stati centrifugati a 10.000 xg per 30 min. I surnatanti sono stati estratti e mescolato con isopropanolo e miscele sono state incubate a 4 ° C per 1 h. Dopo centrifugazione a 13.000 g per 30 minuti
, pellet è stato lavato con 70% (v
/v
) etanolo. Dopo aver lasciato l'etanolo di evaporare completamente, pellet sono stati sciolti in acqua dietilene -treated pirocarbonato (DEPC) (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). cDNA è stato preparato usando trascrittasi inversa derivata da murina Maloney virus della leucemia (Promega, Madison, WI), secondo le istruzioni del produttore. PCR è stata eseguita oltre 30 cicli: 94 ° C per 20 sec, 58 ° C per 30 sec e 72 ° C per 45 sec. primer oligonucleotidi per PCR (Tabella 1) sono stati acquistati da Bioneer (Daejeon, Corea). Tutti gli esperimenti qRT-PCR sono stati ripetuti in triplice copia e quantificazione è stato mostrato in media ± SD.Table 1 La sequenza di primer PCR
GAPDH
Forward 5'-GGT GCT GAG TAT GTC GTG GA -3 '
Reverse 5'-TTC AGC TCT GGG ATG ACC TT-3 '
HO-1
Forward 5'-GAG AGC ATG TCC CAG GAT TT-3'
Reverse 5'-GGT TCT GCT TGT TTC GCT CT -3 '
COX-2
Forward 5'-GAA ATG GCT GCA GAG TTG AA -3'
Reverse 5'-TCA TCT AGT CTG GAG TGG GA -3 '
HIF-1α
Inoltra 5'-AAC AAA CAG AAT CTG TCC TC-3 '
Reverse 5'-GGT AAT GGA GAC ATT GCC AG-3'
VEGF
Forward 5'-CAA TGA TGA AGC CCT GGA GT-3 '
Reverse 5'-GAT TTC TTG CGC TTT CGT TT -3'
PDGF
Forward 5'-AGG AAG CCA TTC CCG CAG TT-3 '
Reverse 5'-CTA ACC TCA CCT GGA CCT CT -3 '
bFGF
Forward 5'-TAT GAA GGA AGA TGG ACG GC-3'
Reverse 5'-AAC AGT ATG GCC TTC TGT CC -3 '
IL-1β
Forward 5'-CAT TGT TGT GGC GGA GAA G-3 '
Reverse 5'-ATC ATC CCA CGA GTC ACA GA -3'
IL-8
Forward 5'- CAG ACA GTG GCA GGG ATT CA-3 '
Reverse 5'-TTG GGG ACA CCC TTT AGC AT-3'
TNF-α
Forward 5'-TAC TGA ACT TCG GGG TGA TT -3 '
Reverse 5'-CAG CCT TCT CCC TTG AAG AG-3 '
ICAM-1
Forward 5'-TGT GCT TTG AGA ACT GTG GC-3'
Reverse 5'-GGT TCT GTC CAA CTT CTC AG -3 '
VCAM-1
Forward 5'-GAG ACA AAA CAG AAG TGG AAT-3'
Reverse 5'-TAC AAG TGG TCC ACT TAT TTC -3 '
Nox1
Forward 5'-GAG AAA TTC TCG GAA CTG CC-3 '
Reverse 5'-TGT TGG CTT CTA CTG TAG CG -3'
in vitro
angiogenesi test
Questo test è stata eseguita utilizzando un kit commerciale secondo le istruzioni del produttore (Millipore, Billerica, MA). Per le condizioni di ipossia, ECMatrix e tampone diluente sono stati mescolati per fare un gel solido, che è stato poi placcato in 96 pozzetti. vena ombelicale cellule endoteliali umane (HUVEC, 1,0 × 10 5 /ml) sono stati seminati con controllo, indometacina, indometacina più pantoprazolo, indometacina più pantoprazolo inclusa ZnPPIX incubate a 37 ° C per 4 ore. formazione del tubo è stata osservata al microscopio ottico.
indometacina indotta modello di danno gastrico
un totale di 48 ratti sono stati acquistati da Charles River (Osaka, Giappone). Gli animali sono stati trattati in un impianto animali accreditati in conformità con l'Associazione per la valutazione e l'accreditamento degli animali da laboratorio Care International (AAALAC Internazionale) le linee guida nell'ambito del meccanismo di nome CACU (Il Centro di cura degli animali e l'uso) di Lee Gil Ya Cancer e Diabetes Institute, Gachon Università dopo l'approvazione Institutional Review Board etico. Gli animali sono stati divisi in quattro gruppi costituiti ciascuno da 12 topi e sono state lasciate morire per 24 h prima della sperimentazione come segue; tutti i ratti sono stati somministrati con iniezione intraperitoneale di indometacina (10 mg /kg) per provocare danni gastrici, secondo gruppo con iniezione intraperitoneale di 10 mg /kg di pantoprazolo, il terzo gruppo con iniezione intraperitoneale di 30 mg /kg di pantoprazolo, e il quarto gruppo con iniezione intraperitoneale di 30 mg /kg di pantoprazolo e 5 mg /kg di ZnPPIX di inibire l'attività di HO-1. Gli animali sono stati sacrificati 16 ore dopo ogni somministrazione. Gli stomaci di ratti sono stati rimossi e aperti lungo la grande curvatura e quindi lavati con soluzioni tampone di fosfato di ghiaccio freddo. I numeri di una erosioni o ulcere sono stati determinati sotto le fotografie ingrandite. Omogenati ottenuti dalla mucosa gastrica graffiato erano tenuti nel serbatoio azoto liquido fino al dosaggio.
Analisi statistica
risultati sono espressi come media ± SD. I dati sono stati analizzati mediante ANOVA, e la significatività statistica tra i gruppi è stata determinata con il test gamma multipla di Duncan. La significatività statistica è stata accettata in P
< 0.05.
Risultati
Pantoprazolo aumentato HO-1 espressione attraverso Nrf2 attivazione
Sulla base di studio preliminare, abbiamo trovato pantoprazolo ha mostrato la più alta induzione di HO-1 espressione in RGM-1 le cellule tra PPI, lansoprazolo, rabeprazolo , omeprazolo e pantoprazolo (dati non mostrati). Pantoprazolo aumentato l'espressione di HO-1 mRNA e proteine ​​in modo dose-dipendente modo (Figura 1A) e l'analisi immunocitochimica anche rivelato che il livello di HO-1 era significativamente aumentata mediante trattamento pantoprazolo nel citoplasma di RGM-1 le cellule in una dose modo-dipendente (Figura 1B). Per comprendere i meccanismi alla base del up-regolazione di HO-1 da pantoprazolo, abbiamo esaminato i suoi effetti sulla attivazione di Nrf2, un importante fattore di trascrizione che media l'espressione ARE /EPRE-driven di enzimi antiossidanti. Quando abbiamo misurato il livello di espressione di Keap1, un repressore di Nrf2 in frazione citoplasmatica trattate con 300 mM pantoprazolo in un diverso punto di tempo, significativamente diminuita espressione di Keap1 è stata osservata in 1 h (Figura 2A), suggerendo che HO-1 potrebbe essere trascritto dopo il trattamento pantoprazolo attraverso l'attivazione Nrf2 e Keap1 inattivazione. Come illustrato in Figura 2A, Nrf2 nucleare co-localizzazione era evidente in RGM-1 cellule trattate con pantoprazolo. Il massime sono vincolanti attività di Nrf2 è stato aumentato a 1 h così come la sua localizzazione nucleare indotta da pantoprazolo (Figura 2B). Per accertare l'accumulo nucleare di Nrf2, abbiamo condotto un'analisi immunocitochimico usando l'anticorpo anti-Nrf2. Come mostrato nella Figura 2C, Nrf2 stata traslocata nel nucleo con 300 pM trattamento pantoprazolo. Questi risultati suggeriscono che costantemente pantoprazolo potrebbe aumentare i livelli di HO-1 attraverso l'attivazione trascrizionale Nrf2 nelle cellule epiteliali gastriche ratto. Figura 1 Pantoprazolo induce l'espressione di HO-1. (A) RT-PCR e Western blot per HO-1 secondo la differente dosaggio di pantoprazolo, 30, 100, e 300 mM, rispettivamente. Questi dati sono rappresentanti i risultati ottenuti in 3 esperimenti indipendenti. (B) l'imaging confocale di HO-1. Pantoprazolo ha aumentato l'espressione di HO-1 in modo dose-dipendente nel ratto normale mucosa gastrica RGM-1 le cellule.
Figura 2 Pantoprazolo aumentata traslocazione nucleare Nrf2 e citoplasmatica inattivazione Keap1, ha portato ad un significativo anti-ossidazione. (A) Western blot sia per citosolica Keap1 o Nrf2 nucleare in un tempo diverso in presenza di 300 mM pantoprazolo. (B) elettroforetica saggio mobility shift (EMSA) per ARE-DNA legame attività. Significativamente aumentato DNA-binding di Nrf2 è stato osservato 60 minuti dopo la somministrazione di pantoprazolo. (C) confocale di imaging di Nrf2 dopo diverso dosaggio di pantoprazolo, 100 micron e 300 micron. misura (D) risonanza di spin elettronico (ESR) per Fenton reazione generato radicali idrossile. (E) I cambiamenti di DCF-DA fluorescenza dopo diverso dosaggio di pantoprazolo, 30, 100, e 300 pM. Pantoprazolo è diminuito significativamente H2O2-fluorescenza indotta ossidativo.
Dal momento che il significato biologico di HO-1 pantoprazolo possiede un'azione anti-ossidante relative a HO-1 induzione. misurazione ESR è stato modo migliore per tracciare la generazione di radicali liberi mediante rotazione addotto, per il quale abbiamo generato radicali ossidrile utilizzando DMPO come un adduttore in reazione di Fenton. Come si vede nella figura 2D, 3 mM pantoprazolo esercitata chiara azione scavenging di DMPO-addotto che generano i radicali idrossile. Poiché la misurazione ESR è stata eseguita in condizioni di reazione chimica sistema non biologico e pantoprazolo non è un antiossidante professionale, sicuramente contribuito a pulire i radicali idrossilici anche se è relativamente alta concentrazione di pantoprazolo per pulire le specie reattive dell'ossigeno. Questi risultati chimici da studio ESR sono stati ulteriormente validati con test biologico utilizzando la misurazione della fluorescenza DCF-DA, dimostrando che pantoprazolo ha mostrato una significativa riduzione DCF-DA in modo dose-dipendente (P
< 0,05, figura 2E).
azioni angiogeniche conseguente al pantoprazolo-indotte HO-1
PPI è aumentato l'espressione di VEGF mRNA e di proteine ​​in RGM-1 le cellule (Figura 3A). Al fine di documentare se l'induzione incrementale di VEGF con PPI è legato alla HO-1 induzione, abbiamo ripetuto gli esperimenti con il solo PPI o co-trattamento del pantoprazolo e zincoprotoporfirina (ZnPPIX) come HO-1 inibitore. Come risultato, abbiamo potuto riconfermare l'espressione di VEGF indotta da pantoprazolo e incrementale co-trattamento ZnPPIX chiaramente ridotto l'espressione di VEGF PPI indotta in maniera dose-dipendente (Figura 3B). Successivamente, abbiamo studiato i cambiamenti di fattori angiogenici rappresentative, bFGF, PDGF, e HIF-1α e osservato queste espressioni rilevanti per pantoprazolo-indotte HO-1 nella Figura 3C. Come anticipato, pantoprazolo aumentato in modo significativo queste espressioni di diversi fattori angiogenici. Anche queste induzioni di bFGF e PDGF erano significativamente attenuati con il co-trattamento del pantoprazolo e ZnPPIX. Al fine di verificare se queste induzioni di fattore angiogenico dopo pantoprazolo sono stati effettivamente correlate a angiogenesi, in vitro
angiogenesi test è stato fatto (Figura 3D). formazione del tubo è stata significativamente attenuato con 500 mM indometacina in HUVECs, mentre 100 micron pantoprazolo potrebbe superare queste alterazioni dell'angiogenesi trattati con indometacina. Tuttavia, il trattamento supplementare con ZnPPIX abolito questi vantaggi di superare l'angiogenesi da pantoprazolo sotto amministrazione indometacina. Questi risultati suggeriscono che pantoprazolo compensato FANS indotta angiogenesi difettoso attraverso la sua capacità di induzione HO-1. Figura 3 Pantoprazolo indotta fattori angiogenici relativi alla HO-1 induzione. (A) RT-PCR e western blot per VEGF. induzioni significative di VEGF sono stati notati con pantoprazolo, in modo significativo dopo 300 micron pantoprazolo (p < 0.05
). Questi dati sono rappresentanti i risultati ottenuti in 3 esperimenti indipendenti. (B) Le variazioni di VEGF e HO-1 con il solo pantoprazolo o combinazione di pantoprazolo e ZnPPIX. L'induzione di VEGF dopo pantoprazolo era significativamente attenuato con HO-1 inibitore, a significare l'implicazione di HO-1 in VEGF PPI-indotta. Questi dati sono rappresentanti i risultati ottenuti in 3 esperimenti indipendenti. (C) Altri fattori angiogenici relative al pantoprazolo. bFGF e VEGF è stata sempre espressa con pantoprazolo, ma queste induzioni sono stati attenuati con HO-1 inibitore. Questi dati sono rappresentanti i risultati ottenuti in 3 esperimenti indipendenti. (D) in vitro
dosaggio angiogenesi. formazione del tubo di HUVEC era significativamente diminuita con 50 micron indometacina. Pantoprazolo compensata indometacina indotta angiogenesis difettose come valutata la percentuale di formazione del tubo, che HO-1 inibitore annullato questi superare dell'angiogenesi pantoprazolo-indotta. Questi dati sono rappresentanti i risultati ottenuti in 3 esperimenti indipendenti.
Pantoprazolo indotta HO-1 attenuato aggressione infiammatoria indometacina-associata
Sebbene indometacina è un agente anti-infiammatorio, è noto che i FANS indotta danno gastrico tramite aumento espressioni di mediatori infiammatori tra cui TNF-α, IL-1β, IL-8, e NADPH ossidasi-1 (NOX-1). Come si vede nella figura 4A, 500 mM indometacina aumentato significativamente le espressioni di TNF-α, IL-1β e IL-8 in cellule epiteliali gastriche, mentre diminuisce l'espressione di HO-1, confermando che i mediatori infiammatori possano essere meccanicamente associati indometacina-indotta gastrica danni delle cellule epiteliali. In questa condizione, la co-somministrazione di 500 micron indometacina e 300 micron pantoprazolo diminuito in modo significativo le espressioni di TNF-α, IL-1β e IL-8 accompagnate con aumenti statisticamente significativi di HO-1. Inoltre, sfida indometacina aumentato significativamente le espressioni di NOX-1, in cui il pantoprazolo notevolmente attenuato l'aumento dell'espressione di NOX-1, suggerendo che HO-1 azioni anti-infiammatori imposti pantoprazolo indotta sotto indometacina. Successivamente, al fine di dimostrare ulteriormente se queste attenuazioni di mediatori infiammatori dopo pantoprazolo sono il risultato di HO-1 induzione, abbiamo ripetuto questi esperimenti con l'amministrazione ZnPPIX. Come visto in Figura 4B, il co-trattamento ZnPPIX in presenza di pantoprazolo abolito significativamente i benefici di azione anti-infiammatoria. Le induzioni incrementali di ICAM-1 e VCAM dopo il trattamento indometacina erano responsabili di ischemia e di organi aggravato i danni, in cui era impegnato sia l'infiammazione vascolare o aumentato l'aggregazione dei leucociti. Il trattamento con indometacina aumentato significativamente le espressioni di ICAM-1 e VCAM in HUVEC, ma co-sfida di indometacina e pantoprazolo significativamente diminuito indometacina indotta ICAM-1 relativo a una maggiore induzione di HO-1 (Figura 4C). In questa condizione, ZnPPIX non ha imposto l'attenuazione di ICAM o VCAM nonostante il trattamento pantoprazolo, assicurando ulteriormente l'azione beneficiario pantoprazolo associato HO-1 induzione. Figura 4 Pantoprazolo attenuato mediatori infiammatori indometacina indotta attraverso HO-1. (A) RT-PCR per il TNF-α, IL-1β, IL-8, e HO-1. 500 micron indometacina aumentato l'espressione di mediatori infiammatori tra cui TNF-α, IL-1β, IL-8, ma è diminuito in modo significativo HO-1. NOX-1 è risultata significativamente aumentata con indometacina. Questi dati sono rappresentanti i risultati ottenuti in 3 esperimenti indipendenti. (B) Pantoprazolo diminuito in modo significativo indometacina indotta IL-1β e TNF-α, ma queste azioni beneficiari del pantoprazolo sono stati aboliti con ZnPPIX, che porta alla conclusione che le azioni anti-infiammatori di pantoprazolo sono stati a causa di HO-1 induzione. Questi dati sono rappresentanti i risultati ottenuti in 3 esperimenti indipendenti. (C) Pantoprazolo diminuito in modo significativo indometacina indotta ICAM-1 e VCAM nelle cellule HUVEC, ma queste azioni beneficiari del pantoprazolo sono stati anche aboliti con ZnPPIX come HO-1 inibitore. Queste cifre sono rappresentanti dei risultati ottenuti in 3 esperimenti indipendenti.
Pantoprazolo indotta HO-1 indebolita indometacina indotta lesioni gastriche
Per studiare l'effetto protettivo del pantoprazolo in vivo
, indometacina (10 mg /kg ) è stato somministrato per via intraperitoneale per 16 h in ratti. Il trattamento con indometacina provocato significativamente le lesioni della mucosa gastrica tra erosioni emorragiche e ulcerazioni. Tuttavia, queste patologie gastriche provocate con indometacina sono state significativamente attenuati con iniezione intraperitoneale di 30 mg /kg di pantoprazolo (Figura 5A). Poiché questi effetti protettivi di 30 mg /kg di pantoprazolo contro danni gastrici indometacina indotta erano significativamente soppressa a co-trattamento intraperitoneale somministrati 5 mg /kg ZnPPIX, abbiamo confermato che l'azione protettiva di pantoprazolo era basata sulla sua capacità di HO-1 induzione . Quando le espressioni di HO-1 e ICAM-1 sono stati misurati in omogenati mucose di ogni gruppo, amministrazione indometacina è diminuito in modo significativo le espressioni di HO-1 e ha aumentato l'espressione di ICAM-1. Tuttavia, a causa di un aumento dei HO-1 espressioni dopo pantoprazolo, nonché livelli significativamente attenuati di ICAM-1, indometacina indotta danno gastrico è stato proporzionalmente migliorata nonostante sfida indometacina (Figura 5B). Per dimostrare come pantoprazolo migliorato il angiogenesi difettoso e ischemia provocata da indometacina, EMSA utilizzando HIF-1α è stato eseguito (Figura 5C). Il HIF-1α-DNA legame attività è stata fortemente aumentata nel gruppo sola indometacina, che era significativamente diminuita in omogenati gastrici del gruppo di trattamento pantoprazolo, a significare pantoprazolo significativamente sollevato condizione di ipossia indotta da indometacina. Nel loro insieme, i PPI hanno esercitato una forte protezione contro indometacina indotta danno della mucosa gastrica attraverso significativo HO-1 ad induzione, che è al di là di autentica azione soppressiva acida, anche se non abbiamo misurato i cambiamenti di acidità gastrica. Figura 5 Pantoprazolo impedisce al danno gastrico indometacina indotto attraverso seconda della induzione di HO-1. (A) Media Indice dei danni gastrici indometacina-indotta. (B) RT-PCR per HO-1 e ICAM-1 in base al gruppo. (C) EMSA per HIF-1α in base al gruppo. Indometacina significativamente aumentato HIF-1α-legame al DNA, mentre il pantoprazolo significativamente diminuita HIF-1α-legame al DNA in modo dose-dipendente.
Discussione
Prima della inchiesta, diversi ricercatori hanno pubblicato che i PPI potrebbero prevenire lesioni della mucosa gastrica da altri meccanismi oltre l'azione della sua inibizione specifica di acido [11, 14, 25-28], possiamo aggiungere altre evidenze relative azione protettiva contro IPP FANS. Pantoprazolo significativamente indotta l'espressione di HO-1 attraverso l'attivazione Nrf2 rilevante per azioni anti-infiammatoria, anti-ossidanti, e ischemia alleviare. ritrovamento romanzo di questo studio diverso da altre indagini è che pantoprazolo mostra azioni di protezione al pregiudizio FANS indotta attraverso sia la correzione di handicap angiogenica o l'attenuazione di infiammazione propensione.
Becker JC et al.
[16] hanno dimostrato che sia l'omeprazolo e lansoprazolo protetti cellule epiteliali e endoteliali gastriche umane contro lo stress ossidativo simile al nostro studio, ma utilizzati diversi tipi di PPI. Poiché questo effetto è stata abrogata in presenza di HO-1 inibitore, ZnPPIX, HO-1 sembra essere un bersaglio giusto di IPP sia endoteliali e cellule epiteliali gastriche. In questo studio, abbiamo osservato intatta romanzo constatazione che HO-1 indotta da PPI diminuito infiammazione FANS-sostenuti e alienazione angiogenico. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

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