Eine mögliche Beteiligung von Nrf2-vermittelten Hämoxygenase-1 Hochregulation in Schutzwirkung der Protonenpumpenhemmer Pantoprazol gegen Indometacin-induzierten Magen-Schäden in rats

eine mögliche Beteiligung von Nrf2-vermittelten Hämoxygenase-1 Hochregulation in Schutzwirkung der Protonenpumpenhemmer Pantoprazol gegen Indometacin-induzierten Magen-Schäden bei Ratten
Zusammenfassung
Hintergrund
Protonenpumpen ist ein integrales Membranprotein, das allgegenwärtige ATP-Bindungskassette (ABC) in vielen Transportprozesse in allen lebenden Organismen beteiligt ist, unter die eine spezielle Form der Pumpe, so p
-Typ Protonenpumpen genannt, existiert in den Belegzellen des Magens. Obwohl Protonenpumpeninhibitoren (PPIs) sind häufig nicht-steroidalen Antirheumatika (NSAR) -induzierten Magen-Schäden zu verhindern vorgeschrieben, die Säure unterdrückende Maßnahmen nicht ausreichen, zu erklären.
Methoden
Um die Auswirkungen von Pantoprazol zu dokumentieren , einer von PPIs, auf der NSAR-induzierten Magen-Schäden, in vitro und in vivo

Studien durchgeführt wurden. Immunzytochemie, Western-Blot-Analyse, elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assays und RT-PCR wurden durchgeführt, die Induktion der Hämoxygenase-1 (HO-1) bis Nrf2 Aktivierung in normaler Magenschleimhaut RGM-1-Zellen oder in vivo
Magengewebe zu bewerten von behandelten Ratten mit Indomethacin und /oder Pantoprazol.
Ergebnisse
Pantoprazol aktiviert Nrf2 durch Inaktivierung von Keap1, wonach die Expression von HO-1 wurde in einer dosisabhängigen Weise in RGM-1-Zellen signifikant erhöht. Erhöhte ARE-DNA-Bindungsaktivität wurde maximal mit 300 &mgr; M von Pantoprazol bei 1 h beobachtet. Die Expression von HO-1 durch Pantoprazol induzierten signifikant mit der erhöhten in vitro
tube formation assoziiert war (P
< 0,05) und angiogene Faktoren, einschließlich VEGF, bFGF und HIF-1α. Indometacin erhöht deutlich die Ausdrücke von TNF-α, IL-1ß, IL-8, NOX-1, ICAM-1 und VCAM, während verringerte Pantoprazol deutlich die Ausdrücke von indomethacinvermittelten diese Entzündungsmediatoren in Übereinstimmung mit Pantoprazol-induzierte HO-1 (P
< 0,05), wie mit HO-1-Inhibitor dokumentiert. In vivo
Modell der Magen-Schäden indomethacinvermittelten konnte in vitro
-Rundstahl, gezogen -Rundstahl Ergebnisse bestätigen die bemerkenswert gegen Indometacin-induzierten Magen-Schäden geschützt Pantoprazol, in denen Zink-Protoporphyrin (5 mg /kg, ip
) deutlich abgeschafft die Schutzwirkung von Pantoprazol.
Fazit
Diese Ergebnisse zeigen, dass Nrf2-vermittelte HO-1-Induktion von PPIs eine signifikante Schutzwirkung gegen NSAR-induzierten Magen-Schäden über Säure suppressive Maßnahmen gewährt.
Schlüsselwörter Häm Oxygenase-1 Protonenpumpenhemmer NSAID-induzierte Gastropathie Nrf2 Hintergrund
NSAIDs riesige Mengen vor allem auf die folgenden zwei Vorteile auf Basis Rezept haben, ist eine eine Zunahme von älteren Patienten erforderlich macht NSAIDs Rezept degenerative Veränderungen induzierten Schmerzen zu lindern und die andere ist eine zusätzliche Studie entweder für die Prävention von Darmpolypen oder das Entweichen von ischämischen kardiovaskulären Erkrankungen [1, 2]. Jedoch ist die überwiegende Verwendung von NSAIDs begrenzt durch störende Nebenwirkungen wie Magen Erosions- /Geschwür, kompliziert von Geschwüren Blutungen und ernstere Komplikationen im Dünndarm und Dickdarm entstehen. Da die pharmakologische Wirkung von NSAIDs durch die Hemmung der Prostaglandin (PG) Synthese über die Unterdrückung der Cyclooxygenasen (COX) ist [3], nicht wahrnehmbaren Verminderung der magen Prostaglandin E 2 (PGE 2) ist, dass diese gastrointestinalen verantwortlich (GI) Nebenwirkungen. Obwohl die Erfindung von selektiven COX-2-Inhibitor, coxib, GI Sicherheit zu gewährleisten hat sich als Lösungsstrategie vorgeschlagen, diese Lösung muss auch zu verbessern. Obwohl NSAIDs als potente Anti-Ulkus Drogen verwendet werden, die zusätzlichen unbedeckten Mechanismen der NSAID Toxizität [4, 5] führen uns stärker und sicherer Mittel zu entwickeln. In der heutigen Zeit
, die beste Wahl für NSAR-bezogene GI verhindern Toxizität ist entweder die Kombination von NSAR und Protonenpumpeninhibitoren (PPIs) oder die Wahl der Coxibe [6, 7]. Da die Heilungsrate von GI Geschwüre im Dauereinsatz von NSAR war größer in EPI-Gruppe als Histamin-Typ-2-Rezeptor-Antagonisten (H2-RA) -Gruppe haben EPI als H2-RA bevorzugt worden mit dem negativen Effekt von NSAR zu bewältigen [8, 9 ]. Neben grundlegenden Säure unterdrückende Maßnahmen von EPI, mehrere Funktionen aufgedeckt wurden, die die Reduktion der pro-apoptotische Signal sind, säure unabhängige Wiederherstellung von wuchernden und der Reparatur der Wege [10], eine Verringerung der Schleimhaut oxidativen Schäden, die Heilung fördernde Wirkung und endoplasmatischen Retikulum Spannungsarmglühen Mechanismus [11-16]. Hahm et al.
[17-19] haben auch berichtet, dass PPIs die möglichen Aktivitäten zeigen, als Anti-Krebs-basierte Therapeutika auf selektive Induktion von Apoptose, Anti-Angiogenese gegen Helicobacter pylori
-assoziierten Karzinogenese und direkte anti-mutagen Aktionen während der Tumorgenese. Allerdings sind die Mechanismen, die für die schützende Wirkung von PPIs in Magen-Schäden NSAR-induzierte bleiben bestimmt werden.
Hämoxygenase-1 (HO-1), einem induzierbaren für den ersten und geschwindigkeitsbegrenzenden Enzym von Häm-Abbau, wurde zum Schutz gegen die Zytotoxizität von oxidativem Stress und apoptotischen Zelltod sowie entzündliche Erkrankung [20, 21] bekannt. Fundamental protektive Wirkung von HO-1 gegen Entzündung über anti-oxidative Häm-Abbau vermittelt, sondern auch bei der Herstellung der anti-inflammatorischen Mediatoren zugeordnet, für die Redox-abhängigen transkriptionellen Aktivators, NF-E2-verwandten Faktor 2 (Nrf2) und seine Phosphorylierung /Aktivierung und Oxidation von Kelch-like ECH-assoziierende protein 1 (Keap1) mechanistisch vorgeschlagen [22-24]. Da die Expression von HO-1 durch anti-oxidative, anti-inflammatorischen und ischämischen lindernd Reaktionen in der aktuellen Studie induziert wurde, vermutet man, dass die schützende Wirkung von PPIs gegen NSAIDs induzierten kann Magenschäden HO-1 zusammenhängen und damit die Angiogenese über angeborene Säure Unterdrückung. Insgesamt haben unsere Ergebnisse, die die neuen Mechanismen zeigen, dass die Expression von HO-1 durch Aktivierung Nrf2 /Inaktivierung Keap1 mit der Vergütung von ischämischen Veränderungen und die Dämpfung von Entzündungsmediatoren begleitet PPIs induzieren, wodurch ein Schutz gegen Indometacin-induzierten Magen-Schäden zu erleichtern.
Methoden
Materialien und Zellkulturen
Indomethacin wurde von Sigma Aldrich (St. Louis, MO) erworben und Pantoprazol wurde von Amore Pacific Pharmaceutical Co. (Seoul, Korea) zur Verfügung gestellt. Antikörper für β-Actin, HO-1, α-Tubulin, Keap1, Nrf2 und VEGF alle wurden von Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) erhalten. Normale Ratten Magenschleimhaut RGM-1-Zellen von Prof. Hirofumi Matsui, MD zur Verfügung gestellt wurden, PhD (Tsukuba Univ., Japan), wurden in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% (v
/v
) fötales Rinderserum, 100 U /ml Penicillin. Menschliche Nabelschnur vaskuläre Endothelzellen (HUVECs) wurden in M199-Medium (InnoPharma Bildschirm, Seoul, Korea). Zellen wurden bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2 gehalten. Geeignete Mengen an RGM-1-Zellen oder HUVECs wurden ausgesät und für 24 h inkubiert, dann wurden sie mit der angezeigten Dosis von Pantoprazol oder Indomethacin behandelt und für die angegebenen Zeiten inkubiert. HUVECs wurden auf 1% O bewegt 2 und 5% CO 2 Hypoxie Kammer und für 0-12 h für die in vitro
tube formation Assay inkubiert.
Elektronenspinresonanz (ESR) -Spektroskopie und ROS Generation Messung
Verschiedene Konzentrationen von Pantoprazol hinzugefügt bis zu einem Gesamtvolumen von 200 &mgr; l, enthaltend 0,05 mM FeSO 4, 1 mM H 2 O 2, 1 mM 5,5-dimethylpyrroline-N-oxid (DMPO, Sigma Aldrich, St. Louis, MO) und 50 mM Natriumphosphat bei pH 7,4 bei Raumtemperatur. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von H 2 O 2 eingeleitet. Magnetfeld, 338,0 ±: Nach einer Inkubation von 1 min Aliquots der Reaktionen auf eine Quarzzelle und das Spektrum der übertragenen wurden DMPO-OH wurde unter Verwendung eines ESR-Spektrophotometer (JES-TE300, JEOL, Tokyo, Japan) unter den folgenden Bedingungen untersucht 5,0 mT; Mikrowellenleistung, 4,95 mW; Frequenz, 9.421700 GHz; Modulationsamplitude, 5 mT; Sweep-Zeit, 0,5 min; und die Zeitkonstante, 0,03 s. Cellular ROS Inhalt wurde gemessen, indem die Steuer- oder Pantoprazol Inkubieren behandelt RGM-1-Zellen mit 10 uM H 2DCF-DA (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) für 30 min. Die Fluoreszenz wurde mit einem konfokalen Lasermikroskop gemessen (LSM710, Carl Zeiss, Oberkochen, Deutschland).
Western-Blot-Analyse
Die behandelten Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und dann in eiskaltem Zelllysepuffer (Cell Signaling Technology) lysiert enthaltend 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, Sigma Aldrich). Proteine ​​in Lysaten wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und auf Polyvinylidenfluorid (PVDF) Membranen, die mit primären Antikörpern inkubiert, gewaschen, mit Peroxidase-konjugiertem Sekundärantikörper inkubiert, erneut gewaschen und anschließend visualisiert eine verstärkte Chemilumineszenz unter Verwendung von (ECL) System ( GE Healthcare, Buckinghamshire, UK).
elektrophoretische Mobilität Gel-Shift-Assay (EMSA)
Kern- und Cytoplasma-Fraktionen wurden NE-PER Nuclear extrahiert und Cytoplasma-Reagenzien (Pierce, Rockford, IL) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Antioxidans-Response-Element (ARE) Oligonukleotidsonde, 5'-TTT TCT GCT GAG TCA TCC AGG G-3 'und HIF-1α Oligonukleotidsonde, 5'-TCT GTA CGT GAC CAC ACT CAC CTC-3', wurde mit [ ,,,0],γ- 32P] ATP unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase (Promega, Madison, WI) und von unincorporated getrennt [γ- 32P] ATP durch Gelfiltration einen nick-Spin-Säule (GE Healthcare) verwendet wird. Vor dem Hinzufügen des 32P-Oligonukleotid (1x10 5 cpm), 10 ug Kernextrakt wurde 15 Minuten lang in Gel-Shift-Bindungspuffer auf Eis gehalten. Um die Sequenzspezifität der NF &kgr; B DNA-Wechselwirkung bestimmen, fügten wir einen Überschuß an unmarkiertem Oligonukleotiden. Nach 20 min Inkubation bei Raumtemperatur wurden 2 ul 0,1% Bromphenolblau zugegeben, und die Proben wurden über 6% nicht-denaturierende PAGE bei 150 V in einem kalten Raum elektrophoresiert. Schließlich wurden die Gele getrocknet und exponiert Röntgenfilm (Kodak, Rochester, NY).
Immunocytochemistry
Behandelte Zellen in Kammerobjektträger wurden für 15 min mit 3,7% Formaldehyd fixiert. für 12 h bei 4 ° C: Nach dem Waschen wurden die Zellen in 5% BSA-Lösung, enthaltend 0,1% Triton X-100 in PBS für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert und dann mit dem primären Antikörper (100 1) blockiert. Die Zellen wurden gewaschen, dann 3-mal, mit sekundärem Antikörper inkubiert (1: 300) für 1 h und dann mit 4'-6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, 100 ng /ml) für 1 min bei Raumtemperatur. Nach 3-maligem Waschen wurden die Zellen mit Prolong Gold-Antifade-Reagenz (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) montiert ist. Fluoreszenz wurde unter einem konfokalen Lasermikroskop (LSM710, Carl Zeiss).
RNA Isolation und quantitative reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) visualisiert
Nach der Behandlung wurde das Medium durch Absaugen entfernt und die Zellen wurden mit Dulbecco-Phosphat gewaschen -gepufferten Salzlösung (DPBS) zweimal. RiboEX (Gene All, Seoul, Korea) wurde zu den Platten zugegeben, die dann für 10 min bei 4 ° C inkubiert wurden. RiboEX wurde in einem 1,5-ml-Röhrchen geerntet und platziert, und Chloroform wurde zugegeben und vorsichtig gemischt. Nach Inkubation für 10 min in Eis wurden die Proben für 30 min bei 10.000 × g zentrifugiert. Überstände wurden extrahiert und mit Isopropanol und Mischungen wurden für 1 h bei 4 ° C inkubiert. Nach Zentrifugieren bei 13000 g für 30 min
wurde Pellet mit 70% (v
/v
) Ethanol gewaschen. Nachdem das Ethanol vollständig zu verdampfen, wurden Pellets in Diethylenglykol (DEPC) -behandeltem Wasser (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) gelöst. cDNA wurde unter Verwendung von reverser Transkriptase abgeleitet hergestellt aus murinen Maloney-Leukämie-Virus (Promega, Madison, WI) gemäß den Anweisungen des Herstellers. 94 ° C, 58 ° C für 30 sec, und 72 ° C für 45 sec 20 sec: PCR wurde über 30 Zyklen durchgeführt. Oligonukleotidprimer für PCR (Tabelle 1) wurden aus Bioneer (Daejeon, Korea) gekauft. Alle qRT-PCR-Experimente wurden in dreifacher Ausführung wiederholt und Quantifizierung wurde im Mittelwert ± SD.Table 1 Die Sequenz der PCR-Primer
GAPDH
Vorwärts 5'-GGT GCT GAG TAT GTC GTG GA-3 'gezeigt
umkehren 5'-TTC AGC TCT GGG ATG ACC TT-3 '
HO-1 | Vorwärts 5'-GAG AGC ATG TCC CAG GAT TT-3'
Reverse-5'-GGT TCT GCT TGT TTC GCT CT -3 '
COX-2
Vorwärts 5'-GAA ATG GCT GCA GAG TTG AA -3'
5'-TCA TCT AGT CTG GAG TGG GA Rückwärts -3 '
HIF-1α
Weiterleiten 5'-AAC AAA CAG AAT CTG TCC TC-3 '
Reverse-5'-GGT AAT GGA GAC ATT GCC AG-3'
VEGF
Vorwärts 5'-CAA TGA TGA AGC CCT GGA GT-3
PDGF
Vorwärts 5'-AGG AAG CCA TTC CCG CAG TT-3 ''
5'-GAT TTC TTG CGC TTT CGT TT -3-Reverse '
Reverse-5'-CTA ACC TCA CCT GGA CCT CT-3 '
bFGF
Vorwärts 5'-TAT GAA GGA AGA TGG ACG GC-3'
5'-AAC AGT ATG GCC TTC TGT CC Rückwärts -3 '
IL-1β
Vorwärts 5'-CAT TGT GGC TGT GGA GAA G-3 '
5'-ATC ATC CCA CGA GTC ACA GA Rückwärts -3'
IL-8
Vorwärts 5 ' CAG ACA GTG GCA GGG ATT CA-3 '
Reverse-5'-TTG GGG ACA CCC TTT AGC AT-3'
TNF-α
Vorwärts 5'-TAC TGA ACT TCG GGG TGA TT -3 '
Reverse-5'-CAG CCT TCT CCC TTG AAG AG-3 '
ICAM-1 | Vorwärts 5'-TGT GCT TTG AGA ACT GTG GC-3' 5'-GGT TCT GTC umkehren
CAA CTT CTC AG -3 '
VCAM-1 | Vorwärts 5'-GAG ACA AAA CAG AAG TGG AAT-3'
Reverse-5'-TAC AAG TGG TCC ACT TAT TTC -3 '
NOX1
Vorwärts 5'-GAG AAA TTC TCG GAA CTG CC-3 '
5'-TGT TGG CTT CTA CTG TAG CG Rückwärts -3'
In-vitro-
Angiogenese-Assay
dieser Assay kommerzielle Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers (Millipore, Billerica, MA) durchgeführt wurde. Für hypoxischen Bedingungen waren ECMatrix und Verdünnungspuffer gemischt, um ein festes Gel zu machen, die dann in 96-Well Mikrotiterplatten plattiert wurde. Menschliche Nabelschnurvenenendothelzellen (HUVEC, 1,0 × 10 5 /ml) wurden ausgesät mit Steuerung, Indomethacin, Indomethacin und Pantoprazol, Indomethacin und Pantoprazol und ZnPPIX bei 37 ° C für 4 h inkubiert. Rohrbildung wurde unter einem Lichtmikroskop beobachtet.
Indomethacinvermittelten Modell Magen-Schäden
Insgesamt 48 Ratten von Charles River (Osaka, Japan) erworben wurden. Die Tiere wurden in einem akkreditierten Tieranlage gemäß Vereinigung für Evaluierung und Akkreditierung von Labor Animal Care International (AAALAC International) Leitlinien im Rahmen der Einrichtung namens CaCu (The Center of Animal Care und Use) von Lee Gil Ya Krebs und Diabetes Institute, Gachon behandelt Universität nach Institutional Ethics Review Board Genehmigung. Die Tiere wurden in vier Gruppen aufgeteilt, jeweils bestehend aus 12 Ratten und wurden 24 h vor dem Experiment ausgehungert wie folgt; Alle Ratten wurden mit intraperitonealen Injektion von Indomethacin (10 mg /kg) Magenschäden, zweite Gruppe mit intraperitoneale Injektion von 10 mg /kg von Pantoprazol, die dritte Gruppe mit intraperitoneale Injektion von 30 mg /kg von Pantoprazol und vierten provozieren verabreicht Gruppe mit intraperitoneale Injektion von 30 mg /kg von Pantoprazol und 5 mg /kg ZnPPIX die Aktivität von HO-1 zu hemmen. Die Tiere wurden 16 Stunden nach jeder Verabreichung geopfert. Die Mägen von Ratten wurden entlang der größeren Krümmung und dann mit eiskaltem Phosphat-gepufferte Lösungen gewaschen entfernt und geöffnet. Die Zahl der entweder Erosionen oder Geschwüre wurden unter den vergrösserten Aufnahmen bestimmt. Homogenate aus verkratzt Magenschleimhaut erhalten wurden in flüssigem Stickstoff Tank bis zum Test aufbewahrt.
Statistische Analyse Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Die Daten wurden durch Einweg-ANOVA analysiert und die statistische Signifikanz zwischen den Gruppen wurde durch Duncans Mehrbereichstest bestimmt. Die statistische Signifikanz wurde bei P <
akzeptiert; 0.05.
Ergebnisse | Pantoprazol erhöht HO-1-Expression durch Nrf2 Aktivierung
Auf Basis der vorläufigen Studie, die wir gefunden haben Pantoprazol zeigte die höchste Induktion der HO-1-Expression in RGM-1-Zellen unter EPI, Lansoprazol, Rabeprazol , Omeprazol und Pantoprazol (Daten nicht gezeigt). Pantoprazol erhöht die Expression von HO-1 mRNA und Protein in einer dosisabhängigen Weise (1A) und immunzytochemische Analyse zeigte auch, dass die Höhe der HO-1 wurde von Pantoprazol Behandlung im Zytoplasma von RGM-1-Zellen in einer Dosis deutlich erhöht -abhängig (1B). Um die Mechanismen zu verstehen die unter der Hochregulation von HO-1-Expression durch Pantoprazol, untersuchten wir die Auswirkungen auf die Aktivierung von Nrf2, einem wichtigen Transkriptionsfaktor, der die ARE /Epre gesteuerte Expression von antioxidativen Enzymen vermittelt. Wenn wir die Expression von Keap1 gemessen, behandelt ein Repressor von Nrf2 in zytoplasmatischen Fraktion mit 300 uM Pantoprazol in einer anderen Zeitpunkt deutlich verringerte Expression von Keap1 in 1 h beobachtet (2A), was darauf hindeutet, dass HO-1 könnte transkribiert nach Pantoprazol Behandlung durch Nrf2 Aktivierung und Inaktivierung Keap1. Wie in 2A dargestellt, Nrf2 Kern Kolokalisation war offensichtlich in RGM-1 mit Pantoprazol behandelten Zellen. Die maximale ARE-Bindungsaktivität von Nrf2 wurde in 1 h erhöht sowie seine Kernlokalisations induziert durch Pantoprazol (2B). Um die Kernakkumulation von Nrf2 ermitteln, führten wir eine immunzytochemische Analyse der Anti-Nrf2 Antikörper verwendet. Wie in 2C gezeigt ist, wurde mit 300 uM Nrf2 Pantoprazol Behandlung in Nukleus transloziert. Diese Ergebnisse zeigten, konsequent, dass Pantoprazol könnte HO-1-Spiegel durch die Transkriptionsaktivierung von Nrf2 in Ratten Magenepithelzellen erhöhen. Figur 1 Pantoprazol die Expression von HO-1 induziert. (A) RT-PCR und Western-Blot für HO-1-Expression nach verschiedenen Dosierung von Pantoprazol, 30, 100, und 300 &mgr; M, respectively. Diese Zahlen sind Vertreter der Ergebnisse in drei unabhängigen Experimenten erhalten. (B) Die konfokale Bildgebung von HO-1. Pantoprazol erhöht die Expression von HO-1 in einer dosisabhängigen Weise in normalen Ratten-Magenschleimhaut RGM-1-Zellen.
Figur 2 Pantoprazol erhöht Nrf2 nukleäre Translokation und zytoplasmatische Keap1 Inaktivierung führte zu signifikanten anti-Oxidation. (A) Western-Blots entweder cytosolischen oder nuklearen Keap1 Nrf2 in einer anderen Zeit in Gegenwart von 300 uM Pantoprazol. (B) Elektrophoretische Mobilitätsanalyse (EMSA) für ARE-DNA-Bindungsaktivität. Deutlich erhöhte DNA-Bindung von Nrf2 wurde 60 Minuten nach Pantoprazol Verwaltung zur Kenntnis genommen. (C) Die konfokale Bildgebung von Nrf2 nach unterschiedlichen Dosierung von Pantoprazol, 100 &mgr; M und 300 &mgr; M. (D) Elektronenspinresonanz (ESR) Messung für Fenton Reaktionserzeugten Hydroxylradikale. (E) Die Veränderungen der DCF-DA Fluoreszenz nach unterschiedlichen Dosierung von Pantoprazol, 30, 100 und 300 uM. Pantoprazol deutlich verringert H2O2-induzierte oxidative Fluoreszenz.
Da die biologische Bedeutung der HO-1 Pantoprazol besitzt eine anti-oxidative Wirkung im Zusammenhang mit HO-1-Induktion. ESR-Messung war ultimative Weg, die Erzeugung freier Radikale mit Spinadduktes zu verfolgen, für die wir Hydroxylradikale mit DMPO als Adduktoren unter Fenton-Reaktion erzeugt. Wie in 2D zu sehen, 3 mM Pantoprazol ausgeübt klare Spülwirkung von DMPO-Addukt erzeugenden Hydroxylradikale. Da ESR-Messung in der chemischen Reaktionsbedingungen nicht biologisches System durchgeführt wurde und Pantoprazol ist kein professioneller Antioxidans, beigetragen definitiv Hydroxylradikale sogar abfängt obwohl es relativ hohe Konzentration von Pantoprazol ist reaktiver Sauerstoffspezies abzufangen. Diese chemischen Ergebnisse aus ESR-Studie wurden weiter validiert mit biologischen Test unter Verwendung von DCF-DA Fluoreszenzmessung, die zeigen, dass Pantoprazol zeigte eine signifikante DCF-DA Reduktion in einer dosisabhängigen Weise (P
< 0,05, 2E).
angiogene Aktionen konsequent zu Pantoprazol-induzierte HO-1 | EPI erhöht die Ausdrücke von VEGF-mRNA und Protein in RGM-1-Zellen (3A). Um herauszufinden, ob die inkrementelle Induktion von VEGF zu dokumentieren, mit EPI an HO-1-Induktion verwandt ist, wiederholten wir die Experimente mit PPI allein oder Mitbehandlung von Pantoprazol und Zink-Protoporphyrin (ZnPPIX) als HO-1-Inhibitor. Als Ergebnis konnten wir die Expression von VEGF induziert durch Pantoprazol und inkrementelle Mitbehandlung von ZnPPIX deutlich verringert, die Expression von PPI-induzierte VEGF in einer dosisabhängigen Weise (3B) bestätigen. Als nächstes wir die Änderungen der repräsentativen angiogenen Faktoren untersucht, bFGF, PDGF und HIF-1α und beobachtet diese Ausdrücke relevant Pantoprazol-induzierte HO-1 in 3C. Wie erwartet, erhöhte Pantoprazol deutlich diese Ausdrücke aus mehreren angiogenen Faktoren. Auch diese Induktionen von bFGF und PDGF signifikant mit Mitbehandlung von Pantoprazol und ZnPPIX gedämpft. Um zu überprüfen, ob diese Induktionen von angiogenen Faktor nach tatsächlich Pantoprazol wurden Angiogenese in vitro
Angiogenese-Test wurde durchgeführt (Abbildung 3D). Schlauchbildung signifikant mit 500 uM Indometacin in HUVECs abgeschwächt, während 100 uM Pantoprazol diese Störungen der Angiogenese behandelt mit Indometacin überwinden konnte. Allerdings schaffte zusätzliche Behandlung mit ZnPPIX diese Vorteile der Angiogenese durch Pantoprazol unter Indometacin Verwaltung zu überwinden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Pantoprazol kompensiert NSAR-induzierte defekte Angiogenese durch seine HO-1-Induktion-Fähigkeit. Abbildung 3 Pantoprazol angiogenen Faktoren im Zusammenhang mit HO-1-Induktion induziert. (A) RT-PCR und Western-Blot für VEGF. Signifikante Induktionen von VEGF wurden mit Pantoprazol, signifikant nach 300 uM Pantoprazol (p < 0,05
) zur Kenntnis genommen. Diese Zahlen sind Vertreter der Ergebnisse in drei unabhängigen Experimenten erhalten. (B) Die Veränderungen von VEGF und HO-1 mit Pantoprazol allein oder eine Kombination von Pantoprazol und ZnPPIX. Die Induktion von VEGF nach Pantoprazol war signifikant mit HO-1-Inhibitor abgeschwächt, was bedeutet, die Implikation der HO-1 in PPI-induzierten VEGF. Diese Zahlen sind Vertreter der Ergebnisse in drei unabhängigen Experimenten erhalten. (C) andere angiogene Faktoren zu Pantoprazol zusammen. bFGF und VEGF wurde zunehmend mit Pantoprazol ausgedrückt, aber diese Induktionen wurden mit HO-1-Inhibitor gedämpft. Diese Zahlen sind Vertreter der Ergebnisse in drei unabhängigen Experimenten erhalten. (D) in vitro
Angiogenese-Assay. Rohr Bildung von HUVEC war signifikant mit 50 uM Indometacin verringert. Pantoprazol kompensiert indomethacinvermittelten defekte Angiogenese als mit dem Prozentsatz der Röhrenbildung beurteilt, während HO-1-Inhibitor diese Angiogenese überwinden von Pantoprazol-induzierten abgebrochen. Diese Zahlen sind Vertreter der in 3 unabhängigen Experimenten erhaltenen Ergebnisse.
Pantoprazol-induzierte HO-1 abgeschwächt Indomethacin-assoziierter Entzündungs ​​Angriff
Obwohl Indomethacin ist ein entzündungshemmendes Mittel, es ist bekannt, dass NSAIDs durch Magenschädigung induziert erhöhte Ausdrücken von Entzündungsmediatoren einschließlich TNF-α, IL-1β, IL-8 und NADPH-Oxidase-1 (NOX-1). Wie in 4A zu sehen ist, 500 uM Indomethacin signifikant erhöht die Ausdrücke von TNF-α, IL-1β und IL-8 in Magenepithelzellen, während es die Expression von HO-1 verringert wird, was bestätigt, dass Entzündungsmediatoren könnten mechanistisch mit zugehörigem werden Indometacin-induzierten Magen-epithelialen Zellschäden. In diesem Zustand wird die gleichzeitige Gabe von 500 uM Indometacin und 300 &mgr; M Pantoprazol signifikant verringert die Ausdrücke von TNF-α, IL-1β und IL-8 mit statistisch signifikanter Anstieg der HO-1-Expression begleitet. Darüber hinaus erhöhte sich Indometacin Herausforderung deutlich, die Ausdrücke von NOX-1, bei dem Pantoprazol deutlich die erhöhte Expression von NOX-1 abgeschwächt, was darauf hindeutet, dass die Pantoprazol-induzierte HO-1 eingeführten entzündungshemmende Maßnahmen unter Indometacin. Als nächstes geht weiter, um nachzuweisen, ob diese Dämpfungen von Entzündungsmediatoren nach Pantoprazol von HO-1-Induktion geführt werden, wiederholten wir diese Experimente mit ZnPPIX Verwaltung. Wie in 4B zu sehen ist, beseitigt die Mitbehandlung von ZnPPIX in Gegenwart von Pantoprazol deutlich die Vorteile der entzündungshemmenden Wirkung. Die inkrementalen Induktionen von ICAM-1 und VCAM nach Indometacin Behandlung waren für Ischämie und verschärften Organschäden verantwortlich, bei denen entweder Gefäßentzündung oder eine erhöhte Leukozytenaggregation beschäftigt war. Behandlung mit Indomethacin signifikant erhöht die Ausdrücke von ICAM-1 und VCAM in HUVEC, aber co-challenge von Indometacin und Pantoprazol signifikant verringert Indomethacin-induzierte ICAM-1-Expression relevant zu einer erhöhten Induktion von HO-1 (4C). In diesem Zustand auferlegen ZnPPIX nicht die Dämpfung von ICAM oder VCAM trotz Pantoprazol Behandlung, ferner das begünstigte Wirkung von Pantoprazol gewährleisten in Verbindung mit HO-1-Induktion. Figur 4 Pantoprazol Indomethacin-induzierten Entzündungsmediatoren durch HO-1 gedämpft. (A) RT-PCR für TNF-α, IL-1β, IL-8 und HO-1. 500 uM Indomethacin erhöht die Expression von inflammatorischen Mediatoren einschließlich TNF-α, IL-1β, IL-8, aber deutlich HO-1-Expression verringert. NOX-1 wurde mit Indomethacin signifikant erhöht. Diese Zahlen sind Vertreter der Ergebnisse in drei unabhängigen Experimenten erhalten. (B) Pantoprazol deutlich verringert Indometacin-induzierten IL-1β und TNF-α, aber diese begünstigten Aktionen von Pantoprazol wurden mit ZnPPIX abgeschafft, die den Schluss zulassen, dass entzündungshemmende Wirkungen von Pantoprazol wurden durch HO-1-Induktion. Diese Zahlen sind Vertreter der Ergebnisse in drei unabhängigen Experimenten erhalten. (C) Pantoprazol signifikant verringert Indomethacin-induzierte ICAM-1 und VCAM in HUVEC-Zellen, aber diese Empfänger Aktionen von Pantoprazol wurden auch mit ZnPPIX als HO-1-Inhibitors aufgehoben. Diese Zahlen sind Vertreter der in drei unabhängigen Experimenten erzielten Ergebnisse.
Pantoprazol-induzierte HO-1 geschwächte indomethacinvermittelten
Schädigung des Magens, um die Schutzwirkung von Pantoprazol in vivo
, Indometacin (10 mg /kg untersuchen ) intraperitoneal für 16 h in Ratten verabreicht. Die Behandlung mit Indometacin signifikant Magenschleimhaut Verletzungen einschließlich hämorrhagischen Erosionen und Ulzerationen provoziert. Allerdings sind diese Magen mit Indomethacin provoziert Pathologien signifikant mit intraperitoneale Injektion von 30 mg /kg Pantoprazol (5A) gedämpft. Da diese schützende Wirkung von 30 mg /kg Pantoprazol gegen Indomethacin-induzierte wurden Magenschäden erheblich abgeschafft mit Mitbehandlung von intraperitoneal verabreicht 5 mg /kg ZnPPIX bestätigten wir, dass die Schutzwirkung von Pantoprazol auf ihrer Fähigkeit, HO-1 Induktion beruhte . Wenn die Ausdrücke von HO-1 und ICAM-1 in der Schleimhaut Homogenaten aus jeder Gruppe gemessen wurden, verringerte Indomethacin Verabreichung signifikant die Ausdrücke der HO-1 und erhöht die Expression von ICAM-1. Aufgrund gestiegener HO-1 Ausdrücke nach Pantoprazol jedoch sowie deutlich abgeschwächter Ebenen der ICAM-1, Indomethacin-induzierten Magenschaden wurde proportional trotz Indomethacin Herausforderung (5B) verbessert. Um zu demonstrieren, wie Pantoprazol die defekte Angiogenese und Ischämie durch Indometacin provozierte verbessert, EMSA unter Verwendung von HIF-1α wurde durchgeführt (5C). Das HIF-1α-DNA-Bindungsaktivität wurde stark in Indometacin allein Gruppe erhöht, die im Magen-Homogenaten von Pantoprazol Behandlungsgruppe signifikant verringert war, was bedeutet, Pantoprazol deutlich erleichtert Hypoxie durch Indometacin induziert. Zusammengenommen ausgeübt PPIs einen starken Schutz gegen Indometacin-induzierten Schäden der Magenschleimhaut durch signifikante HO-1-Induktion, die über authentische Säure unterdrückende Wirkung ist, wenn wir nicht die Veränderungen der Magensäure zu messen haben. Figur 5 Pantoprazol verhindert zum Indomethacin-induzierten Magenschaden durch in Abhängigkeit von der Induktion von HO-1. (A) Mittlere Index von Indometacin-induzierten Magen-Schäden. (B) RT-PCR für die HO-1 und ICAM-1 gemäß der Gruppe. (C) EMSA für HIF-1α nach Gruppe. Indometacin deutlich HIF-1α-DNA-Bindung erhöht, während Pantoprazol deutlich HIF-1α-DNA vermindert in einer dosisabhängigen Art und Weise zu binden.
Diskussion
Vor der Untersuchung wurden mehrere Forscher veröffentlicht, dass PPIs Schädigung der Magenschleimhaut verhindern könnten durch andere Mechanismen über die Wirkung seiner spezifischen Säure Hemmung [11, 14, 25-28], könnten wir mehr Beweise bezüglich Schutzwirkung von EPI gegen NSAIDs hinzuzufügen. Pantoprazol signifikant die Expression von HO-1 bis Nrf2 Aktivierung relevant entzündungshemmende, anti-oxidative und Ischämie Entlastungsmaßnahmen induziert. Neuartige Ergebnis dieser Studie unterscheidet sich von anderen Untersuchungen ist, dass Pantoprazol zeigt Schutzmaßnahmen auf die NSAR-induzierte Schädigung entweder durch die Korrektur von angiogenen Behinderung oder der Abschwächung der Entzündung Neigung.
Becker JC et al.
[16] zeigten, dass sowohl Omeprazol und Lansoprazol menschlichen Magen epitheliale und endotheliale Zellen vor oxidativem Stress ähnlich unserer Studie geschützt, sondern verwendet, um verschiedene Arten von EPI. Da dieser Effekt in Anwesenheit des HO-1-Inhibitor außer Kraft gesetzt wurde, scheint ZnPPIX, HO-1 eine rechte Ziel PPIs in sowohl endotheliale und Magenepithelzellen sein. In dieser Studie beobachteten wir unangetastet neue Erkenntnis, dass HO-1 induziert durch PPIs verringert NSAR-entstandenen Entzündung und angiogene Umnachtung. Alle Autoren gelesen und genehmigt haben das endgültige Manuskript.

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