Identifikácia a validácia génov zapojených do žalúdka tumorigenesis

zisťovanie a overovanie génov podieľajúcich sa na vzniku nádorov žalúdka
abstraktné
pozadia
rakovina žalúdka je jedným zo spoločných rakoviny vidieť v južnej Indii. Bohužiaľ viac než 90% sú poskytované v čase, keď hlásiť do terciárneho centra v krajine. Existuje naliehavá potreba charakterizovať tieto rakoviny a pokúsiť sa identifikovať potenciálne biomarkery a nových terapeutických cieľov.
Materiály a metódy používané
sme 24 karcinómov žalúdka, 20 Párové normálny (PN) a 5 zrejme normálne žalúdočné tkaniva získané od pacientov s non-karcinómov žalúdka (zrejme normálne - An) pre štúdium mikročipov nasleduje validácia významných génov (n = 63) o relatívnej kvantifikácii za použitia TaqMan Low Density Array real time PCR. Potom sme použili na mieru bielkovín pole s Quantibody overiť expresiu 15 proteínov v žalúdku tkanivách (4 AN, 9 PN a 9 karcinómov žalúdka). Rovnaký formát poľa bola použitá k štúdiu plazmatické hladiny týchto proteínov u 58 pacientov s karcinómov žalúdka a 18 od pacientov s normálnymi /nemalígna žalúdočných podmienok.
Výsledky
sedemnásť génov (ASPN, CCL15 /MIP-1δ , MMP3, SPON2, PRSS2, CCI3, TMEPAI /PMEPAI, SIX3, MFNG, SOSTDC1, SGNE1, SST, IGHA1, AKR1B10, FCGBP, ATP4B, NCAPH2) bolo preukázané, že sú rozdielne exprimované medzi nádory a spárované normálne, pre prvý čas. EpCAM (p = 0,0001), IL8 (p = 0,0003), CCl4 /MIP-1β (p = 0,0026), CCL20 /MIP-3α (p = 0,039) a TIMP1 (p = 0,0017), tkanivové hladiny proteínov boli významne odlišné (Mann Whitney U test) medzi nádorov versus & PN. Okrem toho, medián plazmatické hladiny IL8, CXCL9 /MIG, CCI3 /MIP-1 a, CCL20 /MIP-3a, PDGFR-B a TIMP1 proteíny boli významne odlišné medzi skupinou nemalígna a žalúdka skupiny rakoviny. V post-chirurgické hladiny EpCAM, IGFBP3, IL8, CXCL10 /IP10, CXCL9 /MIG, CCI3 /MIP-1α, CCL20 /MIP-3α, SPP1 /OPN a PDGFR-B vykazovali jednotný pokles na všetky vzorky študované.
Závery
Naša štúdia identifikovala niekoľko génov rozdielne exprimovaných v žalúdočných rakovín, niektorí prvýkrát. Niektoré z nich bola potvrdená na úrovni proteínu, rovnako. Niektoré z týchto proteínov bude musieť byť ďalej hodnotené z hľadiska ich potenciálnych ako diagnostické biomarkery v žalúdočných rakovín a niektoré by mohli byť užitočné ako nadväzujúcich markerov rakoviny žalúdka.
Úvod
rakovina žalúdka je jedným zo spoločných rakoviny vidieť v južnej Indie, zaradil 2 nd u mužov a 5 st medzi ženami v oblasti Chennai metropolitnej [1]. O pacientov na terciárne inštitúcie, viac ako 90% sú poskytované na prezentáciu a iba paliatívnej terapii je možné u týchto pacientov [2]. V roku 2005 a 2006, celkovo 1239 pacientov s karcinómom žalúdka boli zaznamenané u inštitútu, z ktorých 211 pacientov bolo už skôr liečených inde. Medzi doteraz neliečených pacientov (n = 1028), 61% boli lokálne pokročilých a 39% bolo s vzdialených metastáz. Vzhľadom k pokročilej povahe choroby a vzhľadom k celkovo zlom stave, len 91 pacientov prišiel na operáciu s úmyslom vyliečiť. To poukazuje na problém nedostatku včasné odhalenie pre rakovinou žalúdka v Indii.
V Japonsku, ktorá má vysoký výskyt rakoviny žalúdka, photofluorography screening sa vykonáva ako skríningového programu pre populáciu, čo vedie k skorej detekcii lézií, niektorí obmedzujú na sliznici iba [3]. Takýto postup je nepravdepodobné, že by riešenie vo veľkej krajine, ako je India. Vzhľadom k jemné príznaky, ako sú zažívacie ťažkosti, postupné chudnutie, ktoré sú všeobecne ignorované, väčšina pacientov prítomných s pokročilým ochorením. Je preto nevyhnutné vytvoriť spoľahlivé skríningové testy, ktoré môžu pomôcť pri včasné odhalenie choroby. Testy založené na sérové ​​pre pepsinogénu a H. pylori protilátky neboli získali široké uznanie a neboli považované pre skríning jedinca National Cancer Center, Tokyo, Japonsko [3]. Diagnostický test by mal byť s výhodou krvi alebo vzorky moču na báze a musí byť konkrétny.
Jedným z hlavných rizikových faktorov pre rakovinu žalúdka, strava hrá dôležitú úlohu. Spotreba slané potraviny (ryby a mäso) a tabaku sú spojené so zvýšeným rizikom [4-6]. Chronické atrofickej gastritídy a črevné metaplázia boli považované za pre-malígne zmeny v žalúdočnej sliznici. Fajčenie tabaku, H. pylori, strava s vysokým obsahom soli, dusitanov a dusičnanov a nízkym príjmom ovocia a zeleniny sú známe rizikové faktory pre chronickú atrofickú gastritídu [7]. Juh Indian strava sa tradične skladá z vysokého obsahu chladný a vyprážané potraviny, pričom olej používaný pre vyprážanie prechádza niekoľko cyklov použitia predtým, ako ich zlikvidovať, a tým s vysokým obsahom karcinogénov [5, 8, 9].
Karcinómu žalúdka sú prevažne adenokarcinómov a mohla by byť z troch čiastkových typov - črevné, difúzna a zmiešanými [10]. Črevné typ rakoviny žalúdka je zvyčajne vidieť v distálnej časti žalúdka, má prekancerózne stupňa a pozostáva z koherentnej rakovinové bunky tvoriace žľazy, ako štruktúr [11]. Väčšina črevných typy sú dobre až stredne diferencovaný (klasifikácia WHO). Typ difúzie sa skladá z jednotlivých rakovinových buniek infiltrujúcich a šíri ďaleko za jeho hranicami makroskopických. Oni sú zvyčajne zle diferencované na nediferencované [12]. V meste Chennai, distálnej nádory sú častejšie než proximálnych rakoviny.
Génové expresie štúdie u rôznych druhov rakoviny pomohli pri identifikácii génov zapojených do procesu vzniku nádorového ochorenia [13]. Boli hlásené microarray štúdie porovnávajúce génovej expresie rozdiely medzi normálnym žalúdka a rakovinou žalúdka [14], medzi nádory mladých a starších pacientov s karcinómom žalúdka "[15], medzi primárneho nádoru a metastatických lézií [16]. Naša štúdia porovnáva génovú expresiu medzi zdanlivo normálny žalúdočných tkanivách získaných od pacientov s non-karcinómov žalúdka (zrejme normálne - an), vzoriek žalúdočnej tkanív v dostatočnej vzdialenosti od nádoru a potvrdených ukotvené časti nemať nádorových buniek (Párové normálne - PN) a žalúdočné rakoviny (Nádory - T). Ide o prvú štúdiu, ktorá by sa zaoberala génovej expresie vzory žalúdočné rakoviny v južnom Indickom pacientov a overovať niektoré z týchto génov na úrovni proteínu pre ich potenciál ako biomarkerov rakoviny žalúdka.
Materiály a metódy
Päť AN vzorky (2 od pacientov s rakovinou hypofaryngeální, 1 z horného pažeráka spinocelulárneho karcinómu, 1 z peri-ampulární karcinómu, 1 z rakoviny pankreasu) od pacientov, ktorí podstúpili žalúdočné resekcii ako súčasť svojho primárneho chirurgického zákroku boli zaradení do štúdie. Okrem toho, 24 karcinómov žalúdka a 20 PN boli zahrnuté do tejto štúdie. Všetci pacienti predpokladu, že ich informovaný súhlas k štúdiu, ktorá bola schválená etickou komisiou Institutional.
Operatívny Vzorky boli ihneď spracované a rezy boli odobraté pre zmrazené sekcie. Vzorky nádorov, nádorových buniek s viac ako 70%; PN a vzorky bez preukazu nádorových buniek a zdanlivo normálne morfológiou boli zaradení do štúdie.
Okrem toho boli odoberané vzorky krvi od jedincov prechádza oesophagogastroduodenoscopy (OGDscopy) pre dyspeptických príznakov, a preto, aby sa vylúčila patológie hornej časti tráviaceho ústrojenstva. Z toho sa zistilo, že 58 ako žalúdočné rakoviny, zistilo šesť mať benígne patológiu v žalúdku (gastritídu, benígne vred) a 12 mali normálnu správu OGDscopy. U 8 pacientov s rakovinou žalúdka, ktorí podstúpili radikálnu operácie, pooperačné krvnú vzorku bol tiež zhromaždené medzi dňom 7. a 15. deň s výnimkou dvoch pacientov, u ktorých sa vzorka zhromaždených v čase ich prvé kroky v nadväznosti po chirurgickom zákroku (v dňoch 55 a 64) .
extrakcie RNA
RNA bola extrahovaná zo vzoriek tkaniva s použitím extrakcie RNA sady RNeasy (Qiagen, GmbH, Hilden, Cat no: 74106) podľa inštrukcií výrobcu. Kvalita RNA použité pre analýzu micro-array bola kontrolovaná pomocou Bioanalyzer a vzorky s RNA Integrity číslo (RIN) zo 7 alebo viac, boli zaradení do štúdie. RNA bola kvantifikovaná s použitím Nanodrop ™ ND1000 (NanoDrop Technologies, USA) spektrofotometra.
Detekcia H pylori
analýza pre H. pylori vo vzorkách žalúdočné tkaniva bola vykonaná za použitia PCR, ako bolo opísané skôr [17]. PCR priméry navrhnuté pre amplifikáciu oblasti S2 z Vac A génu v genóme pylori H boli použité pre detekciu. Reakcia zosilňuje amplikón s dĺžkou asi 194 bp
microarray experiment
1 ug celkovej RNA z nádoru /PN /A vzorka a univerzálne RNA (Stratagene, kat č: 740000-41). Bola reverzne transkribovaných s použitím Array script pri 42 ° C po dobu 2 hodín na získanie cDNA s použitím amplifikačnej súpravy amino Alyl MessageAmp II Arna (Ambion, Austin, TX; katalógové číslo: AM1797). CDNA bola amplifikovaná, označené, hybridizovány a skenované šmykľavky, ako bolo opísané skôr [18]
všetko surové dátové súbory boli predložené GEO s prideleným číslom GEO prístupovým. -. GSE17154
analýzu Microarray dát
popredia a pozadia Median intenzita pre Cy3 a Cy5 boli importované do softvéru BRB-ArrayTools [19] pomocou funkcie Sprievodcu importom. Korekcia pozadia nebolo vykonané. Globálne normalizácie bol použitý k mediánu stredu prihlasovacie pomery na každej pole s cieľom prispôsobiť pre rozdiely v intenzitách označovania týchto farbív Cy3 a Cy5. Dáta boli analyzované pomocou porovnávacej Class modul [20] v softvéri BRB-ArrayTools.
Triedy porovnanie v BRB-Array Tools
Zistili sme, že gény, ktoré boli rozdielne exprimovaných medzi 3 tried (tumor /PN /A) pomocou modulu triedy porovnanie. Jednorozmerný F-test bol použitý a gény boli považované za štatisticky významné v prípade, bola ich hodnota p < 0,001. Okrem toho bolo potrebné dvojnásobný rozdiel medzi rôznymi triedami
Kvantitatívne PCR v reálnom čase v reálnom čase
potvrdenie expresie génu bola vykonaná pomocou TLDA PCR v reálnom čase (Applied Biosystems, Foster City, CA; Cat č .: 4342261). Trojmo cDNA vzorky šablóny boli zosilnené a analyzované na systéme ABI Prism 7900HT detekcie sekvencie (Applied Biosystems, Foster City, CA), ako je opísané skôr [18].
Nespracované dáta zo systému detekcie sekvencie Prism 7900HT bola importovaná do aplikácie Microsoft Excel softvér pre štatistickú analýzu dát. Medzi endogénnych referenčných génov zahrnutých v Array (18S ribozomálnu gén, ACTB), ACTB bol vybraný po vizualizáciu globálnej distribúcie Ct hodnota, za normalizácie dát. Okrem toho, HSPE1, ktorá bola zaradená na báze diferenciálnej expresie vidieť na mikroskopické sústavy, sa zistilo, že minimálny rozdiel a teda bol zaradený ako ďalší vnútorná kontrola. Tieto TLDA testy prebiehali pri LabIndia Instruments Pvt Ltd. laboratóriami Gurgaon, New Delhi.
Vzorky AN boli použité na kalibráciu a relatívnej hodnoty kvantifikácie boli vypočítané pre všetky gény a vzoriek.
Gene Ontology Analýza
na zistené, že sú rozdielne exprimované v nádoroch a spárovanie normál "založených na údajoch o microarray importovaná do modulu Fatig z Babelomics [21] a analyzované na nadmerné zastúpenie GO podmienok v porovnaní so zvyškom genómu génov, s použitím Fisherov presný test pre 2 × 2 kontingenčných tabuliek. Hodnota p bola nastavená na < 0.05.
Príprava proteínových lyzátov tkaniva a zbierka plazma
Proteínové lyzáty pre analýzu za použitia protilátok polí boli pripravené z 60-80 mg zmrazených vzoriek žalúdočnej tkaniva. Vzorky tkaniva boli obrúsené v prítomnosti kvapalného dusíka za použitia trecej misky a paličky. Práškový tkanivo sa znovu suspenduje v tkanivovej lyzačného pufra (Tris, pH 7,5 HCl, 150 mM chlorid sodný, 1% deoxycholát sodný, 1% NP40). Pred použitím, lyzačný pufer bol doplnený Complete ™ mini kokteilu inhibítora proteázy (Roche Diagnostics GmbH, Nemecko). Proteínové lyzáty boli podrobené sonikaci za použitia vibračné bunku ™ (Sonics Inc., USA) sonikátor. Lyzáty boli schválené odstreďovaním a kvantifikuje použitím Coomassie Plus-Bradford test ™ činidlo (Pierce Inc., USA) podľa protokolu výrobcu. Kvalita proteínov sa analyzovala štiepením 50 ug lyzátu na 10% dodecylsulfát sodný (SDS polyakrylamidovom gélu) a následne vizualizované farbením pomocou Coomassie Blue.
Plazma bola získaná z 5 ml krvi odobratej v prítomnosti 200 ul 10% etyléndiaminotetraoctová kyselina octová (EDTA). Plazma izolované zo vzoriek krvi bola odstredí pri 3000 g a skladované pri -80 ° C v alikvótoch
protilátka pole
Arrays Vlastné protilátok Quantibody ™ Array (Katalógové číslo: Qaa-CUST). Založených na systéme multiplexu ELISA kvantitatívneho merania viac proteínov získaných od Ray Biotech, Inc., USA bol použitý pre štúdium úrovne expresie proteínu v žalúdočnej tkaniva a vzorky plazmy [22, 23]. Tieto gény (CXCL5 /ENA-78, CXCL8 /IL8, CXCL10 /IP10, CXCL9 /MIG, CCI3 /MIP-1α, CCL15 /MIP-1δ, EpCAM, MMP3, SPP1 /OPN, TIMP1, Adipsin /CFD, CCl4 /MIP-1β, CCL20 /MIP-3α, PDGFR-B a IGFBP-3) sa zistilo, že je nadmerne vystavený u karcinómov žalúdka v porovnaní s PN a AN (s výnimkou CFD /Adipsin, ktorý bol nadmerne exprimovaný v PN vzhľadom k karcinómov žalúdka a) boli študované pre ich úrovňou bielkovín v nádore, čo zodpovedá PN a v tkanivách. Okrem toho, plazmatické hladiny týchto proteínov u pacientov, ktorí podstúpili OGDscopy boli odhadnuté s použitím rovnakého formátu poľa (58 pacientov s rakovinou žalúdka, 6 s benígna žalúdočný alebo duodenálny vred alebo zápal žalúdka a 12 s bežnou správou OGDscopy). U 8 pacientov s rakovinou žalúdka, ktorí podstúpili radikálnu operácie, pred a pooperačné vzorky boli zhromaždené a analyzované.
Test bol vykonaný ako je popísané v návode výrobcu. Stručne povedané, v prípade tkanivových lyzátov 100 ug proteínového lyzátu bol pripravený zriedením tkanivového lyzátu zásobného roztoku pomocou riediaceho pufru k dodané výrobcom na konečnú koncentráciu 1 mg /ml. 100 ul zriedeného lyzátu bolo inkubovať v poli komore po dobu 2 hodín. V prípade vzoriek plazmy, plazma bola zriedená riediaceho pufru k dodané s kitom v pomere 1: 1. 100 ul zriedeného vzorky plazmy sa inkubuje v poli komore po dobu 2 hodín. Pre každé pole experiment, normy dodávané spolu so súpravou boli čerstvo pripravený ako je popísané v protokole výrobcu a sú zahrnuté spolu s kontrolnou vzorkou riedidlo pufrom (negatívna kontrola), ktoré ani mal štandardný alebo vzoriek. Čipy boli spracované ako je popísané v protokole výrobcu. Sklíčka bola skenované pri 5 μ rozlíšení a PMT 70 za použitia Pre Scan Array ™ (Perkin Elmer Inc., USA). Pri týchto nastavení skenera signály z najvyššou koncentráciou štandardného nedosiahlo nasýtenia. Dáta boli analyzované s použitím Quantibody Q-Analyzer, pole špecifický, program založený Microsoft Excel, dodaný s vlastnými poľami.
Štatistická analýza
mediánu a rozpätie pre plazmatické hodnoty boli vypočítané s použitím tabuľkového procesora Microsoft Excel ™ softvér (Microsoft, Inc.,). Mann Whitney U test (http: ... //Fakulty Vassar edu /Lowry /Utest html) bol použitý na štúdium významu stredných hodnôt v plazme a dve sledoval test bol použitý pre získanie p hodnota.
Výsledky
klinicko-patologické podrobnosti o všetkých pacientov, ktorých vzorky boli použité pre analýzu microarray a ich vzorky nádorov, sú uvedené v ďalšej súbor 1 a 2. klinicko-patologické údaje o chorých od ktorého krvné vzorky boli získané na stanovenie plazmatických hladín cytokínov /chemokiny /rastových faktorov sú uvedené v ďalšej oblasti 3.
z 24 pacientov, ktorých nádorové vzorky boli použité pre štúdiu microarray, 16 boli vo veku viac ako 45 rokov a 8 bolo 45 rokov alebo menej; 18 boli muži a šesť boli ženy; 5 boli nádory vznikajúce v oblasti kardio, 2 z tela a 17 z dutine. Všetky dvadsaťštyri nádory boli adenokarcinóm s jedným z nich je zle diferencovaný adenokarcinóm s oblasťami neuro-endokrinné funkcie. Medzi adenokarcinómov, Črevné subtyp bol najviac obyčajný (n = 16), zatiaľ čo difúzna podtyp bol videný v 5 a mieša sa v 2. stupeň prevažovali nádory III (n = 20), s žiadnymi nádory Grade Aj v našom seriáli. Sedemnásť z 24 vzoriek uzla pozitívne a 4 mal vzdialených metastáz na prezentáciu.
Na základe porovnania analýzy triedy (hodnota p = 0,001 a 2 násobný rozdiel) so sídlom, sme mali 61 génov nadmerne vystavený u rakoviny, 66 v párových normálne a 61 s ap hodnota < 1e-07 v zdanlivo normálne (ďalší súbor 4). Použili sme TaqMan relatívna kvantifikáciou RT-PCR pre overenie niektorých génov identifikovaných microarray analýzy. ACTB bol vybraný ako endogénne kontroly, ktorý bol navyše k 18S riadenie prítomná v TLDA karte.
Všetkých 49 vzoriek pracoval v teste TLDA ale 2 gény, C11orf42 a IGLL1 nemal pracoval. HSPE ktorý bol zistené, že diferenciálne expresiu vo vzorkách v našej microarray analýzy nepreukázali zmenu v úrovniach, v teste TLDA a bol zaradený ako dodatočný endogénne kontroly. Normalizácia sa vykonáva pomocou ACTB a HSPE ako endogénne kontroly. Z 63 génov vybraných, s výnimkou endogénnych kontrol (ACTB a HSPE) a dvoch génov, ktoré nefungovalo, sme mali 59 gény pre ďalšiu analýzu.
Tri z týchto génov (REG4, CLDN18, MXRA5) bola zahrnutá do validácia ich potenciál ako prognostický marker pre zlyhanie. Avšak, v intervale medzi okamihom, ktorý bol dokončený analýza microarray a analýzy RQ-RT-PCR bola vykonaná (približne 3 mesiace) bolo ďalšie pacienti, ktorí relapsom a teda gény neboli zohľadnené pre ďalšiu analýzu ako prognostických markerov. Avšak, boli zahrnuté pre vyhodnotenie splnenia odlišne exprimované medzi PN a nádorov.
Zoznam génov, ktoré boli identifikované, ktoré majú byť rozdielne exprimované v žalúdočných nádorov sú uvedené v tabuľke 1 a tabuľke 2. Tabuľka 1 uvádza gény vymedzené byť rozdielne exprimované v žalúdočnej rakovina prvýkrát a v tabuľke 2 je uvedený zoznam génov, ktoré boli známe, že súvisia s rakovinou žalúdka, a tiež nájsť v našej štúdii. (Ďalšie súbory 5 a 6 poskytujú informácie o týchto génov a zodpovedajúcich referencií). Existujú štyri rôzne vzory génovej expresie - Pattern 1 - nadmerne vystavený u PN a nádorov; Vzor 2 - nadmerne exprimovaný v PN, ale downregulated u nádorov; Vzor 3 - minimálna zmena v PN, ale nadmerne vystavený u nádorov a vzor 4 - minimálnou zmenou PN, ale downregulated v nádoroch (obrázok 1) .Table 1 Gény hlásené byť rôzne vyjadrená po prvýkrát u rakoviny žalúdka [Referencie a podrobnosti v ďalší súbor 4]
SNO
GENE SYMBOL
up reguláciu hlásené u Logo Microton: Referencie
1
CCL15 /MIP5 /MIP-1D /LKN1
NSCLC
[SF 5-R1]
2
ASPN
rakovina prsníka
[SF 5-R2] Sims 3
MMP3
kolorektálny karcinóm
[SF 5-R3]
4
SPON2
pľúc, vaječníkov, prostaty
[SF 5-R4]
[SF 5-R5]
[SF 5-R6]
5
PRSS22
karcinómu vaječníkov
[SF 5-R 7]
6
CCI3 /MIP 1A
ústnej SCC
[SF 5-R8 ]
7
TMEPAI /PMEPAI
Neuro-endokrinné nádory
[SF 5-R9]
8
SIX3
9
MFNG
Downregulated v rakovinu krčka maternice
[SF 5-R10]
10
SGNE1 /SCG5
endokrinné nádory
11
SOSTDC1
Downregulated v obličkovej rakovina
[SF 5-R11]
12
SST
Downregulated v pažeráku adenokarcinóm
[SF 5-R12]
13
IGHA1
14
AKR1B10
Zvýšený Barrettova epitelu
[SF 5-R13]
15
FCGBP
dole regulovaným v hrubom čreve cca
[SF 5-R14]
16
ATP4B
17
NCAPH2
Tabuľka 2 gény, ktorých sa podieľa rakovina žalúdka nádorového ochorenia identifikovaná v tejto štúdii [Referencie a podrobnosti v ďalší súbor 5]
S NIE
spoločností GENE SYMBOL
nahor alebo nadol regulované Logo Microton: Referencie
1
CTSB
up-regulované a to najmä v Cardia tumours
[SF6-R1]
2
SPARC/Osteonectin
Up-regulated
[SF6-R2]
3
COL1A1
Up-regulated
[SF5-R3]
4
COL1A2
Up-regulated
[SF5-R3]
5
COL4A1/Arresten
Up-regulated
[SF5-R4]
6
CXCL1/GRO1/MGSA
Up-regulated
[SF5-R5]
7
SPP1/osteopontin
Up-regulated
[SF5-R6]
8
CXCL9/MIG
Up-regulated
[SF5-R7]
9
IL8/CXCL8
Up-regulated
[SF5-R8]
10
TIMP1
Up-regulated
[SF5-R9]
11
LUM/SLRR2D/LDC
Up-regulated
[SF5-R10]
12
CXCL5/ENA78
Up-regulated
[SF5-R11]
13
CXCL10/INP10/IP10
Up-regulated
[SF5-R4]
14
CEACAM6
Up-regulated
[SF5-R12]
15
REGIV
Up-regulated
[SF5-R13]
16
S100A10/ANX2L/CAL1L
Up-regulated
[SF5-R14]
17
SERPINH1/HSP47/CBP1
Up-regulated
[SF5-R15]
18
CDH3
Up-regulated
[SF5-R16
19
TACSTD1/EPCAM/CD326
Up-regulated
[SF5-R17]
20
IFITM1/LEU13
Up-regulated
[SF5-R18]
21
CTHRC1
Up-regulated
[SF5-R19]
22
SULF1
Up-regulated
[SF5-R20]
23
RNASE1
Down-regulated
[SF5-R21]
24
PGC
Down-regulated
[SF5-R22]
25
PGA5
Down-regulated
[SF5-R22]
26
GIF
Down-regulated
[SF5-R23]
27
LTF
Down-regulated
[SF5-R24]
28
TFF1
Down-regulated
[SF5-R25]
29
CLDN18
Down-regulated
[SF5-R26]
30
CFD/Adipsin
Secreted žalúdočné ca bunkou lines
[SF5-R27]
31
GHRL/Obestatin
Down-regulated
[SF5-R28]
32
LIPF
Down-regulated
[SF5-R29]
33
ANXA10
Down-regulated
[SF5-R30]
Obrázok 1 hodnoty RQ spárovaných normál (PN) (n = 20) a nádorov (n = 24), za použitia normálne (AN) (n = 5), ako kalibrátora. Prehyb zmena je vzhľadom k zdanlivo normály.
Potom sme postupovali na potvrdenie expresie proteínu pre niektoré z génov v (n = 4), PN (n = 9) a nádory (n = 9). Použili sme Quantibody poľa, ktorý je založený na princípe sendvičového testu ELISA pre stanovenie hladín proteínov z 15. cytokínov, chemokiny a rastových faktorov [22, 23]. Medián hodnoty a rozsah úrovní sú uvedené v tabuľke boli zistené 3. CFD /Adipsin medián hladiny nižšia u nádorov v porovnaní s úrovňou v PN a (p = 0,0324), zatiaľ čo CXCL5 /ENA78, CCL20 /MIP- 3α, IGFBP3, SPP1 /OPN a TIMP1 boli v PN a nádory v porovnaní zvýšil na, s vyššou úrovňou videných v nádoroch. Na rozdiel od toho EpCAM, IL8, CXCL10 /IP10, CCI3 /MIP-1α, CCl4 /MIP-1β, CCL15 /MIP-1δ, PDGFR-B boli prevažne zvýšené v nádoroch v porovnaní s a PN. EpCAM (p = 0,0001), IL8 (p = 0,0003), MIP-1β (p = 0,0026), MIP-3α (p = 0,039) a TIMP1 (p = 0,0017), hladiny boli významne odlišné (Mann Whitney U test) medzi nádory versus &Co. PN. Navyše, EpCAM (p = 0,0004), IL8 (p = 0,0015) a MIP-1β (p = 0,0061) boli významne zvýšené v nádoroch v porovnaní s ich zodpovedajúcimi PN.Table 3 stredné hodnoty pre cytokínov a chemokiny v PN a nádorových lyzátov

PN

PN
nádor
tumour

Median v pg /ml
Dosah vo pg /ml
medián v pg /ml
Dosah vo pg /ml
medián v pg /ml
Dosah vo pg /ml
CFD /Adipsin
27295,0
22097,9-31759,9
27162,9
19515,1-38224,3
13.021,0 *
9441,5-36873,1
CXCL5 /ENA-78
283,8
39,3-4206,1
2922,7
84,9-31628,7
3978,0
723,9-40669,6
EpCAM
1466,0
905,7-2266,6
2243,5
915-8885,8
18717,6 *** /## #
8966.1 - 34529
IGFBP-3
3149,8
124,0 - 17530,2 12286,0
134,6-34036,3
17662,7
196,9-55671,5
IL-8 /CXCL8
22,1
0-62,3
53,1
27,4-190,6
1240,4 *** /###
93,1-3660,7
CXCL10 /IP-10
20,4
1,4-146,1
147,0
0,8 až 3940,9
384,4
0,7-1643,1
CXCL9 /MIG
369.5 NETHRY.cz 0 - 8569,7 4336,1
1077.2 - 19396,6
7540,3
727,7-73975,9
CCI3 /MIP-1α
0,0
0 až 187,4 203,6
0-1.177,2
359,0
0-3.231,5
CCl4 /MIP-1β
49,5
0 až 261,8
94,3
0 - 335.8 578.6
** /#
28,7-1185,2
CCL15 /MIP-1δ
86,0
54-157,3
169,3
51,7-748,9
374,3
63,4-2825,4
CCL20 /MIP-3α
859,3
76,1-1784,8
3049,6
893-16262,9
4773,4 *
1014,4 - 13280,7
MMP-3
269,0
0 - 648,6
143,9
0 - 353,1
0,0
0-2.908,2
SPP1 /OPN
447,0
9,1-896,3
2054,0
193,6-3183,7
1407,1
12,6-5.819,2
PDGF RB
222,3
174,3-521,4
295,3
184,9-1079,3
578,6
123,7-1516,8
TIMP-1
9676,2
4373,3-17.133,2
27022,2 17028,3
- 194387,8 139365,6
**
48146,4-367203,2
AN - Zrejme normálne; PN - Spárovaná bežné
p hodnotu významné pre + PN proti nádoru -
* - < 0,05; ** - ≪ 0,005; *** - ≪ 0,0005 Mann Whitney U testu
hodnotou p významné pre PN proti nádoru -
# - < 0,01; ## - ≪ 0,005; ### - ≪ 0,0005 Mann Whitney U testu
plazmatické hladiny 15 cytokínov /chemokiny /rastovými faktormi sa odhadli pomocou poľa Quantibody. K vybaveniu 18 nemalígna puzdra (12, bez abnormality zistené OGDscopy a 6 s benígne patológie v žalúdku), bol odbitý dohromady a boli porovnané so strednou hodnoty medzi nádory a skupiny nemalígna. Mann Whitney U test bol vykonaný pre posúdenie štatistickej významnosti (dva chvostom test). IL8, úrovne CXCL9 /MIG, CCI3 /MIP-1α, CCL20 /MIP-3a, PDGFR-B a TIMP1 v plazme boli významne odlišné medzi skupinou nemalígna a žalúdka skupiny rakoviny (tabuľka 4). SPP1 úroveň /OPN boli tiež vyššie u pacientov s karcinómom žalúdka v porovnaní so skupinou nemalígna ale bol na hranici významný (p = 0,05). V post-chirurgické hladiny EpCAM, IGFBP3, IL8, CXCL10 /IP10, CXCL9 /MIG, CCI3 /MIP-1α, CCL20 /MIP-3α, SPP1 /OPN a PDGFR-B vykazovali jednotný pokles všetkých 8 vzoriek študovaných. V kontraste TIMP1, CCL15 /MIP-1δ a CFD /Adipsin hladiny v skutočnosti zvýšená v pooperačnom období, vo väčšine vzoriek (Obrázok 2) .Table 4 stredné hodnoty pre cytokínov a chemokiny v plazme nemalígna pacientov oproti plazme pacienti s žalúdočnými karcinómy

medián non-malígne (n = 18) (v pg /ml)
RANGE (v pg /ml)
MEDIAN pre nádory (n = 58) (v pg /ml)
rozsahu (v pg /ml)
CFD /Adipsin
71.520,0
58000,8-77527,9
69236,4
27926,9-95255,7
CXCL5 /ENA-78
1100,6
0-7.203,2
1702,8
0-11588,5
EpCAM
1789.8 NETHRY.cz 0 - 13627,3
3527,1
0-35009,2
IGFBP-3
119467,1
20.164,6-174498
110395,1
0-979359,6
IL-8 /CXCL8
22,5
0-69,9
48,9 *
0 až 396,3
CXCL10 /IP-10
670,2
0-3.328,9
931,1
0-5.158,9
CXCL9 /MIG
6069,2
0-18739,7
7561,8 *
505-6 - 86999
CCI3 /MIP-1α
1464.8 NETHRY.cz 0 - 10602,2
2335,1 *
0-32199
CCl4 /MIP-1β
43,0
0 až 440,1 127,9
0-2.138,5
CCL15 /MIP-1δ
6628,8
1.237,8-13178,1
5577,9
696,3-11054,4
CCL20 /MIP-3α
139,9
0-1.994,1
654,6 #
0-12013,1
MMP-3
10966,2
3891,2-38928,9
13680,1
1358,7-80588,8
SPP1 /OPN
4621,5 NETHRY.cz 0 - 20518.1
8680.5 NETHRY.cz 0 - 110373.2
PDGF RB
1391,5
0 - 5461.8
2300,5 *
0-34754,4
TIMP-1
31048,9
15603.8 - 220729.6
98054,6 #
6252.5 - 463.941
# - p hodnota < 0,01; * - P hodnota < 0,05 Mann Whitney U test
obrázku 2 Pre (1) a Pooperačné (2) plazmatické hladiny cytokínov /chemokiny /rastových faktorov rakoviny žalúdka (n = 8). Hladiny v plazme boli merané pomocou Quantibody pole, ktorý využíva princíp sendvičovej ELISA vo formáte multiplexu. Podrobnosti pre odhad úrovne sú uvedené v časti Metódy.
Plazmatické hladiny cytokínov /chemokiny /rastových faktorov a potom boli korelované s klinicko-patologické rysy. 28 pacientov s rakovinou žalúdka 58 prešla potenciálne kuratívny radikálnej chirurgie (R0 resekcii) a 6 pacientov podstúpilo iba R1 resekcii. Tieto 34 patologické vzorky boli k dispozícii pre patologické korelácie (PT, PN, pStage, perinodal roztiahnutými, lymfatická embólia, cievna embólia), zatiaľ čo analýza prežitia bola vykonaná u 28 pacientov, ktorí podstúpili resekciu R0. Desať pacientov podstúpilo paliatívnej chirurgické zákroky, zatiaľ čo 13 pacientov odmietol operáciu alebo boli nevhodné na iný účel ako podporná liečba zásahu. Jeden pacient mal rakovinu nediferencovaný, ktorý bol nájdený na ďalších imunohistochemických štúdií byť primárna žalúdočné lymfóm, difúzny veľkými písmenami B buniek. Hladiny v plazme pre MMP3, kde vyššia u mužov v porovnaní so ženami (stredná hodnota 16772,1 pg /ml oproti 8512.5 pg /ml) (p = hodnota 0,011);

• Korelácia medzi HER-2 /neu (ErbB-2), hladina expresie a terapeutický účinok kombinovanej liečby Herceptinom a chemoterapeutických činidiel v nádorových bunkových línií žalúdočných
• Štúdia I. fázy neoadjuvantná chemorádiotarapia s S-1 a navyše dvojtýždňového cisplatinou u pacientov s pokročilým karcinómom žalúdka s postihnutím lymfatických uzlín: -KOGC04-