Identificação e validação de genes envolvidos na tumorigênese gástrica

Identificação e validação de genes envolvidos na tumorigênese gástrica da arte abstracta
Fundo
O câncer gástrico é um dos cancros comuns observados no sul da Índia. Infelizmente mais de 90% são avançados pelo tempo que eles relatam a um centro terciário no país. Há uma necessidade urgente para caracterizar estes cancros e tentar identificar potenciais biomarcadores e novos alvos terapêuticos.
Materiais e métodos
Nós utilizados 24 cancros gástricos, 20 tecidos gástricos, de aparência normal normais (PN) e 5 pares obtidas de pacientes com cancros não-gástrica (aparentemente normal, - AN) para o estudo de microarray seguido de validação dos genes significativos (n = 63) por quantificação relativa usando Taqman Baixa Densidade matriz PCR em Tempo real. Em seguida, usamos um array de proteínas Quantibody personalizado feito para validar a expressão de 15 proteínas nos tecidos gástricos (4 AN, 9 PN e 9 cancros gástricos). O mesmo formato de matriz foi usado para estudar os níveis plasmáticos destas proteínas em 58 pacientes com câncer gástrico e 18 de pacientes com condições gástricas normais /não malignas.
Resultados
Dezessete genes (ASPN, CCL15 /MIP-1δ , MMP3, SPON2, PRSS2, CCL3, TMEPAI /PMEPAI, SIX3, MFNG, SOSTDC1, SGNE1, SST, IGHA1, AKR1B10, FCGBP, ATP4B, NCAPH2) mostraram-se diferencialmente expressos entre os tumores e os emparelhado normal, pela primeira Tempo. EpCAM (p = 0,0001), IL8 (p = 0,0003), CCL4 /MIP-1β (p = 0,0026), CCL20 /MIP-3α (p = 0,039) e TIMP1 (p = 0,0017), os níveis de proteína do tecido foram significativamente diferentes (teste de Mann Whitney U) entre tumores versus um & PN. Além disso, os níveis plasmáticos médios de IL8, CXCL9 /MIG, CCL3 /MIP-1α, CCL20 /MIP-3α, PDGFR-B e proteínas TIMP1 foram significativamente diferentes entre o grupo não-maligna e o grupo de cancro gástrico. Os níveis pós-cirúrgicos de EpCAM, IGFBP3, IL8, CXCL10 /IP10, CXCL9 /MIG, CCL3 /MIP-1α, CCL20 /MIP-3α, SPP1 /OPN e PDGFR-B mostrou uma queda uniforme em todas as amostras estudadas.
Conclusões
Nosso estudo identificou vários genes diferencialmente expressos em cancros gástricos, alguns pela primeira vez. Alguns destes foram confirmadas ao nível da proteína, bem como. Algumas destas proteínas terá de ser avaliado mais para o seu potencial como biomarcadores de diagnóstico em cancros gástricos e alguns poderiam ser úteis como marcadores de acompanhamento em câncer gástrico.
Introdução
O câncer gástrico é um dos cancros comuns observados em Sul da Índia, nº 2 nd entre os homens e 5 th entre as mulheres na área de Chennai Metropolitan [1]. Dos pacientes que chegam à instituição de ensino superior, mais de 90% são avançados na apresentação e apenas tratamento paliativo é viável nesses pacientes [2]. Em 2005 e 2006, um total de 1239 doentes com cancro gástrico foram atendidos no Instituto, dos quais 211 pacientes tinham sido previamente tratados em outros lugares. Entre os pacientes virgens de tratamento (n = 1028), 61% foram localmente avançado e 39% estavam com metástases à distância. Tendo em vista a natureza avançada da doença e devido à baixa capacidade de desempenho, apenas 91 pacientes vieram acima para a cirurgia com a intenção de curar. Isso destaca o problema da falta de detecção precoce para o câncer gástrico na Índia.
No Japão, que tem uma alta incidência de câncer gástrico, triagem fotofluorografia é feito como um programa de rastreio para a população, resultando na detecção precoce de lesões, alguns confinado à mucosa apenas [3]. Tal procedimento é improvável que seja a solução em um país grande como a Índia. Em vista dos sintomas subtis tais como indigestão, perda de peso gradual que são geralmente ignorados, a maioria dos pacientes apresentam com doença avançada. Portanto, é essencial para desenvolver testes de triagem confiáveis ​​que podem ajudar na detecção precoce da doença. testes com base de soro para Pepsinogen e anticorpos H. pylori não ganhou aceitação generalizada e não foram consideradas para triagem de indivíduos pelo Centro Nacional do Câncer, Tóquio, Japão [3]. O teste de diagnóstico deve ser preferencialmente amostra de sangue ou urina base e precisa ser específico.
Entre os principais fatores de risco para câncer gástrico, a alimentação desempenha um papel importante. O consumo de alimentos salgados (carne e peixe) e tabaco estão associados com um risco aumentado [4-6]. gastrite atrófica crónica, metaplasia intestinal foram considerados como lesões pré-malignas da mucosa gástrica. tabagismo, H. pylori, dietas com alto teor de sal, nitritos e nitratos, e baixa ingestão de frutas e legumes são conhecidos fatores de risco para a gastrite crónica atrófica [7]. A dieta sul da Índia, tradicionalmente consiste de alto teor de frio e frito alimentos, com o óleo usado para fritar passando por vários ciclos de uso antes de ser descartado e, portanto, que contém um alto teor de substâncias cancerígenas [5, 8, 9].
Cancros gástricos são predominantemente adenocarcinomas e poderia ser de três sub-tipos - intestinais, difusa e mistos [10]. O tipo intestinal de câncer gástrico geralmente é visto na parte distal do estômago, tem fases pré-cancerosas e é composto por células cancerosas coesas formando glândula como estruturas [11]. A maioria dos tipos intestinais são bem ao diferenciadas moderadamente (OMS Classificação). O tipo difuso consiste em células cancerosas individuais que se infiltram e se espalhando muito além de suas fronteiras macroscópicos. Eles são geralmente pouco diferenciado para indiferenciado [12]. Em Chennai, tumores distais são mais comuns do que os cancros proximais. Estudos de expressão
Gene em diferentes tipos de câncer têm ajudado na identificação de genes envolvidos no processo de desenvolvimento de neoplasias [13]. estudos de microarranjos comparando as diferenças de expressão gênica entre estômago normal e câncer gástrico [14], entre tumores jovens e idosos dos pacientes com câncer gástrico [15], entre tumor primário e lesões metastáticas [16] têm sido relatados. Nosso estudo compara a expressão de genes entre os tecidos gástricos aparência normal, obtidos de pacientes com cancros não-gástrico (aparentemente normal - AN), amostras de tecido gástrico bem longe do tumor e confirmados por congelação não ter células tumorais (Emparelhado normais - PN) e cancros gástricos (tumores - T). Este é o primeiro estudo a olhar para os padrões de câncer gástrico em pacientes do sul da Índia de expressão gênica e validar alguns desses genes no nível de proteína para o seu potencial como biomarcadores para o câncer gástrico.
Materiais e métodos
Cinco amostras por (2 de pacientes com câncer de hipofaringe, 1 de carcinoma de células escamosas superior esofágico, 1 de carcinoma peri-ampulares, 1 de câncer no pâncreas) de pacientes submetidos à ressecção de estômago como parte de sua cirurgia primária foram incluídos no estudo. Além disso, 24 cancros gástricos e 20 PN foram incluídos no estudo. Todos os pacientes desde que o seu consentimento informado para o estudo, que foi aprovado pelo Comitê de Ética Institucional.
Os espécimes cirúrgicos foram imediatamente processadas e seções foram levados para a seção de congelados. As amostras de tumor com células de cancro mais do que 70%; amostras de PN e AN com nenhuma evidência de células tumorais e morfologia aparentemente normal foram incluídos no estudo.
Além disso, amostras de sangue foram coletadas de indivíduos submetidos oesophagogastroduodenoscopy (OGDscopy) para sintomas de dispepsia e para descartar qualquer patologia do trato gastrointestinal superior. Desse total, 58 foram encontrados para ser cancros gástricos, 6 foram encontrados para ter a patologia benigna no estômago (gastrite, úlcera benigna) e 12 tinham um relatório normal de OGDscopy. Em 8 pacientes com câncer gástrico submetidos a cirurgia radical, amostra de sangue pós-operatório também foram recolhidos entre o dia 7 e no dia 15, exceto dois pacientes nos quais a amostra foi coletada no momento do seu primeiro follow-up após a cirurgia (dias 55 e 64) .

extração de RNA o RNA foi extraído das amostras de tecido, utilizando o estojo de extracção de ARN RNeasy (Qiagen, GmbH, Hilden; N ° Cat: 74106) de acordo com as instruções do fabricante. A qualidade do ARN utilizado para a análise de micro-matriz foi verificada usando o Bioanalyzer e amostras com um ARN de Integridade Número (NIR) de 7 ou mais foram incluídos no estudo. O ARN foi quantificado utilizando NanoDrop ™ ND1000 (NanoDrop Technologies, EUA) espectrofotómetro.
Detecção de H. pylori
Análise para H. pylori em amostras de tecido gástrico foi realizada utilizando PCR como previamente descrito [17]. Os iniciadores de PCR desenhados para amplificar a região S2 da Vac Um gene no genoma de H. pylori foram usadas para a detecção. A reacção amplifica um fragmento amplificado de aproximadamente 194 pb de comprimento experimento Microarray
1 ug de ARN total a partir do tumor /PN /uma amostra de RNA e universal (Stratagene; N ° Cat: 740000-41). Foram reversamente transcritos utilizando matriz roteiro a 42 ° C durante 2 horas para se obter ADNc utilizando o estojo de amplificação de amino alil MessageAmp ARNA II (Ambion, Austin, TX; N ° Cat: AM1797). O cDNA foi amplificado, etiquetado, cruzados e os slides digitalizados como descrito anteriormente [18]
Todos os arquivos de dados brutos foram submetidos a GEO com um número de acesso GEO atribuído -.. GSE17154
análise de dados Microarray
A primeiro e segundo plano intensidade média para Cy3 e Cy5, foram importados para software BRB-ArrayTools [19] utilizando a função de assistente de Importação. Correcção de fundo não foi feito. normalização global foi utilizado para o centro mediano os log-ratios em cada matriz, a fim de ajustar as diferenças na intensidade de rotulagem dos corantes Cy3 e Cy5. Os dados foram analisados ​​utilizando o módulo de comparação Class [20] no software BRB-ArrayTools.
Classe Comparação em Ferramentas BRB-array
Nós identificados genes que foram diferencialmente expressos entre as 3 classes (tumor /PN /AN) usando o módulo de classe Comparison. Univariada F-teste foi utilizado e os genes foram considerados estatisticamente significativos se o seu valor p era < 0,001. Além disso, foi necessária uma diferença de duas vezes entre as diferentes classes
quantitativo em tempo real PCR
validação em tempo real da expressão do gene foi feito usando o TLDA PCR em tempo real (Applied Biosystems, Foster City, CA; Cat. No: 4.342.261). as amostras de molde de ADNc amplificado e triplicado foram analisados ​​no sistema de detecção ABI Prism 7900HT sequência (Applied Biosystems, Foster City, CA) tal como descrito anteriormente [18].
Os dados em bruto a partir do sistema de detecção de sequência de prisma 7900HT foi importado para o Microsoft Excel software para análise estatística dos dados. Entre os genes de referência endógenos incluídos na matriz (18S gene ribossomal; ACTB), ACTB foi escolhido após visualizar a distribuição global valor Ct, para normalizar os dados. Além disso, HSPE1 que tinham sido incluídos com base na expressão diferencial visto no microarray, verificou-se ter uma variação mínima e, consequentemente, foi incluído como um controle adicional endógena. Os ensaios TLDA foram executados em LabIndia Instrumentos laboratórios Pvt Ltd em Gurgaon, Nova Deli.
As amostras AN foram usados ​​como calibradores e os valores de quantificação relativa foram calculados para todos os genes e as amostras.
Gene Análise Ontologia
os genes encontrados para ser diferencialmente expressos em tumores e normais 'com base nos dados de microarranjos emparelhado foram importados para o módulo Fatigo de Babelomics [21] e analisadas para sobre-representação dos termos GO em comparação com o resto do genoma, utilizando o teste exato de Fisher para tabelas 2 × 2 contingência. O valor de p foi fixado em < 0,05.
Preparação de lisados ​​de proteína de tecido e Recolha de Plasma
lisados ​​de proteínas para análise usando matrizes de anticorpos foram preparados a partir de 60-80 mg de amostras de tecido gástrico congelados. As amostras de tecido foram moídos na presença de azoto líquido usando um pilão e almofariz. O tecido em pó foi re-suspenso em tampão de lise do tecido (Tris. HCl pH 7,5, cloreto de sódio 150 mM, 1% de desoxicolato de sódio, 1% de NP40). Antes da utilização, foi tampão de lise suplementado com mini-™ cocktail inibidor de protease completo (Roche Diagnostics GmbH, Alemanha). Os lisados ​​de proteína foram submetidos a ultra-sons utilizando células Vibra ™ (Sonics Inc., EUA) sonicador. Os lisados ​​foram clarificados por centrifugação e quantificado usando Coomassie Plus-Bradford reagente de ensaio ™ (Pierce Inc., EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. A qualidade das proteínas foi analisada por resolução de 50 pg do lisado em gel de 10% de dodecilsulfato de sódio poliacrilamida (SDS) e, subsequentemente, visualizadas por coloração com Azul de Coomassie.
O plasma foi obtido a partir de 5 ml de sangue recolhido na presença de 200 ul de 10% de ácido acético de etileno diamina tetra (EDTA). O plasma isolado a partir das amostras de sangue foi centrifugado a 3000 g e armazenado a -80 ° C em alíquotas
Anticorpo Arrays
matrizes de anticorpo personalizadas matriz Quantibody ™ (Número de catálogo: QAA-Cust). Com base num sistema de ELISA multiplex para a medição quantitativa de múltiplas proteínas adquiridos de Ray Biotech, Inc, EUA foi usada para estudar os níveis de expressão de proteínas em tecidos gástricos e amostras de plasma [22, 23]. Os seguintes genes (CXCL5 /ENA-78, CXCL8 /IL8, CXCL10 /IP10, CXCL9 /MIG, CCL3 /MIP-1α, CCL15 /MIP-1δ, EpCAM, MMP3, SPP1 /OPN, TIMP1, adipsina /CFD, CCL4 /MIP-1β, CCL20 /MIP-3α, PDGFR-B e de IGFBP-3) verificou-se ser sobreexpresso em cancros gástricos relativos ao PN e AN (com a excepção de CFD /adipsina que foi sobre-expresso em PN relativamente a cancros gástricos e AN) foram estudados para os seus níveis de proteína no tumor, PN correspondente e num tecidos. Além disso, os níveis plasmáticos destas proteínas em pacientes que haviam sido submetidos OGDscopy foram estimadas usando o mesmo formato array (58 pacientes com câncer gástrico, 6 com úlcera benigna gástrica ou duodenal ou gastrite e 12 com o relatório normal de OGDscopy). Em 8 pacientes com câncer gástrico submetidos a cirurgia radical, as amostras pré e pós-operatórias foram coletadas e analisadas.
O ensaio foi realizado como descrito por protocolo do fabricante. Resumidamente, no caso dos lisados ​​de tecido de 100 ^ g de lisado de proteína foi preparada por diluição da solução stock de lisado de tecidos utilizando tampão de amostra de diluente fornecido pelo fabricante para uma concentração final de 1 mg /ml. 100 ul de lisado diluído foi incubado na câmara de matriz durante 2 horas. No caso das amostras de plasma, o plasma foi diluído com tampão de amostra de diluente fornecido com o kit, na proporção de 1: 1. 100 ul da amostra de plasma diluído foi incubado na câmara de matriz durante 2 horas. Para cada experimento matriz, padrões fornecidos com o kit foram recentemente preparada tal como descrito pelo protocolo dos fabricantes e incluiu juntamente com uma amostra de controlo de tampão diluente (controlo negativo), que não tinha padrão ou amostras. As matrizes foram processados ​​tal como descrito por protocolo do fabricante. As lâminas foram verificados em 5 μ resolução e um PMT de 70 usando Pro digitalização matriz ™ (Perkin Elmer Inc., EUA). Nessas configurações do scanner os sinais de maior concentração norma não atingir a saturação. Os dados foram analisados ​​utilizando o Quantibody Q-Analyzer, um conjunto específico, programa baseado em Microsoft Excel, fornecido com as matrizes personalizadas. Análise
Estatística
A mediana e intervalo para os valores de plasma foram calculados usando planilha Microsoft Excel ™ software (Microsoft, Inc.,). teste de Mann Whitney U (http:... //Faculdade Vassar edu /Lowry /uTest html) foi usado para estudar o significado dos valores médios de plasma e dois testes cauda foi utilizado para a obtenção do p valor.

resultados os detalhes clínico-patológicos de todas as pacientes, cujas amostras foram utilizadas para a análise de micro-arranjo e as suas amostras de tumor, são dados no arquivo adicional 1 e 2. os dados clinico-patológico dos pacientes a partir de quais as amostras de sangue foram obtidos para a estimativa dos níveis plasmáticos de citocinas /quimiocinas /fatores de crescimento é dada no Arquivo adicional 3.
dos 24 pacientes cujas amostras de tumor foram utilizados para estudo microarray, 16 foram com idade superior a 45 anos de idade e 8 foram 45 anos ou menos; 18 eram do sexo masculino e 6 do sexo feminino; 5 eram tumores resultantes na região da cárdia, 2 de corpo e 17 de antro. Todos os vinte e quatro tumores eram adenocarcinomas com um deles sendo adenocarcinoma pouco diferenciado com áreas de recursos neuro-endócrino. Entre os adenocarcinomas, subtipo Intestinal foi o mais comum (n = 16), enquanto o subtipo difuso foi visto em 5 e misturados 2. Grau III tumores predominou (n = 20), sem tumores de grau I em nossa série. Dezessete dos 24 foram nó positivo e 4 tiveram metástases à distância na apresentação.
Com base na análise Comparação Class (valor p = 0,001 diferença e 2 vezes), tivemos 61 genes sobre-expressos em câncer, 66 em emparelhado normal e 61 com ap valor da < 1e-07 na aparentemente normal (Arquivo adicional 4). Utilizou-se Taqman A quantificação relativa de RT-PCR para a validação de alguns dos genes identificados pela análise de microarray. ACTB foi escolhido como um controlo endógeno, que foi para além dos 18S controlar presente no cartão de TLDA.
Todas as 49 amostras trabalhado no ensaio mas TLDA 2 genes, C11orf42 e IGLL1 não funcionou. HSPE que tinha sido encontrado para ter expressão diferencial nas amostras em nossa análise de microarray não mostrou qualquer variação dos níveis, no ensaio de TLDA e foi incluída como um controlo adicional endógena. A normalização foi realizada utilizando ACTB e HSPE como controlos endógenos. Dos 63 genes selecionados, excluindo os controles endógenos (ACTB e HSPE) e os dois genes que não haviam trabalhado, tivemos 59 genes para análise posterior.
Três dos genes (REG4, CLDN18, MXRA5) tinha sido incluído para validação de seu potencial como marcador de prognóstico para o fracasso. No entanto, no intervalo entre o momento em que a análise de micro-arranjo foi completada e a análise RQ-RT-PCR foi feito (aproximadamente 3 meses) foram pacientes adicionais que recaíram e, portanto, os genes não foram consideradas para análise adicional como marcadores de prognóstico. No entanto, eles foram incluídos para avaliar se eram diferencialmente expressos entre tumores e PN.
A lista de genes que foram identificados para ser diferencialmente expressos em cancros gástricos são dadas na Tabela 1 e Tabela 2. A Tabela 1 lista os genes identificados a ser expressos diferencialmente no cancro gástrico para a primeira hora e Tabela 2, lista os genes que tenham sido conhecidos por estarem associados com o cancro gástrico, e também encontrados no nosso estudo. (Arquivos Adicionais 5 e 6 fornecem informações sobre estes genes e as respectivas referências). Há quatro diferentes padrões de expressão genética - Padrão 1 - sobre-expressos em PN e em tumores; Padrão 2 - sobre-expressos em PN mas reprimidos em tumores; Padrão 3 - alteração mínima da PN, mas sobre-expressos em tumores e Padrão 4 - alteração mínima da PN, mas reprimidos em tumores (Figura 1) .table 1 Genes relatado para ser diferencialmente expressos pela primeira vez no câncer gástrico [Referências e detalhes em Arquivo adicional 4]
SNO
GENE SÍMBOLO
regulação positiva CONSTANTES DO
REFERÊNCIA
1
CCL15 /MIP5 /MIP-1D /LKN1
NSCLC
[SF5-R1] Página 2
ASPN
cancro da mama
[SF5-R2] Sims 3
MMP3
câncer colorretal
[SF5-R3] 4
SPON2
pulmão, ovário, câncer de próstata
[SF5-R4]
[SF5-R5]
[SF5-R6]
5
PRSS22
do cancro do ovário
[SF5-R7]
6
CCL3 /MIP 1A
orais SCC
[SF5-R8 ]
7
TMEPAI /PMEPAI
Neuro-endócrinos tumores
[SF5-R9]
8
SIX3
9
MFNG
reprimidos no cancro do colo do útero
[SF5-R10]
10
SGNE1 /SCG5
tumores endócrinos
11
SOSTDC1
reprimidos no cancro renal
[SF5-R11]
12
SST
reprimidos no adenocarcinoma esofágico
[SF5-R12]
13
IGHA1
14
AKR1B10
Aumento no epitélio de Barrett
[SF5-R13]
15
FCGBP
baixo regulamentada no cólon ca
[SF5-R14]
16
ATP4B
17
NCAPH2
Tabela 2 genes conhecidos por serem envolvidos em tumorigênese câncer gástrico identificados neste estudo [Referências e detalhes no arquivo adicional 5]
S nO
GENE SÍMBOLO
cima ou para baixo regulado
REFERÊNCIA
1

• Correlação entre HER-2 /neu (-2 erbB) Nível de expressão e o efeito terapêutico do tratamento com Herceptin e agentes quimioterapêuticos, em correlação lines
• Estudo de Fase I quimioradioterapia neoadjuvante com S-1 mais cisplatina quinzenal para pacientes com câncer gástrico avançado com metástases linfonodais: -KOGC04-