Identification et validation des gènes impliqués dans l'identification des tumorigenesis

gastrique et la validation des gènes impliqués dans la tumorigenèse gastrique
Résumé de l'arrière-plan
Le cancer gastrique est l'un des cancers les plus courants observés dans le sud de l'Inde. Malheureusement, plus de 90% sont avancés par le temps, ils relèvent d'un centre tertiaire dans le pays. Il y a un besoin urgent de caractériser ces cancers et essayer d'identifier des biomarqueurs potentiels et de nouvelles cibles thérapeutiques. Matériaux et méthodes
Nous avons utilisé 24 cancers gastriques, 20 tissus gastriques apparemment normaux normaux (PN) et 5 paires obtenues à partir de patients avec les cancers non-gastriques (Apparemment normale - AN) pour l'étude des microréseaux suivie de la validation des gènes importants (n = 63) par rapport à l'aide de Taqman quantification basse densité matrice PCR en temps réel. Nous avons ensuite utilisé une coutume fait Quantibody réseau de protéines pour valider l'expression de 15 protéines dans les tissus gastriques (4 AN, 9 PN et 9 cancers gastriques). Le même format de réseau a été utilisé pour étudier les concentrations plasmatiques de ces protéines chez 58 patients atteints de cancers gastriques et 18 chez des patients souffrant de maladies gastriques non malignes /normales
. Résultats
Dix-sept gènes (ASPN, CCL15 /MIP-1δ , MMP3, SPON2, PRSS2, CCL3, TMEPAI /PMEPAI, Six3, MFNG, SOSTDC1, SGNE1, SST, IGHA1, AKR1B10, FCGBP, ATP4B, NCAPH2) ont été montrés être exprimés de manière différentielle entre les tumeurs et la normale appariée, pour la première temps. EpCAM (p = 0,0001), l'IL8 (p = 0,0003), CCL4 /MIP-1β (p = 0,0026), CCL20 /MIP-3α (p = 0,039) et TIMP1 (p = 0,0017), les taux de protéine de tissu étaient significativement différentes (Mann Whitney U test) entre les tumeurs par rapport AN & PN. En outre, les taux plasmatiques médians de IL8, CXCL9 /MIG, CCL3 /MIP-1α, CCL20 /MIP-3α, protéines TIMP1 PDGFR-B et étaient significativement différentes entre le groupe non-maligne et le groupe de cancer gastrique. Les niveaux post-chirurgicales de EpCAM, IGFBP3, IL8, CXCL10 /IP10, CXCL9 /MIG, CCL3 /MIP-1α, CCL20 /MIP-3α, SPP1 /OPN et PDGFR-B ont montré une baisse uniforme dans tous les échantillons étudiés.
Conclusions
Notre étude a identifié plusieurs gènes exprimés de manière différentielle dans les cancers gastriques, certains pour la première fois. Certains d'entre eux ont été confirmés au niveau des protéines, aussi bien. Introduction Certaines de ces protéines devront être évalués plus loin pour leurs biomarqueurs diagnostiques potentiels dans les cancers gastriques et certains pourraient être utiles comme marqueurs de suivi dans le cancer gastrique. De cancer gastrique est l'un des cancers les plus courants observés dans Inde du Sud, classé 2 e chez les hommes et 5 e chez les femmes dans la région de Chennai Metropolitan [1]. Parmi les patients présentant à l'institution tertiaire, plus de 90% sont avancés à la présentation et que la gestion palliative est possible chez ces patients [2]. En 2005 et 2006, un total de 1239 patients atteints de cancer gastrique ont été observés à l'Institut, dont 211 patients avaient été préalablement traités ailleurs. Parmi les patients naïfs de traitement (n = 1028), 61% ont été localement avancé et 39% étaient avec métastases à distance. Compte tenu de la nature avancée de la maladie et en raison de l'état de mauvaise performance, seuls 91 patients sont venus pour la chirurgie avec l'intention de guérir. Cela met en évidence le problème du manque de détection précoce pour le cancer de l'estomac en Inde.
Au Japon, ce qui a une incidence élevée de cancer gastrique, le dépistage de radiophotographie est fait comme un programme de dépistage de la population, ce qui entraîne dans la détection précoce des lésions, certains confinés à la muqueuse seulement [3]. Une telle procédure est peu probable que la solution dans un grand pays comme l'Inde. Compte tenu des symptômes subtils tels que l'indigestion, perte de poids progressive qui sont généralement ignorées, la plupart des patients présentent une maladie avancée. Il est donc essentiel de développer des tests de dépistage fiables qui peuvent aider à la détection précoce de la maladie. des tests à base de sérum pour Pepsinogène et anticorps H. pylori n'a pas gagné l'acceptation généralisée et n'a pas été pris en compte pour le dépistage des individus par le Centre National du Cancer, Tokyo, Japon [3]. Le test de diagnostic doit être de préférence le sang ou d'urine fondée et doit être spécifique.
Parmi les principaux facteurs de risque de cancer de l'estomac, l'alimentation joue un rôle important. La consommation d'aliments salés (poisson et viande) et le tabac sont associés à un risque accru [4-6]. gastrite atrophique chronique et la métaplasie intestinale ont été considérées comme des modifications précancéreuses de la muqueuse gastrique. Le tabagisme, H. pylori, les régimes à haute teneur en sel, les nitrites et les nitrates, et une faible consommation de fruits et légumes sont connus des facteurs de risque pour la gastrite atrophique chronique [7]. Le régime sud de l'Inde se compose traditionnellement de contenu froid haute et profonde des aliments frits, avec l'huile utilisée pour la friture subir plusieurs cycles d'utilisation avant d'être jetés et contenant donc une teneur élevée en substances cancérogènes [5, 8, 9].
Cancers gastriques sont principalement des adénocarcinomes et pourrait être de trois sous-types - intestinal, réflex et mixtes [10]. Le type Intestinal du cancer gastrique est habituellement observée dans la partie distale de l'estomac, comporte les stades précancéreux et comprend des cellules cancéreuses cohésives formant presse-étoupe structures similaires [11]. La plupart des types intestinaux sont bien à modérément différenciés (Classification OMS). Le type Diffuse se compose de cellules cancéreuses individuelles infiltrant et la propagation bien au-delà de ses frontières macroscopiques. Ils sont généralement mal différenciés à indifférencié [12]. Dans Chennai, les tumeurs distales sont plus fréquents que les cancers proximaux. Des études d'expression génique
dans différents cancers ont aidé à identifier les gènes impliqués dans le processus de tumorigenèse [13]. Les biopuces comparant les différences d'expression génique entre estomac normal et le cancer gastrique [14], entre les tumeurs jeunes et âgés patients atteints de cancer gastrique de [15], entre la tumeur primitive et les lésions métastatiques [16] ont été rapportés. Notre étude compare l'expression génique entre les tissus gastriques apparemment normaux obtenus à partir de patients atteints de cancers non-gastriques (Apparemment normale - AN), des échantillons de tissus gastriques bien loin de la tumeur et confirmés par l'article congelé ne pas avoir des cellules tumorales (Jumelé normale - PN) et les cancers gastriques (tumeurs - T). Cette étude est la première à se pencher sur les profils d'expression génique des cancers gastriques chez les patients indiens du sud et de valider certains de ces gènes au niveau des protéines pour leur potentiel en tant que biomarqueurs pour le cancer de l'estomac. Matériaux et méthodes
Cinq échantillons AN (2 à partir de patients atteints de cancer hypopharyngée, 1 de carcinome œsophagien supérieur à cellules squameuses, 1 de péri-ampullaires carcinome, 1 du cancer du pancréas) de patients ayant subi une résection de l'estomac dans le cadre de leur chirurgie primaire ont été inclus dans l'étude. En outre, 24 cancers gastriques et 20 PN ont été inclus dans l'étude. Tous les patients ont donné leur consentement éclairé pour l'étude, qui a été approuvé par le comité d'éthique institutionnel.
Les pièces opératoires ont été immédiatement traitées et sections ont été prises pour la section gelée. Les échantillons tumoraux avec des cellules cancéreuses plus de 70%; échantillons PN et AN avec aucune preuve de cellules tumorales et de la morphologie apparemment normale ont été inclus dans l'étude.
En outre, des échantillons de sang ont été prélevés sur les individus subissant oesophagogastroduodénoscopie (OGDscopy) pour des symptômes dyspeptiques et excluent toute pathologie du tractus gastro-intestinal supérieur. Sur ce total, 58 ont été jugées les cancers gastriques, 6 ont été trouvés à avoir une pathologie bénigne dans l'estomac (gastrite, ulcère bénin) et 12 avaient un rapport OGDscopy normal. Dans 8 patients atteints de cancer gastrique qui ont subi une chirurgie radicale, échantillon de sang post-opératoire a également été recueillis entre le jour 7 et le jour 15, sauf deux patients chez qui l'échantillon a été recueilli au moment de leur premier suivi après l'intervention chirurgicale (jours 55 et 64) .
extraction de l'ARN
l'ARN a été extrait des échantillons de tissus en utilisant le kit d'extraction d'ARN RNeasy (Qiagen, Gmbh, Hilden; no de Cat: 74106) selon les instructions du fabricant. La qualité de l'ARN utilisé pour l'analyse micro-array a été vérifiée à l'aide du Bioanalyseur et des échantillons avec un numéro d'intégrité de l'ARN (RIN) de 7 ou plus ont été inclus dans l'étude. L'ARN a été quantifié en utilisant NanoDrop ™ ND1000 (NanoDrop Technologies, Etats-Unis)
spectrophotomètre. La détection de H. pylori
Analyse H pylori dans des échantillons de tissus gastriques a été effectuée par PCR comme décrit précédemment [17]. Les amorces de PCR conçues pour amplifier la région S2 de Vac Un gène dans le génome pylori H ont été utilisés pour la détection. La réaction amplifie un amplicon d'environ 194 pb de longueur de
expérience microarray
1 ug d'ARN total de la tumeur /PN /AN échantillon et de l'ARN universel (Stratagene; No de Cat: 740000-41). Ont été une transcription inverse en utilisant tableau script à 42 ° C pendant 2 heures pour obtenir l'ADNc en utilisant le kit d'amplification amino Allyl MessageAmp II ARNa (Ambion, Austin, Tx; Cat no: AM1797). L'ADNc a été amplifié, marqué, hybridée et diapositives numérisés comme décrit précédemment [18]
Tous les fichiers de données brutes ont été soumis à GEO avec un numéro GEO d'adhésion attribué -.
Analyse des données de biopuces GSE17154 The. Premier plan et arrière-plan l'intensité médiane pour Cy3 et Cy5, ont été importées dans le logiciel BRB-ArrayTools [19] en utilisant la fonction de l'assistant d'importation. La correction de fond n'a pas été fait. la normalisation mondiale a été utilisé pour le centre médian les log-rapports sur chaque tableau afin de tenir compte des différences dans les intensités d'étiquetage des colorants Cy3 et Cy5. Les données ont été analysées à l'aide du module de comparaison de classe [20] dans le logiciel BRB-ArrayTools.
Comparaison classe Outils BRB-Array
Nous avons identifié des gènes qui ont été exprimés de manière différentielle entre les 3 classes (tumeur /PN /AN) en utilisant le module de comparaison classe. Univariée F-test a été utilisé et les gènes ont été considérés comme statistiquement significatifs si leur valeur de p était < 0,001. En outre, une différence de deux fois a été nécessaire entre les différentes classes
Quantitative PCR en temps réel de la validation en temps réel de l'expression du gène a été fait en utilisant le temps réel TLDA PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA; No de Cat.: 4.342.261). échantillons de modèle Triplicate d'ADNc ont été amplifiés et analysés sur le système ABI Prism 7900HT de détection de séquence (Applied Biosystems, Foster City, CA) comme décrit précédemment [18].
Les données brutes du système de détection de séquence Prism 7900HT a été importé dans Microsoft Excel un logiciel pour l'analyse statistique des données. Parmi les gènes de référence endogènes inclus sur le tableau (18S gène ribosomique; ACTB), ACTB a été choisi après la visualisation de la distribution globale de la valeur Ct, pour normaliser les données. En outre, HSPE1 qui avait été inclus sur la base de l'expression différentielle vu sur biopuces, se révèle avoir une variation minimale et, par conséquent a été inclus comme contrôle endogène supplémentaire. Les essais de TLDA ont été réalisés à Instruments LabIndia Pvt Ltd laboratoires à Gurgaon, New Delhi.
Les échantillons AN ont été utilisés comme calibrateurs et les valeurs relatives de quantification ont été calculées pour tous les gènes et les échantillons.
Gene Ontology Analyse
les gènes trouvés être différentiellement exprimés dans les tumeurs et normales »sur la base des données de biopuces paires ont été importées dans le module Fatigo de Babelomics [21] et analysés pour la surreprésentation des termes GO en comparaison avec le reste du génome, en utilisant test exact de Fisher pour les tableaux 2 × 2 d'urgence. La valeur de p a été fixé à < 0,05.
Préparation du tissu Des lysats de protéines et de collecte des lysats protéiques de plasma pour l'analyse en utilisant des réseaux d'anticorps ont été préparés 60-80 mg d'échantillons de tissus gastriques congelés. Les échantillons de tissu sont broyés en présence d'azote liquide en utilisant un mortier et un pilon. Le tissu en poudre a été remis en suspension dans du tampon de lyse tissulaire (Tris. HCl pH 7,5, chlorure de sodium 150 mM, 1% de désoxycholate de sodium, 1% de NP40). Avant utilisation, le tampon de lyse a été complété par un mini Complete ™ cocktail inhibiteur de protease (Roche Diagnostics GmbH, Allemagne). Les lysats de protéines ont été soumises à une sonication en utilisant la cellule Vibra ™ (Sonics Inc., USA) sonicateur. Les lysats ont été clarifiés par centrifugation et quantifiés en utilisant Coomassie Plus-réactif de Bradford dosage ™ (Pierce Inc., USA) selon le protocole du fabricant. La qualité des protéines a été analysée par la résolution de 50 pg de lysat à 10% de dodécylsulfate de sodium Polyacrylamide (SDS) gel et ensuite visualisés par coloration en utilisant du bleu de Coomassie.
Le plasma a été obtenu à partir de 5 ml de sang prélevé en présence de 200 ul de 10% d'acide éthylène-diamine tétra acétique (EDTA). Le plasma isolé à partir des échantillons de sang a été centrifugé à 3000 g et stocké à -80 ° C en aliquotes sur mesure des arrays d'anticorps de l'anticorps Tableaux de array Quantibody ™ (numéro de catalogue: QAA-Cust). Basé sur un système ELISA multiplex pour la mesure quantitative de protéines multiples achetées chez Ray Biotech, Ine, États-Unis a été utilisé pour étudier les niveaux d'expression des protéines dans les tissus gastriques et des échantillons de plasma [22, 23]. Les gènes suivants (CXCL5 /ENA-78, CXCL8 /IL8, CXCL10 /IP10, CXCL9 /MIG, CCL3 /MIP-1α, CCL15 /MIP-1δ, EpCAM, MMP3, SPP1 /OPN, TIMP1, Adipsin /CFD, CCL4 /MIP-1β, CCL20 /MIP-3α, PDGFR-B et IGFBP-3) trouvé surexprimé dans les cancers gastriques par rapport à PN et AN (à l'exception des CFD /Adipsin qui a été surexprimé dans PN par rapport aux cancers gastriques et AN) ont été étudiés pour leurs niveaux de protéine dans la tumeur, PN correspondante et dans un tissus. En outre, les taux plasmatiques de ces protéines chez les patients qui avaient subi une OGDscopy ont été estimées en utilisant le même format de tableau (58 patients atteints de cancer gastrique, 6 présentant un ulcère gastrique ou duodénal bénigne ou gastrite et 12 avec le rapport OGDscopy normal). 8 patients atteints de cancer gastrique qui avaient subi une chirurgie radicale, des échantillons pré- et post-opératoires ont été recueillies et analysées.
L'essai a été effectué comme décrit par le protocole du fabricant. En bref, dans le cas des lysats de tissus 100 pg de lysat de protéine a été préparée par dilution de la solution mère de lysat tissulaire en utilisant un tampon échantillon de diluant fourni par le fabricant à une concentration finale de 1 mg /ml. 100 pi de lysat dilué ont été mises en incubation dans la chambre de matrice pendant 2 heures. Dans le cas des échantillons de plasma, le plasma a été dilué avec un tampon échantillon de diluant fourni avec le kit à un rapport de 1: 1. 100 pi de l'échantillon de plasma dilué ont été incubés dans la chambre de matrice pendant 2 heures. Pour chaque expérience de tableau, les normes fournies avec le kit ont été fraîchement préparés comme décrit par le protocole du fabricant et inclus avec une commande de tampon diluant d'échantillon (contrôle négatif), qui ne devait standard ou des échantillons. Les réseaux ont été traités comme décrit par le protocole du fabricant. Les lames ont été balayées à 5 μ résolution et un PMT de 70 en utilisant Pro Numériser Array ™ (Perkin Elmer Inc., USA). A ces paramètres du scanner les signaux de la concentration standard la plus élevée n'a pas atteint la saturation. Les données ont été analysées en utilisant le Quantibody Q-Analyzer, un tableau spécifique, programme basé sur Microsoft Excel, fourni avec les tableaux personnalisés. Analyse statistique

La médiane et la gamme des valeurs de plasma ont été calculées en utilisant la feuille de diffusion Microsoft Excel ™ logiciels (Microsoft, Inc.). test de Mann Whitney U (http:... //faculté vassar edu /lowry /Utest html) a été utilisé pour étudier l'importance des valeurs médianes du plasma et deux test bilatéral a été utilisée pour obtenir le p valeur.
Résultats
les détails clinico-pathologique de tous les patients, dont les échantillons ont été utilisés pour l'analyse des microréseaux et leurs échantillons de tumeurs, sont donnés dans le fichier additionnel 1 et 2. les détails clinico-pathologique des patients de que des échantillons de sang ont été obtenus pour l'estimation des taux plasmatiques de cytokines /chimiokines /facteurs de croissance est donnée dans le fichier complémentaire 3.
sur les 24 patients dont les échantillons tumeur ont été utilisés pour l'étude des microréseaux, 16 étaient âgés de plus de 45 ans et 8 étaient de 45 ans ou moins; 18 étaient des hommes et 6 étaient des femmes; 5 sont des tumeurs qui se posent dans la région du cardia, 2 du corps et 17 du sinus maxillaire. Toutes les vingt-quatre tumeurs étaient des adénocarcinomes avec l'un d'eux étant un adénocarcinome faiblement différencié avec des zones de fonctions neuro-endocrinien. Parmi les adénocarcinomes, le sous-type Intestinal était le plus fréquent (n = 16), tandis que le sous-type diffuse a été observée dans 5 et mélangé 2. tumeurs de grade III prédominaient (n = 20), sans tumeurs de grade I dans notre série. Dix-sept des 24 étaient noeud positif et 4 avaient des métastases à distance lors de la présentation.
Basé sur l'analyse Comparaison classe (valeur p = 0,001 et 2 fois la différence), nous avons eu 61 gènes surexprimés dans le cancer, 66 dans des conditions normales appariés et 61 avec ap valeur de < 1e-07 en apparence normale (fichier complémentaire 4). Nous avons utilisé une quantification relative Taqman RT-PCR pour la validation de certains des gènes identifiés par l'analyse de puces à ADN. ACTB a été choisi comme témoin endogène, qui était en plus des 18S contrôlent présent dans la carte TLDA.
Tous les échantillons 49 ont travaillé dans le dosage TLDA mais 2 gènes, C11orf42 et IGLL1 avaient pas travaillé. HSPE qui avait été constaté que l'expression différentielle dans les échantillons dans notre analyse des microréseaux n'a montré aucune variation dans les niveaux, dans le dosage TLDA et a été inclus comme un contrôle endogène supplémentaire. La normalisation a été effectuée en utilisant ACTB et HSPE comme témoins endogènes. Sur les 63 gènes sélectionnés, à l'exclusion des contrôles endogènes (de ACTB et HSPE) et les deux gènes qui n'a pas travaillé, nous avons eu 59 gènes pour une analyse ultérieure.
Trois des gènes (REG4, CLDN18, MXRA5) avait été inclus pour validation de leur potentiel en tant que marqueur pronostique pour l'échec. Toutefois, dans l'intervalle entre le moment où l'analyse des microréseaux a été achevée et l'analyse RQ-RT-PCR a été fait (environ 3 mois), il y avait d'autres patients qui ont rechuté et donc les gènes ne sont pas pris en compte pour une analyse plus approfondie en tant que marqueurs pronostiques. Cependant, ils ont été inclus pour déterminer si elles ont été exprimés de manière différentielle entre les PN et les tumeurs.
La liste des gènes qui ont été identifiés pour être exprimé de manière différentielle dans les cancers gastriques sont donnés dans le tableau 1 et le tableau 2. Le tableau 1 énumère les gènes identifiés à être exprimé de manière différentielle dans le cancer gastrique pour la première fois et le tableau 2, énumère les gènes qui ont été connus pour être associés avec le cancer gastrique, et a trouvé aussi dans notre étude. (Fichiers supplémentaires 5 et 6 fournissent des informations sur ces gènes et les références correspondantes). Il existe quatre modèles différents de l'expression des gènes - Motif 1 - surexprimé dans PN et Tumeurs; Motif 2 - surexprimé dans PN mais régulée à la baisse dans les tumeurs; Motif 3 - changement minimal PN mais surexprimé dans Tumeurs et Motif 4 - changement minimal PN mais en Tumeurs régulée à la baisse (figure 1) .Table 1 gènes signalés à être exprimé de manière différentielle pour la première fois dans le cancer gastrique [Références et détails dans le fichier complémentaire 4]
SNO
GENE SYMBOLE
upregulation SIGNALE DANS
REFERENCE
1
CCL15 /MIP5 /MIP-1d /LKN1
NSCLC
[SF5-R1] 2
ASPN
cancer du sein
[SF5-R2]
3
cancer colorectal de MMP3
[SF5-R3] 4
SPON2
poumon, de l'ovaire, les cancers de la prostate
[SF5-R4]
[SF5-R5]
[SF5-R6]
5
PRSS22
cancer ovarien
[SF5-R7]
6
CCL3 /orale SCC
[SF5-R8
MIP 1A ]
7
TMEPAI /PMEPAI
Neuro-endocrinien [SF5-R9 de tumeurs] 8
SIX3
9
MFNG
downregulated dans le cancer du col utérin
[SF5-R10]
10
tumeurs endocrines
SGNE1 /SCG5
11
SOSTDC1
downregulated en cancer rénal
[SF5-R11]
12
SST
downregulated dans adénocarcinome oesophagien
[SF5-R12]
13
IGHA1
14
AKR1B10
accrue dans l'épithélium de Barrett
[SF5-R13]
15
FCGBP
bas réglementé dans le côlon ca
[SF5-R14]
16
17
NCAPH2
Tableau 2 gènes
ATP4B connus pour être impliqués dans tumorigenèse du cancer gastrique identifié dans cette étude [Références et détails dans le fichier complémentaire 5]
S NO
GENE le SYMBOLE
le MONTÉE OU DESCENTE rÉGLEMENTÉ
REFERENCE
1
CTSB
Up réglementés en particulier dans cardia tumours
[SF6-R1]
2
SPARC/Osteonectin
Up-regulated
[SF6-R2]
3
COL1A1
Up-regulated
[SF5-R3]
4
COL1A2
Up-regulated
[SF5-R3]
5
COL4A1/Arresten
Up-regulated
[SF5-R4]
6
CXCL1/GRO1/MGSA
Up-regulated
[SF5-R5]
7
SPP1/osteopontin
Up-regulated
[SF5-R6]
8
CXCL9/MIG
Up-regulated
[SF5-R7]
9
IL8/CXCL8
Up-regulated
[SF5-R8]
10
TIMP1
Up-regulated
[SF5-R9]
11
LUM/SLRR2D/LDC
Up-regulated
[SF5-R10]
12
CXCL5/ENA78
Up-regulated
[SF5-R11]
13
CXCL10/INP10/IP10
Up-regulated
[SF5-R4]
14
CEACAM6
Up-regulated
[SF5-R12]
15
REGIV
Up-regulated
[SF5-R13]
16
S100A10/ANX2L/CAL1L
Up-regulated
[SF5-R14]
17
SERPINH1/HSP47/CBP1
Up-regulated
[SF5-R15]
18
CDH3
Up-regulated
[SF5-R16
19
TACSTD1/EPCAM/CD326
Up-regulated
[SF5-R17]
20
IFITM1/LEU13
Up-regulated
[SF5-R18]
21
CTHRC1
Up-regulated
[SF5-R19]
22
SULF1
Up-regulated
[SF5-R20]
23
RNASE1
Down-regulated
[SF5-R21]
24
PGC
Down-regulated
[SF5-R22]
25
PGA5
Down-regulated
[SF5-R22]
26
GIF
Down-regulated
[SF5-R23]
27
LTF
Down-regulated
[SF5-R24]
28
TFF1
Down-regulated
[SF5-R25]
29
CLDN18
Down-regulated
[SF5-R26]
30
CFD/Adipsin
Secreted par les cellules gastriques ca lines
[SF5-R27]
31
GHRL/Obestatin
Down-regulated
[SF5-R28]
32
LIPF
Down-regulated
[SF5-R29]
33
ANXA10
Down-regulated
[SF5-R30]
Figure 1 valeurs de QR de normals appariés (PN) (n = 20) et tumoraux (n = 24), en utilisant apparemment normal (AN) (n = 5) comme calibrateur. Le facteur de variation est par rapport aux apparemment normales.
Nous avons ensuite confirmer l'expression de protéines pour certains des gènes dans l'AN (n = 4), PN (n = 9) et les tumeurs (n = 9). Nous avons utilisé le tableau Quantibody, qui est basé sur le principe du dosage ELISA en sandwich pour déterminer les taux de 15 cytokines, chimiokines et facteurs de croissance [22, 23] protéines. Les valeurs médianes et la gamme des niveaux sont donnés dans le tableau 3. CFD /Adipsin niveaux médians ont été trouvés à être plus faible dans les tumeurs par rapport aux niveaux de PN et AN (p = 0,0324), tandis que CXCL5 /ENA78, CCL20 /MIP 3α, IGFBP3, SPP1 /OPN et TIMP1 ont été augmentés en PN et des tumeurs par rapport à un, avec des niveaux plus élevés observés dans les tumeurs. En revanche, EpCAM, IL8, CXCL10 /IP10, CCL3 /MIP-1α, CCL4 /MIP-1β, CCL15 /MIP-1δ, PDGFR-B ont été principalement élevé dans les tumeurs par rapport à AN et PN. EpCAM (p = 0,0001), l'IL8 (p = 0,0003), MIP-1β (p = 0,0026), MIP-3α (p = 0,039) et TIMP1 (p = 0,0017) étaient significativement différentes (Mann-Whitney U test) entre les tumeurs par rapport AN & PN. En outre, EpCAM (p = 0,0004), IL8 (p = 0,0015) et MIP-1β (p = 0,0061) ont été significativement plus élevée dans les tumeurs par rapport à leurs PN.Table 3 valeurs médianes correspondantes pour les cytokines et les chimiokines dans un, lysats pn et tumoraux

AN
AN
PN

PN
TUMEUR
TUMEUR

médian en pg /ml
Range en pg /ml
médian en pg /ml
Range en pg /ml
médian en pg /ml
Range en pg /ml
CFD /Adipsin
27.295,0 22.097,9 à 31.759,9

27.162,9
19.515,1 à 38.224,3 13.021,0
*
9441,5 à 36.873,1
CXCL5 /ENA-78
283,8
39,3 à 4206,1 2922,7

84,9 à 31.628,7
3978,0
723,9 à 40669,6
EpCAM
1466,0
905,7 à 2266,6 2243,5

915 à 8885,8
18.717,6 *** /## #
8966,1-34529
IGFBP-3
3149,8
124,0 à 17.530,2 12.286,0

134,6 à 34.036,3 17.662,7

196,9 à 55671,5
IL-8 /CXCL8
22,1
0 à 62,3
53,1
27,4 à 190,6
1240,4 *** /###
93,1 à 3660,7
CXCL10 /IP-10
20,4
1,4 à 146,1
147,0
0,8 à 3940,9
384,4
0,7 à 1643,1
CXCL9 /MIG
369,5
0 à 8569,7
4336,1 1077,2
- 19396,6
7540,3
727,7 à 73975,9
CCL3 /MIP-1α
0.0
0 à 187,4
203,6
0 à 1177,2
359,0
0 à 3231,5
CCL4 /MIP-1β
49,5
0 à 261,8
94,3
0 à 335,8
578,6 ** /#
28,7 à 1185,2
CCL15 /MIP-1δ
86,0
54 à 157,3
169,3
51,7 à 748,9
374,3
63,4 à 2825,4
CCL20 /MIP-3α
859,3
76,1 à 1784,8
3049,6
893 à 16.262,9
4773,4 *
1014,4 à 13280,7
MMP-3
269,0
0 à 648,6
143,9
0 à 353,1
0.0
0 à 2908,2
SPP1 /OPN
447,0
9,1 à 896,3
2054,0
193,6 à 3183,7 1407,1

12,6 à 5819,2
PDGF RB
222,3
174,3 à 521,4
295,3
184,9 à 1079,3
578,6
123,7 à 1516,8
TIMP-1
9676,2
4373,3-17133,2
27.022,2 17.028,3
- 194.387,8 139.365,6
**
48.146,4 à 367.203,2
AN - Apparemment normale; PN - Jumelé
valeur p normale significative pour AN + PN par rapport Tumour -
* - < 0,05; ** - ≪ 0,005; *** - ≪ 0,0005 par Mann Whitney U test de
valeur p significative pour PN par rapport Tumour -
# - < 0,01; ## - ≪ 0,005; ### - ≪ 0,0005 par le test U de Mann Whitney
Les taux plasmatiques de cytokines /chimiokines /facteurs 15 de croissance ont été estimées en utilisant le tableau Quantibody. Les 18 cas non malignes (12 avec aucune anomalie détectée par OGDscopy et 6 avec une pathologie bénigne dans l'estomac) ont été cotisés et les valeurs médianes ont été comparés entre les tumeurs et le groupe non malignes. test de Mann Whitney U a été réalisée pour évaluer la signification statistique (deux test bilatéral). IL8, CXCL9 /MIG, CCL3 /MIP-1α, CCL20 /MIP-3a, PDGFR-B et TIMP1 taux plasmatiques étaient significativement différentes entre le groupe non-maligne et le groupe de cancer gastrique (tableau 4). SPP1 niveau /OPN étaient également plus élevés chez les patients atteints de cancer gastrique par rapport au groupe non-maligne, mais était à la limite significative (p = 0,05). Les niveaux post-chirurgicales de EpCAM, IGFBP3, IL8, CXCL10 /IP10, CXCL9 /MIG, CCL3 /MIP-1α, CCL20 /MIP-3α, SPP1 /OPN et PDGFR-B ont montré une baisse uniforme dans tous les 8 échantillons étudiés. En revanche TIMP1, les niveaux CCL15 /MIP-1δ et CFD /Adipsin en fait augmenté dans la période post-opératoire dans la plupart des échantillons (figure 2) .Table 4 valeurs médianes pour les cytokines et les chimiokines dans le plasma de patients non malignes par rapport à plasma à partir de les patients atteints de carcinomes gastriques

MEDIAN pour non malignes (n = 18) (en pg /ml)
RANGE (en pg /ml)
MEDIAN pour les tumeurs (n = 58) (en pg /ml)
RANGE (en pg /ml)
CFD /Adipsin
71.520,0
58000,8 à 77527,9
69.236,4
27.926,9-95.255,7
CXCL5 /ENA-78
1100,6
0 à 7203,2 1702,8

0 à 11588,5
EpCAM
1789,8
0 à 13627,3
3527,1
0 à 35009,2
IGFBP-3
119.467,1
20.164,6-174498
110.395,1
0 à 979.359,6
IL-8 /CXCL8
22,5
0 à 69,9
48,9 *
0 à 396,3
CXCL10 /IP-10
670,2
0 à 3328,9
931.1
0 à 5158,9
CXCL9 /MIG
6069,2
0 à 18739,7
7561,8 *
505-6 - 86999
CCL3 /MIP-1α
1464,8
0 - 10602,2
2335,1 *
0-32199
CCL4 /MIP-1β
43,0
0 à 440,1
127,9
0 à 2138,5
CCL15 /MIP-1δ
6628,8
1237,8-13.178,1
5577,9
696,3 à 11054,4
CCL20 /MIP-3α
139,9
0 à 1994,1
654,6 #
0 à 12013,1
MMP-3
10.966,2
3891,2 à 38928,9
13.680,1
1.358,7-80.588,8
SPP1 /OPN
4621,5
0 à 20518,1
8680,5
0 à 110.373,2
PDGF RB
1391,5
0 à 5461,8 2300,5
*
0 à 34754,4
TIMP-1
31.048,9
15.603,8-220.729,6
98.054,6 #
6252,5 - 463941
# - valeur de p < 0,01; * - Valeur de p < 0,05 par la figure de test de Mann Whitney U 2 Pre (1) et post-opératoire (2) les taux plasmatiques de cytokines /chimiokines /facteurs de croissance dans les cancers gastriques (n = 8). Les concentrations plasmatiques ont été mesurées en utilisant le tableau Quantibody, qui utilise le principe de l'ELISA de type sandwich dans un format multiplex. Les détails de l'estimation des niveaux sont fournis dans la section Méthodes.
Les concentrations plasmatiques de cytokines /chimiokines /facteurs de croissance ont ensuite été corrélées avec les caractéristiques clinico-pathologiques. 28 des 58 patients atteints de cancer gastrique ont subi une chirurgie radicale (résection R0) potentiellement curative et 6 patients ont subi une résection R1 seulement. Ces 34 spécimens pathologiques étaient disponibles pour corrélations anatomopathologiques (pT, pN, pStage, diffusion périnodale, embolies lymphatique, embolies vasculaires), tandis que l'analyse de survie a été réalisée sur 28 patients qui avaient subi une résection R0. Dix patients ont subi des interventions chirurgicales palliatifs alors que 13 patients ont diminué la chirurgie ou étaient impropres à toute intervention autre que des soins de soutien. Un patient a eu un cancer indifférencié, qui sur des études immunohistochimiques supplémentaires a été trouvé pour être un lymphome gastrique primaire, diffus à grandes cellules de type B. Les concentrations plasmatiques de MMP3 où élevés chez les hommes que chez les femmes (valeur médiane 16.772,1 pg /ml contre 8512,5 pg /ml) (valeur p = 0,011); de l'Inde.

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