Identificatie en validatie van genen die betrokken zijn in de maag tumorigenesis

identificatie en validatie van genen die betrokken zijn bij het ontstaan ​​van tumoren maag
Abstracte achtergrond
Maagkanker is een van de voorkomende vormen van kanker te zien in het zuiden van India. Helaas is meer dan 90% worden voorgeschoten door de tijd dat ze rapporteren aan een tertiair centrum in het land. Er is een dringende noodzaak om deze vormen van kanker te karakteriseren en proberen om potentiële biomerkers en nieuwe therapeutische targets te identificeren.
Materialen en werkwijzen
We gebruikten 24 maagkanker, 20 Gekoppelde normaal (PN) en 5 ogenschijnlijk normale maag weefsel van patiënten met niet-maagkanker (blijkbaar normaal - AN) voor de microarray onderzoek gevolgd door validatie van de belangrijke genen (n = 63) door relatieve kwantificatie met behulp van Taqman Low Density Array Real Time PCR. Vervolgens gebruikten een maat Quantibody eiwitarray de expressie van 15 eiwitten in gastrische weefsels (AN 4, 9 en 9 PN maagkanker) valideren. Dezelfde array formaat werd gebruikt om de plasmaniveaus van deze eiwitten bij 58 patiënten met maagkanker en 18 van patiënten met een normale /goedaardige maagaandoeningen bestuderen.
Resultaten
Zeventien genen (ASPN, CCL15 /MIP-1δ , MMP3, SPON2, PRSS2, CCL3, TMEPAI /PMEPAI, SIX3, MFNG, SOSTDC1, SGNE1, SST, IGHA1, AKR1B10, FCGBP, ATP4B, NCAPH2) bleken verschillend tot expressie tussen de tumoren en de gepaarde normale, voor het eerst tijd. EpCAM (p = 0,0001), IL8 (p = 0,0003), CCl4 /MIP-1β (p = 0,0026), CCL20 /MIP-3α (p = 0,039) en TIMP1 (p = 0,0017) weefsel proteïne niveaus waren significant verschillend (Mann Whitney U test) tussen tumoren versus AN & PN. Bovendien mediane plasmaspiegels van IL8, CXCL9 /MIG, CCL3 /MIP-1α, CCL20 /MIP-3α, PDGFR-B TIMP1 eiwitten waren significant verschillend tussen de niet-kwaadaardige groep en de groep maagkanker. De post-operatieve niveaus van EpCAM, IGFBP3, IL8, CXCL10 /IP10, CXCL9 /MIG, CCL3 /MIP-1α, CCL20 /MIP-3α, SPP1 /OPN en PDGFR-B toonde een uniforme daling van alle monsters onderzocht.
Conclusies
Ons onderzoek heeft meerdere genen differentieel tot expressie in maagkanker, wat voor het eerst geïdentificeerd. Sommige van deze zijn bevestigd op eiwitniveau, ook. Sommige van deze eiwitten moet verder worden geëvalueerd op hun potentieel als diagnostische biomarkers in maagkanker en sommige kunnen nuttig zijn als follow-up markers in maagkanker is.
Inleiding
Maagkanker is een conventionele kanker gezien in Zuid-India, op volgorde 2 nd onder mannen en 5 e onder vrouwen in het gebied Chennai Metropolitan [1]. Van de patiënten die de tertiaire instelling, zijn meer dan 90% moeilijk bij presentatie en slechts palliatieve beheer mogelijk bij deze patiënten [2]. In 2005 en 2006 werden in totaal 1239 patiënten met maagkanker werden gezien bij het Instituut, waarvan 211 patiënten waren eerder elders behandeld. Onder de niet eerder behandelde patiënten (n = 1028), werden 61% lokaal gevorderde en 39% waren met verre metastase. Gezien het geavanceerde karakter van de ziekte en vanwege de slechte performance status slechts 91 patiënten kwam voor chirurgie met de bedoeling om te genezen. Hieruit blijkt het probleem van gebrek aan vroege opsporing voor maagkanker in India.
In Japan, waar een hoge incidentie van maagkanker heeft, wordt photofluorography screening uitgevoerd als een screening voor de bevolking, waardoor vroegtijdige detectie van laesies, aantal beperkt tot mucosa [3]. Een dergelijke procedure is het onwaarschijnlijk dat de oplossing in een groot land zoals India. Gezien de subtiele symptomen zoals indigestie, geleidelijk gewichtsverlies die meestal genegeerd, de meeste patiënten aanwezig met gevorderde ziekte. Het is daarom essentieel om betrouwbare tests die kunnen helpen bij de vroege detectie van de ziekte te ontwikkelen. Serum gebaseerde tests voor Pepsinogen en H. pylori-antilichamen hebben geen wijdverspreide acceptatie en geen rekening is gehouden voor het screenen van individuen door het National Cancer Center, Tokyo, Japan [3]. De diagnostische test moet bij voorkeur bloed- of urinemonster gebaseerd en moet specifiek zijn.
Onder de belangrijkste risicofactoren voor maagkanker, voeding speelt een belangrijke rol. Consumptie van gezouten voedsel (vis en vlees) en tabak zijn geassocieerd met een verhoogd risico [4-6]. Chronische atrofische gastritis en intestinale metaplasie werden beschouwd als premaligne veranderingen in het maagslijmvlies. Het roken van tabak, H. pylori, diëten met een hoog gehalte aan zout, nitrieten en nitraten, en de lage inname van groenten en fruit zijn bekende risicofactoren voor chronische atrofische gastritis [7]. De Zuid-Indiase dieet bestaat traditioneel uit een hoge kille inhoud en gefrituurd voedsel, met de olie wordt gebruikt voor het bakken van het ondergaan van een aantal cycli van het gebruik alvorens te worden opgeruimd en dus met een hoog gehalte aan kankerverwekkende stoffen [5, 8, 9].
Maagkanker overwegend adenocarcinomen en drie subtypes kunnen zijn - Intestinale, diffuus en gemengd [10]. Het intestinale type maagkanker wordt meestal gezien in het distale deel van de maag, heeft precancerous stadia en bestaat uit samenhangende kankercellen vormen klier structuren [11]. Het grootste deel van de intestinale types zijn goed tot matig gedifferentieerd (WHO Classification). De Diffuse type bestaat uit individuele kankercellen infiltreren en het verspreiden van ver buiten de macroscopische grenzen. Ze zijn meestal slecht gedifferentieerd om ongedifferentieerde [12]. In Chennai, distale tumoren komen vaker voor dan proximale kankers.
Genexpressie studies in verschillende vormen van kanker hebben bij de identificatie van genen die betrokken zijn bij het proces van het ontstaan ​​van tumoren [13] geholpen. Microarraystudies vergelijking van de genexpressie verschillen tussen normale maag en maagkanker [14], tussen jongere en oudere maagkanker patiënten tumoren [15], tussen de primaire tumor en metastasen [16] zijn gerapporteerd. Onze studie vergelijkt de genexpressie tussen normaal ontwikkelde gastrische weefsels verkregen van patiënten met niet-maagkanker (blijkbaar normaal - AN), maag weefselmonsters uit de buurt van de tumor en bevestigd vriescoupeonderzoek tumorcellen te hebben (Gepaarde normaal - PN) en de maag kankers (Tumoren - T). Dit is de eerste studie te onderzoeken of het gen expressiepatronen van maagkanker in south Indian patiënten en valideren sommige genen op eiwitniveau voor hun potentieel als biomarkers voor maagkanker.
Materialen en werkwijzen
Vijf monsters AN (2 van patiënten met een hypofarynxcarcinoom, 1 van de bovenste slokdarm plaveiselcelcarcinoom, 1 van peri-ampullaire carcinoom, 1 van pancreaskanker) van patiënten die maag resectie ondergingen als onderdeel van hun primaire chirurgie werden opgenomen in de studie. Bovendien, 24 en 20 maagkanker PN werden opgenomen in de studie. Alle patiënten op voorwaarde dat hun geïnformeerde toestemming voor de studie, die door de Institutional Ethische commissie werd goedgekeurd. Ondernemingen De operatieve monsters werden direct verwerkt en secties werden genomen voor bevroren sectie. Tumormonsters met meer dan 70% kankercellen; PN en AN monsters met geen bewijs van tumorcellen en ogenschijnlijk normale morfologie werden in de studie opgenomen.
Daarnaast werden bloedmonsters verzameld van individuen ondergaan oesophagogastroduodenoscopy (OGDscopy) voor dyspeptische klachten en om elke bovenste maagdarmkanaal pathologie. Hiervan bleken 58 gastrische kankers, 6 bleken goedaardige pathologie in de maag (gastritis, benigne ulcus) en 12 slechts over een normale rapport OGDscopy. In 8 maagkanker patiënten die een ingrijpende operatie ondergaan, werd postoperatieve bloedmonster ook verzameld tussen dag 7 en dag 15, behalve twee patiënten bij wie het monster werd verzameld op het moment van hun eerste follow-up na de operatie (dagen 55 en 64) .
RNA-extractie
RNA werd geëxtraheerd uit de weefselmonsters met behulp van de RNeasy RNA extractie kit (Qiagen Gmbh, Hilden, Kat nr: 74106) volgens de instructies van de fabrikant. De kwaliteit van het RNA voor micro-array analyse werd gebruik gemaakt van de Bioanalyzer en monsters met een RNA integriteit Number (RIN) van 7 of meer werden opgenomen in de studie. RNA werd gekwantificeerd met behulp NanoDrop ™ ND1000 (NanoDrop Technologies, USA) spectrofotometer.
Detectie van H pylori
Analyse voor H. pylori in de maag weefselmonsters werd uitgevoerd onder toepassing van PCR zoals eerder beschreven [17]. PCR-primers ontworpen om S2 regio amplificeren van Vac A-gen in het genoom H pylori werden gebruikt voor detectie. De reactie versterkt een amplicon van ongeveer 194 bp lengte
microarray experiment
1 ug totaal RNA van de tumor /PN /AN monster en universele RNA (Stratagene, Cat nr: 740000-41). Werden reverse getranscribeerd met behulp van Array (;: AM1797 geen Cat Ambion, Austin, TX) manuscript bij 42 ° C gedurende 2 uur om cDNA te verkrijgen met de amino allyl MessageAmp II aRNA amplificatie kit. Het cDNA werd versterkt, geëtiketteerd, gehybridiseerd en dia's gescand zoals eerder beschreven [18]
Al de ruwe data bestanden zijn ingediend bij GEO met een toegewezen GEO toetreding nummer -.. GSE17154
microarray data-analyse
voorgrond en achtergrond Median intensiteit Cy3 en Cy5, werden geïmporteerd in BRB-ArrayTools software [19] met de wizard Import functie. Achtergrond correctie was niet gedaan. Global normalisatie werd gebruikt om mediaan het centrum van de log-ratio's op elke array om te corrigeren voor verschillen in labeling intensiteiten van de Cy3 en Cy5 kleurstoffen. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van de Class vergelijking module [20] in de BRB-ArrayTools software.
Class Vergelijking in BRB-Array Gereedschap
We geïdentificeerde genen die differentieel tot expressie werden gebracht onder de 3 klassen (tumor /PN /AN) Vergelijking met de klasse module. Univariate F-test werd gebruikt en de genen werden als statistisch significant beschouwd indien de p-waarde was < 0.001. Daarnaast werd een tweevoudig verschil vereist tussen de verschillende klassen
Kwantitatieve real time PCR
Real time validatie van de genexpressie werd gedaan met behulp van TLDA real time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA; Cat nr.: 4.342.261). Drievoud cDNA matrijs monsters werden geamplificeerd en geanalyseerd op de ABI Prism 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA) zoals eerder beschreven [18]. Ondernemingen De ruwe data van de Prism 7900HT sequentie detectiesysteem werd ingevoerd in Microsoft Excel software voor statistische analyse van de gegevens. Onder de endogene referentie opgenomen genen op de array (18S ribosomale gen, ACTB), werd gekozen na ACTB visualiseren die mondiale waardeverdeling, voor het normaliseren van de gegevens. Bovendien HSPE1 dat was genomen vanwege het differentiële expressie gezien op Microarray, bleek weinig variatie hebben en daarom werd opgenomen als extra endogene controle. De TLDA testen werden uitgevoerd bij LabIndia Instruments Pvt Ltd laboratoria in Gurgaon, New Delhi. Ondernemingen De AN monsters werden gebruikt als kalibratoren en de relatieve kwantificering waarden werden berekend voor alle genen en de monsters.
Gene Ontology analyse
de genen gevonden die verschillend tot expressie in tumoren en gepaarde normals 'gebaseerd op de microarray gegevens werden vergeleken in de Fatigo module Babelomics [21] ingevoerd en geanalyseerd oververtegenwoordiging van de GO termen om de rest van het genoom, gebruikt Fisher's exact test voor 2 × 2 kruistabellen. De p-waarde is vastgesteld op < 0.05.
Voorbereiding van de Tissue eiwit lysaten en verzamelen van Plasma
Eiwit lysaten voor analyse met behulp van antilichaam-arrays werden bereid 60-80 mg van bevroren maag weefselmonsters. De weefselmonsters werden gemalen in aanwezigheid van vloeibare stikstof via mortier en stamper. De poedervormige weefsel werd geresuspendeerd in weefsel lysis buffer (Tris. HCL pH 7,5, 150 mM natriumchloride, 1% natrium deoxycholaat, 1% NP40). Voor gebruik werd lysis buffer aangevuld met complete mini ™ proteaseremmer cocktail (Roche Diagnostics GMBH, Duitsland). Het eiwit lysaten werden onderworpen aan sonicatie behulp Vibra cell ™ (Sonics Inc., USA) sonicator. De lysaten werden geklaard door centrifugatie en gekwantificeerd onder gebruikmaking van Coomassie Plus-Bradford assay ™ reagens (Pierce Inc., USA) volgens het protocol van de fabrikant. De kwaliteit van de eiwitten werd geanalyseerd door het oplossen van 50 ug van het lysaat aan 10% natriumdodecylsulfaat polyacrylamide (SDS) gel en vervolgens door kleuring met behulp van Coomassie Blue.
Plasma werd verkregen uit 5 ml bloed verzameld in de aanwezigheid van 200 pl 10% ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA). Het plasma geïsoleerd uit de bloedmonsters werd gecentrifugeerd bij 3000 g en bewaard bij -80 ° C in porties
antilichaam arrays
Custom antilichaam arrays Quantibody ™ array (Catalogusnummer: QAA-CUST). Op basis van een multiplex ELISA systeem voor kwantitatieve meting van meerdere eiwitten verkregen van Ray Biotech, Inc., USA werd gebruikt voor eiwitexpressie niveaus in gastrische weefsels en plasmamonsters [22, 23] te bestuderen. De volgende genen (CXCL5 /ENA-78, CXCL8 /IL8, CXCL10 /IP10, CXCL9 /MIG, CCL3 /MIP-1α, CCL15 /MIP-1δ, EpCAM, MMP3, SPP1 /OPN, TIMP1, Adipsin /CFD, CCl4 /MIP-1β, CCL20 /MIP-3α, PDGFR-B en IGFBP-3) gevonden dat overexpressie in maagkanker opzichte van PN en AN (behalve CFD /Adipsin die is overexpressie in PN opzichte van maagkanker en AN) werden onderzocht op hun eiwitniveaus in tumorcellen, overeenkomstige PN en AN weefsels. Daarnaast werden plasmaspiegels van deze eiwitten bij patiënten die OGDscopy ondergingen geschat met dezelfde array format (58 maagkankerpatiënten, 6 met benigne maag- of duodenale zweer of gastritis en 12 normale verslag OGDscopy). In 8 maagkanker patiënten die radicale chirurgie, pre- en postoperatieve werden verzameld en geanalyseerd had ondergaan. Ondernemingen De assay werd uitgevoerd zoals beschreven door protocol van de fabrikant. Kort samengevat, in het geval van het weefsel lysaten 100 ug van het eiwit lysaat werd bereid door het weefsel lysaat voorraadoplossing middels monster verdunningsbuffer van de fabrikant tot een eindconcentratie van 1 mg /ml. 100 gl van de verdunde lysaat werd geïncubeerd in de array kamer gedurende 2 uur. Bij de plasmamonsters, werd het plasma verdund met de kit in een verhouding van 1 verstrekte monster verdunningsbuffer: 1. 100 pi van het verdunde plasma monster werd geïncubeerd in de array kamer gedurende 2 uur. Voor elke serie experiment werden normen samen met de kit vers bereid zoals beschreven door de fabrikant protocol en opgenomen, samen met een monster verdunningsmiddel buffercontrole (negatieve controle) die niet hadden standaard of monsters. De arrays werden verwerkt zoals beschreven protocol van de fabrikant. De objectglaasjes werden gescand met 5 μ resolutie en een PMT van 70 middels Pro Array Scan ™ (Perkin Elmer Inc., USA). Bij deze scannerinstellingen de signalen van de hoogste standaard concentratie geen verzadiging bereikt. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van de Quantibody Q-Analyzer, een reeks specifieke, Microsoft Excel-based programma, met de aangepaste arrays geleverd.
Statistische analyse
De mediane en bereik voor de plasma waarden werden berekend met behulp van Microsoft Excel ™ spread sheet software (Microsoft, Inc.,). Mann Whitney U test (http:... //Faculteit vassar edu /Lowry /Utest html) werd gebruikt om de betekenis van de mediane waarden van de plasma en tweezijdige toets studie werd gebruikt voor het verkrijgen van p waarde.
Resultaten
de klinische en pathologische data van alle patiënten, waarvan monsters werden gebruikt voor microarray-analyse en de tumormonsters, worden gegeven in aanvullende File 1 en 2. de klinische en pathologische gegevens van de patiënten uit wie bloedmonsters werden verkregen voor de schatting van de plasma niveaus van cytokines /chemokines /groeifactoren wordt gegeven in Extra File 3.
van de 24 patiënten bij wie de tumor monsters werden gebruikt voor microarray studie, 16 werden die ouder zijn dan 45 jaar en 8 waren 45 jaar of minder; 18 waren mannen en 6 vrouwen waren; 5 waren tumoren ontstaan ​​regio cardia, 2 van lichaam 17 van antrum. Alle vierentwintig tumoren waren adenocarcinomen met een van hen is slecht gedifferentieerd adenocarcinoom met gebieden van neuro-endocriene functies. Onder de adenocarcinomen, intestinale subtype was de meest voorkomende (n = 16), terwijl diffuse subtype werd waargenomen bij 5 en vermengd 2. Graad III tumoren overheerst (n = 20), zonder Grade I tumoren in onze reeks. Zeventien van de 24 waren knooppunt positieve en 4 hadden metastasen bij presentatie.
Op basis van de klasse Vergelijking analyse (p-waarde = 0,001 en 2 voudig verschil), hadden we 61 genen tot overexpressie gebracht bij kanker, 66 in gepaarde normale en 61 met ap waarde van < 1e-07 in ogenschijnlijk normale (Extra File 4). We gebruikten Taqman Relatieve kwantificering RT-PCR voor de validatie van sommige genen geïdentificeerd door het microarray analyse. ACTB werd gekozen als endogene controle, die naast de 18S in de TLDA kaart te besturen.
Al de 49 monsters werkte in de assay maar TLDA 2 genen C11orf42 en IGLL1 hadden niet gewerkt. VROM die gevonden had om differentiële expressie in de monsters in onze microarray analyse had geen variatie in de levels niet laten zien hebben, in de TLDA assay en werd opgenomen als een extra endogene controle. Normalisatie werd gedaan met behulp van ACTB en VROM als endogene controles. Van de 63 genen geselecteerd, exclusief de endogene controle (ACTB en VROM) en de twee genen die niet werkte, we hadden 59 genen voor verdere analyse.
Drie van de genen (REG4, CLDN18, MXRA5) was opgenomen voor validatie van hun potentieel als prognostische marker voor mislukking. In het interval tussen de tijd dat de microarray analyse is voltooid en de RQ-RT-PCR-analyse werd uitgevoerd (ongeveer 3 maanden) waren er extra patiënten een recidief en dus de genen werden niet beschouwd voor verdere analyse als prognostische merkers. Ze werden echter opgenomen om te beoordelen of differentieel tot expressie gebracht tussen PN en tumoren. Ondernemingen De lijst van genen die werden geïdentificeerd om verschillend tot expressie maagkanker zijn in tabel 1 en tabel 2. Tabel 1 vermeldt de genen geïdentificeerd worden differentieel uitgedrukt in maagkanker voor het eerst en tabel 2, worden de genen waarvan bekend is geassocieerd te worden met maagkanker en ook gevonden in onze studie. (Extra Dossiers 5 en 6 geven informatie over deze genen en de bijbehorende referenties). Er zijn vier verschillende patronen van genexpressie - Pattern 1 - overexpressie in PN en in tumoren; Patroon 2 - overexpressie in PN maar neerwaarts gereguleerd in tumoren; Patroon 3 - minimale verandering in PN maar overexpressie in tumoren en patroon 4 - minimale verandering in PN maar neerwaarts gereguleerd in Tumoren (figuur 1) .table 1 Genen gemeld differentieel worden uitgedrukt voor de eerste keer bij maagkanker [Referenties en details in de aanvullende File 4]
SNO
GENE SYMBOOL
opregulatie gemeld in
een verzoek
1
CCL15 /MIP5 /MIP-1D /LKN1
NSCLC
[SF5-R1] 2
ASPN
borstkanker
[SF5-R2]
3
MMP3
darmkanker
[SF5-R3] verhuur 4
SPON2
Lung, eierstokkanker, prostaatkanker
[SF5-R4]
[SF5-R5]
[SF5-R6]
5
PRSS22
eierstokkanker
[SF5-R7]
6
CCL3 /MIP 1A
oraal SCC
[SF5-R8 ]
7
TMEPAI /PMEPAI
Neuro-endocriene tumoren
[SF5-R9]
8
SIX3
9
MFNG
downregulated in baarmoederhalskanker
[SF5-R10]
10 | SGNE1 /SCG5
endocriene tumoren
11
SOSTDC1
downregulated in nierkanker
[SF5-R11]
12
SST
neerwaarts gereguleerd in de slokdarm adenocarcinoom
[SF5-R12]
13
IGHA1
14
AKR1B10
toegenomen in Barrett's epitheel
[SF5-R13]
15
FCGBP
omlaag gereguleerd in colon ca
[SF5-R14]
16
ATP4B
17
NCAPH2
tabel 2 genen bekend betrokken te worden bij maagkanker ontstaan ​​van tumoren die in deze studie [Referenties en details in Extra File 5]
S NO
GENE SYMBOOL
UP golfreizen of DOWN gEREGULEERD
een verzoek
1
CTSB
Up-gereguleerd met name in cardia tumours
[SF6-R1]
2
SPARC/Osteonectin
Up-regulated
[SF6-R2]
3
COL1A1
Up-regulated
[SF5-R3]
4
COL1A2
Up-regulated
[SF5-R3]
5
COL4A1/Arresten
Up-regulated
[SF5-R4]
6
CXCL1/GRO1/MGSA
Up-regulated
[SF5-R5]
7
SPP1/osteopontin
Up-regulated
[SF5-R6]
8
CXCL9/MIG
Up-regulated
[SF5-R7]
9
IL8/CXCL8
Up-regulated
[SF5-R8]
10
TIMP1
Up-regulated
[SF5-R9]
11
LUM/SLRR2D/LDC
Up-regulated
[SF5-R10]
12
CXCL5/ENA78
Up-regulated
[SF5-R11]
13
CXCL10/INP10/IP10
Up-regulated
[SF5-R4]
14
CEACAM6
Up-regulated
[SF5-R12]
15
REGIV
Up-regulated
[SF5-R13]
16
S100A10/ANX2L/CAL1L
Up-regulated
[SF5-R14]
17
SERPINH1/HSP47/CBP1
Up-regulated
[SF5-R15]
18
CDH3
Up-regulated
[SF5-R16
19
TACSTD1/EPCAM/CD326
Up-regulated
[SF5-R17]
20
IFITM1/LEU13
Up-regulated
[SF5-R18]
21
CTHRC1
Up-regulated
[SF5-R19]
22
SULF1
Up-regulated
[SF5-R20]
23
RNASE1
Down-regulated
[SF5-R21]
24
PGC
Down-regulated
[SF5-R22]
25
PGA5
Down-regulated
[SF5-R22]
26
GIF
Down-regulated
[SF5-R23]
27
LTF
Down-regulated
[SF5-R24]
28
TFF1
Down-regulated
[SF5-R25]
29
CLDN18
Down-regulated
[SF5-R26]
30
CFD/Adipsin
Secreted door de maag ca cel lines
[SF5-R27]
31
GHRL/Obestatin
Down-regulated
[SF5-R28]
32
LIPF
Down-regulated
[SF5-R29]
33
ANXA10
Down-regulated
[SF5-R30]
Figuur 1 RQ waarden van gepaarde normalen (PN) (n = 20) en tumor (n = 24), met behulp duidelijk normale (AN) (n = 5) als kalibrator. De vouw verandering is ten opzichte van het schijnbaar normalen.
Wij gingen vervolgens naar de eiwitexpressie bevestigen voor sommige van de genen in de AN (n = 4), PN (n = 9) en tumoren (n = 9). We gebruikten de Quantibody array, die is gebaseerd op het principe van sandwich ELISA voor de eiwitniveaus van 15 cytokines, chemokines en groeifactoren [22, 23] bepalen. De mediane waarden en het bereik van de niveaus worden gegeven in Tabel 3. CFD /Adipsin mediane niveaus lager waren in tumoren ten opzichte van de niveaus in PN en AN (p = 0,0324), zijn terwijl CXCL5 /ENA78, CCL20 /MIP 3α, IGFBP3, SPP1 /OPN en TIMP1 verhoogd in PN en tumoren ten opzichte van een, met hogere niveaus waargenomen in tumoren. In tegenstelling EpCAM, IL8, CXCL10 /IP10, CCL3 /MIP-1α, CCl4 /MIP-1β, CCL15 /MIP-1δ, PDGFR-B werden voornamelijk verhoogd in tumoren ten opzichte van AN en PN. EpCAM (p = 0,0001), IL8 (p = 0,0003), MIP-1β (p = 0,0026), MIP-3α (p = 0,039) en TIMP1 (p = 0,0017) niveaus waren significant verschillend (Mann Whitney U test) tumoren versus AN & PN. Bovendien, EpCAM (p = 0,0004), IL8 (p = 0,0015) en MIP-1β (p = 0,0061) waren significant verhoogd in tumoren in vergelijking met hun overeenkomstige PN.Table 3 Mediane waarden voor cytokines en chemokines in een, pn en tumor lysaten

AN
AN
PN

PN
TUMOR
TUMOR

Median in pg /ml
Range in pg /ml
mediaan in pg /ml
Range in pg /ml
mediaan in pg /ml
Range in pg /ml
CFD /Adipsin
27.295,0
22.097,9-31.759,9
27.162,9
19.515,1-38.224,3
13.021,0 *
9.441,5-36.873,1
CXCL5 /ENA-78
283,8
39,3-4.206,1
2.922,7
84,9-31628,7
3978,0
723,9-40669,6
EpCAM
1466,0
905,7-2.266,6
2243,5
915-8885,8
18.717,6 *** /## #
8.966,1-34.529
IGFBP-3
3149,8
124,0-17530,2
12.286,0
134,6-34036,3
17.662,7
196,9-55671,5
IL-8 /CXCL8
22,1
0-62,3
53.1
27,4-190,6
1240,4 *** /###
93,1-3.660,7
CXCL10 /IP-10 | 20.4
1,4-146,1
147,0
0,8-3940,9
384,4
0,7-1643,1
CXCL9 /MIG
369,5
0-8569,7
4.336,1 1.077,2
- 19.396,6
7540,3
727,7-73975,9
CCL3 /MIP-1α
0.0
0-187,4
203,6
0-1177,2
359,0
0-3.231,5
CCl4 /MIP-1β
49.5
0-261,8
94,3
0-335,8
578,6 ** /#
28,7-1.185,2
CCL15 /MIP-1δ
86,0
54-157,3
169,3
51,7-748,9
374,3
63,4-2.825,4
CCL20 /MIP-3α
859,3
76,1-1.784,8
3049,6
893-16262,9
4773,4 *
1.014,4-13.280,7
MMP-3
269,0
0-648,6
143,9
0-353,1
0,0
0-2908,2
SPP1 /OPN
447,0
9,1-896,3
2054,0
193,6-3.183,7
1407,1
12,6-5.819,2
PDGF RB
222,3
174,3-521,4
295,3
184,9-1.079,3
578,6
123,7-1.516,8
TIMP-1
9676,2
4.373,3-17.133,2
27.022,2
17.028,3 - 194.387,8
139.365,6 **
48.146,4-367.203,2
AN - Blijkbaar is normaal; PN - Gekoppelde normale
p-waarde significant voor AN + PN versus Tumor -
* - < 0,05; ** - ≪ 0,005; *** - ≪ 0,0005 door Mann Whitney U test
p-waarde significant voor PN versus Tumor -
# - < 0,01; ## - ≪ 0,005; ### - ≪ 0,0005 door Mann Whitney U test
De plasmaspiegels van de 15 cytokines /chemokines /groeifactoren werden geschat met behulp van de Quantibody array. De 18 niet-kwaadaardige gevallen (12 zonder afwijking gedetecteerd door OGDscopy en 6 met benigne pathologie in de maag) werden samen clubbed en de gemiddelde waarden werden vergeleken tussen de tumor en de goedaardige groep. Mann Whitney U test werd uitgevoerd om de statistische significantie (tweezijdige test) te beoordelen. IL8, CXCL9 /MIG, CCL3 /MIP-1α, CCL20 /MIP-3α, PDGFR-B TIMP1 plasmaspiegels significant verschillend tussen de niet-kwaadaardige groep en maagkanker groep (Tabel 4). SPP1 /OPN niveau waren ook hoger bij maagkanker patiënten vergeleken met de niet-kwaadaardige groep, maar was borderline significant (p = 0,05). De post-operatieve niveaus van EpCAM, IGFBP3, IL8, CXCL10 /IP10, CXCL9 /MIG, CCL3 /MIP-1α, CCL20 /MIP-3α, SPP1 /OPN en PDGFR-B toonde een uniforme daling in alle 8 monsters onderzocht. Daarentegen TIMP1, CCL15 /MIP-1δ en CFD /Adipsin niveaus zelfs toegenomen in de postoperatieve periode meeste monsters (figuur 2) .table 4 Mediane waarden voor cytokinen en chemokinen in plasma van niet-maligne patiënten versus plasma uit patiënten met maag- carcinomen

mediaan voor niet-kwaadaardige (n = 18) (in pg /ml)
RANGE (in pg /ml)
mediaan voor tumoren (n = 58) (in pg /ml)
RANGE (in pg /ml)
CFD /Adipsin
71.520,0
58.000,8-77.527,9
69.236,4
27.926,9-95.255,7
CXCL5 /ENA-78
1100,6
0-7203,2
1702,8
0-11588,5
EpCAM
1789,8
0-13627,3
3527,1
0-35009,2
IGFBP-3
119.467,1
20.164,6-174.498
110.395,1
0-979359,6
IL-8 /CXCL8
22.5
0-69,9
48,9 *
0-396,3
CXCL10 /IP-10 | 670,2
0-3328,9
931,1
0-5158,9
CXCL9 /MIG
6069,2
0-18739,7
7561,8 *
505-6 - 86.999
CCL3 /MIP-1α
1464,8
0 - 10.602,2
2335,1 *
0-32.199
CCl4 /MIP-1β
43,0
0-440,1
127,9
0-2138,5
CCL15 /MIP-1δ
6628,8
1.237,8-13.178,1
5577,9
696,3-11054,4
CCL20 /MIP-3α
139,9
0-1994,1
654,6 #
0-12013,1
MMP-3
10.966,2
3.891,2-38.928,9
13.680,1
1.358,7-80.588,8
SPP1 /OPN
4621,5
0-20518,1
8680,5
0-110.373,2
PDGF RB
1391,5
0-5461,8
2300,5 *
0-34754,4
TIMP-1
31.048,9
15.603,8-220.729,6
98.054,6 #
6.252,5 - 463.941
# - p-waarde < 0,01; * - P-waarde < 0,05 Mann Whitney U test
Figuur 2 Pre (1) en postoperatieve (2) plasmaniveaus van cytokines /chemokines /groeifactoren maagkanker (n = 8). De plasma niveaus werden gemeten met de Quantibody matrix, waarin het beginsel van sandwich ELISA gebruikt in een multiplex formaat. De gegevens voor de schatting van de levels zijn te vinden in de sectie Methoden. Ondernemingen De plasmaspiegels van de cytokines /chemokines /groeifactoren werden vervolgens gecorreleerd met de clinico-pathologische kenmerken. 28 van de 58 maagkanker patiënten hadden een potentieel curatieve radicale chirurgie (R0 resectie) ondergaan en 6 patiënten ondergingen alleen R1 resectie. Deze 34 pathologische specimens waren beschikbaar voor pathologische correlaties (PT, PN, pStage, perinodal spread, lymfatische embolie, vasculaire emboli), terwijl de survival analyse werd uitgevoerd op 28 patiënten die een R0 resectie hadden ondergaan. Tien patiënten ondergingen palliatieve chirurgische ingrepen, terwijl 13 patiënten daalde chirurgie of waren niet geschikt voor andere doeleinden dan ondersteunende zorg interventie. Eén patiënt had een ongedifferentieerde kanker, die aanvullende immunohistochemische studies bleek een primaire maag lymfoom, diffuus grootcellig B celtype. Plasma niveaus MMP3 waar hogere bij mannen dan bij vrouwen (mediane waarde 16772,1 pg /ml versus 8.512,5 pg /ml) (p-waarde = 0,011);

• Correlatie tussen HER-2 /neu (erbB-2) expressieniveau en therapeutisch effect van de combinatiebehandeling met HERCEPTIN® en chemotherapeutische middelen bij maagkanker cellijnen
• Fase I studie van neoadjuvante chemoradiotherapie met S-1 plus tweewekelijkse cisplatine voor gevorderde maagkanker patiënten met lymfeklieren metastase: -KOGC04-