Identificación y validación de genes implicados en la tumorigénesis gástrico

Identificación y validación de genes implicados en la tumorigénesis gástrica
Resumen Antecedentes

El cáncer gástrico es uno de los cánceres comunes que se observan en el sur de la India. Por desgracia, más del 90% están avanzados para el momento en que informan a un centro terciario en el país. Hay una necesidad urgente para caracterizar estos tipos de cáncer y tratar de identificar biomarcadores potenciales y nuevas dianas terapéuticas.
Materiales y métodos Se utilizó
24 cánceres gástricos, 20 tejidos gástricos de apariencia normal normales (PN) y 5 pareadas obtenidas de pacientes con cánceres gástricos (no de apariencia normal - AN) para el estudio de microarrays seguido de la validación de los genes significativos (n = 63) por la cuantificación relativa utilizando TaqMan Low Density Arrays PCR en tiempo real. A continuación, utiliza una matriz de proteínas Quantibody hecho a medida para validar la expresión de 15 proteínas en los tejidos gástricos (4 AN, 9 y 9 PN cánceres gástricos). El mismo formato de matriz se utilizó para estudiar los niveles plasmáticos de estas proteínas en 58 pacientes con cáncer gástrico y 18 de pacientes con afecciones gástricas normales /no malignas.
: Resultados de la Diecisiete genes (ASPN, CCL15 /MIP-1δ , MMP 3, SPON2, PRSS2, CCL3, TMEPAI /PMEPAI, SIX3, MFNG, SOSTDC1, SGNE1, SST, IGHA1, AKR1B10, FCGBP, ATP4B, NCAPH2), se mostró a ser expresadas diferencialmente entre los tumores y la normal se combina, por primera hora. EpCAM (p = 0,0001), IL8 (p = 0,0003), CCL4 /MIP-1β (p = 0,0026), CCL20 /MIP-3α (p = 0,039) y TIMP1 (p = 0,0017) los niveles de proteína de tejido fueron significativamente diferentes (Mann Whitney U test) entre los tumores frente a un & PN. Además, los niveles medios en plasma de IL-8, CXCL9 /MIG, CCL3 /MIP-1α, CCL20 /MIP-3α, PDGFR-B y proteínas TIMP1 fueron significativamente diferentes entre el grupo de no maligno y el grupo de cáncer gástrico. Los niveles post-quirúrgicos de EpCAM, IGFBP3, IL8, CXCL10 /IP10, CXCL9 /MIG, CCL3 /MIP-1α, CCL20 /MIP-3α, SPP1 /OPN y PDGFR-B mostraron un descenso uniforme en todas las muestras estudiadas.
Conclusiones
Nuestro estudio ha identificado varios genes expresados ​​diferencialmente en el cáncer gástrico, algunos por primera vez. Algunos de ellos han sido confirmados a nivel de proteínas, también. Algunas de estas proteínas se necesitará una evaluación más profunda por su potencial como biomarcadores de diagnóstico en los cánceres gástricos y algunos de ellos podrían ser útiles como marcadores de seguimiento en el cáncer gástrico.
Introducción
El cáncer gástrico es uno de los cánceres comunes que se observan en sur de la India, clasificada con un 2 nd entre hombres y 5 ª entre las mujeres en el área metropolitana de Chennai [1]. De los pacientes que acuden a la institución de educación superior, más del 90% se hacen avanzar en la presentación y sólo tratamiento paliativo es factible en estos pacientes [2]. En 2005 y 2006, un total de 1239 pacientes con cáncer gástrico fueron vistos en el Instituto, de los cuales 211 pacientes habían sido tratados previamente en otro lugar. Entre los pacientes no tratados previamente de tratamiento (n = 1028), el 61% era localmente avanzado y el 39% estaban con metástasis a distancia. En vista de la naturaleza avanzada de la enfermedad y debido a un mal estado general, sólo 91 pacientes se acercaron para la cirugía con intención curativa. Esto pone de relieve el problema de la falta de detección temprana para el cáncer gástrico en la India.
En Japón, que tiene una alta incidencia de cáncer gástrico, la fotofluoroscopia se hace como un programa de cribado de la población, lo que resulta en la detección precoz de las lesiones, algunos confinados a la mucosa solamente [3]. Tal procedimiento es poco probable que sea la solución en un país grande como la India. A la vista de los síntomas sutiles como la indigestión, pérdida de peso gradual que generalmente son ignorados, la mayoría de los pacientes se presentan con enfermedad avanzada. Por tanto, es esencial para el desarrollo de pruebas de detección fiables que pueden ayudar en la detección temprana de la enfermedad. ensayos basados ​​en suero para pepsinógeno y el anticuerpo H. pylori no han ganado amplia aceptación y no se han considerado para la selección de los individuos por el Centro Nacional del Cáncer, Tokio, Japón [3]. La prueba de diagnóstico debe ser preferiblemente sangre o la orina muestra basada y necesita ser específico. Estar entre los principales factores de riesgo para el cáncer gástrico, la dieta juega un papel importante. El consumo de alimentos salados (pescado y carne) y el tabaco están asociados con un mayor riesgo [4-6]. gastritis atrófica crónica y metaplasia intestinal se han considerado como los cambios pre-malignas en la mucosa gástrica. El consumo de tabaco, H. pylori, las dietas con alto contenido de sal, nitritos y nitratos, y la baja ingesta de frutas y verduras son conocidos factores de riesgo para la gastritis atrófica crónica [7]. La dieta del sur de la India tradicionalmente se compone de alto contenido de frío y fritos los alimentos, con el aceite usado para freír someterse a varios ciclos de uso antes de ser desechado y, por tanto, contiene un alto contenido de carcinógenos [5, 8, 9].
Cánceres gástricos son en su mayoría los adenocarcinomas y podrían ser de tres subtipos - intestinales, difusas y mixtos [10]. El tipo de cáncer gástrico intestinal se ve generalmente en la parte distal del estómago, tiene etapas precancerosas y se compone de las células cancerosas cohesivos formando glándulas como las estructuras [11]. La mayoría de los tipos intestinales son bien a moderadamente diferenciado (clasificación de la OMS). El tipo difuso consiste en la infiltración de células cancerosas individuales y extendiendo mucho más allá de sus fronteras macroscópicos. Por lo general son poco diferenciados a indiferenciados [12]. En Chennai, tumores distales son más comunes que los cánceres proximales. Estudios de expresión
gen en diferentes tipos de cáncer han ayudado en la identificación de genes implicados en el proceso de la tumorigénesis [13]. Se han reportado estudios de microarrays que comparan las diferencias de expresión génica entre normal del estómago y cáncer gástrico [14], entre los tumores gástricos jóvenes y ancianos pacientes con cáncer [15], entre el tumor primario y lesiones metastásicas [16]. Nuestro estudio compara la expresión de genes entre tejidos gástricos de apariencia normal, obtenidas de pacientes con cánceres no gástricas (aparentemente normal - AN), muestras de tejidos gástricos bien lejos del tumor y confirmados por la sección de congelados no tienen células tumorales (emparejado normales - PN) y los cánceres gástricos (tumores - T). Este es el primer estudio para examinar los patrones de expresión de genes de cáncer gástrico en pacientes sur de la India y validar algunos de estos genes a nivel de proteínas por su potencial como biomarcadores para el cáncer gástrico.
Materiales y métodos
cinco muestras AN (2 a partir de pacientes con cáncer de hipofaringe, 1 de carcinoma escamoso esofágico superior celular, 1 de carcinoma periampular, 1 de cáncer de páncreas) de los pacientes que se sometieron a la resección del estómago como parte de su cirugía primaria se incluyeron en el estudio. Además, 24 cánceres gástricos y 20 PN se incluyeron en el estudio. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado para el estudio, que fue aprobado por el comité ético institucional.
Los especímenes quirúrgicos fueron procesadas inmediatamente y se tomaron secciones de la sección congelada. muestras tumorales con las células de cáncer más de 70%; muestras PN y AN sin evidencia de células tumorales y la morfología aparentemente normal se incluyeron en el estudio.
Además, las muestras de sangre se obtuvieron de individuos sometidos a oesophagogastroduodenoscopy (OGDscopy) para los síntomas dispépticos y para descartar cualquier patología del tracto gastrointestinal superior. De esta cantidad, 58 resultaron ser los cánceres gástricos, 6 se encontró que tenían patología benigna en el estómago (gastritis, úlcera benigna) y 12 tenían un informe normal de OGDscopy. En 8 pacientes con cáncer gástrico que se sometieron a cirugía radical, también se recogió una muestra de sangre después de la operación entre el día 7 y el día 15, excepto dos pacientes en los que se tomó la muestra en el momento de su primer seguimiento después de la cirugía (días 55 y 64) .
extracción de RNA Francia el ARN fue extraído de las muestras de tejido utilizando el kit de extracción de ARN RNeasy (Qiagen, Gmbh, Hilden; Cat no: 74106) según las instrucciones del fabricante. La calidad del ARN utilizado para el análisis de micromatrices se comprobó usando el Bioanalyzer y las muestras con un número de integridad del ARN (RIN) de 7 o más se incluyeron en el estudio. El ARN se cuantificó usando NanoDrop ™ ND1000 (NanoDrop Technologies, EE.UU.) espectrofotómetro.
La detección de H. pylori Análisis FODA para H. pylori en muestras de tejido gástrico se realizó mediante PCR como se describe anteriormente [17]. cebadores de PCR diseñados para amplificar la región de S2 Vac un gen en el genoma de H. pylori fueron utilizados para la detección. La reacción amplifica un amplicón de aproximadamente 194 pb de longitud experimento Microarray
1 g de ARN total de tumor /PN /AN de muestra y RNA universal (Stratagene; Cat no: 740000-41). Se transcribió de forma inversa usando la matriz guión a 42 ° C durante 2 horas para obtener ADNc utilizando el kit de amplificación de Amino alil MessageAmp II ARNa (Ambion, Austin, Tx; Cat no: AM1797). El cDNA se amplificó, etiquetado, hibrida y se desliza escaneada como se describe anteriormente [18] MyBestPlay Todos los archivos de datos brutos se han presentado al GEO con un número asignado GEO adhesión -.. GSE17154
análisis de datos de microarrays Francia El primer plano y de fondo de intensidad mediana para Cy3 y Cy5, se importaron en el software BRB-ArrayTools [19] utilizando la función de asistente de importación. Corrección de fondo no se hizo. la normalización mundial se utilizó para el centro de la mediana de los diario de los coeficientes en cada serie con el fin de ajustar las diferencias en las intensidades de etiquetado de los colorantes Cy3 y Cy5. Los datos fueron analizados utilizando el módulo de comparación de clase [20] en el software BRB-ArrayTools.
Clase Comparación de Herramientas BRB-Array
hemos identificado los genes que son expresados ​​diferencialmente entre las 3 clases (tumor /PN /AN) utilizando el módulo de clase de comparación. se utilizó univariante F-test y los genes fueron considerados estadísticamente significativos si su valor de p era < 0.001. Además se requiere una diferencia de dos veces entre las diferentes clases
cuantitativa en tiempo real PCR
validación en tiempo real de la expresión de genes se realizó utilizando la PCR en tiempo real TLDA (Applied Biosystems, Foster City, CA; Cat. No: 4.342.261). muestras por triplicado plantilla de cDNA fueron amplificados y analizados en el sistema ABI Prism 7900HT detección de secuencias (Applied Biosystems, Foster City, CA) como se describe anteriormente [18].
Los datos en bruto desde el sistema de detección de secuencias Prism 7900HT fue importado en Microsoft Excel software para el análisis estadístico de los datos. Entre los genes endógenos de referencia incluidos en la matriz (gen 18S ribosomal; ACTB), ACTB fue elegido después de la visualización de la distribución global de valor Ct, para normalizar los datos. Además, HSPE1 que se había incluido en base a la expresión diferencial visto en la Microarray, se encontró que tenía una variación mínima y por lo tanto se incluyó como control endógeno adicional. Los ensayos se realizaron a TLDA Labindia Instrumentos laboratorios Pvt Ltd en Gurgaon, Nueva Delhi. Empresas El AN muestras se utilizaron como calibradores y los valores de cuantificación relativa se calcularon para todos los genes y las muestras.
De Gene ontología análisis
los genes que se encuentran diferencialmente expresados ​​en los tumores y normales, basadas en los datos de microarrays emparejado se importaron en el módulo Fatigo de Babelomics [21] y se analizó la sobrerrepresentación de los términos de GO en comparación con el resto del genoma, utilizando la prueba exacta de Fisher para tablas de contingencia 2 × 2. El valor p se fijó en < 0.05.
Preparación de lisados ​​de tejido de proteínas y Recogida de Plasma
Proteína lisados ​​para el análisis utilizando arrays de anticuerpos se prepararon 60-80 mg de muestras de tejido gástrico congelados. Las muestras de tejido fueron molidos en presencia de nitrógeno líquido usando mortero y mano de mortero. El tejido en polvo se resuspendió en tampón de lisis de tejidos (Tris. HCL pH 7,5, cloruro de sodio 150 mM, 1% de desoxicolato de sodio, 1% de NP40). Antes de su uso, tampón de lisis fue suplementado con completa Mini ™ cóctel inhibidor de proteasa (Roche Diagnostics GmbH, Alemania). Los lisados ​​de proteína se sometieron a tratamiento con ultrasonidos utilizando células Vibra ™ (Sonics Inc., EE.UU.) de ultrasonidos. Los lisados ​​fueron aprobados por centrifugación y se cuantificaron utilizando Coomassie Plus reactivo de ensayo de Bradford ™ (Pierce Inc., EE.UU.) según el protocolo del fabricante. La calidad de las proteínas se analizó mediante la resolución de 50 g de lisado en dodecil sulfato de sodio en gel de poliacrilamida 10% (SDS) y posteriormente se visualizaron por tinción con azul de Coomassie.
El plasma se obtuvo a partir de 5 ml de sangre recogidas en presencia de 200 l de ácido acético de etileno diamina tetra 10% (EDTA). El plasma aislado de las muestras de sangre se centrifuga a 3000 g y se almacena a -80 ° C en alícuotas
Anticuerpo Arrays Arrays de anticuerpos
personalizados de matriz Quantibody ™ (número de catálogo: QAA-CUST). Sobre la base de un sistema ELISA múltiplex para la medición cuantitativa de múltiples proteínas adquiridos a Ray Biotech, Inc, EE.UU. se utilizó para estudiar los niveles de expresión de proteínas en los tejidos gástricos y muestras de plasma [22, 23]. Los siguientes genes (CXCL5 /ENA-78, CXCL8 /IL-8, CXCL10 /IP10, CXCL9 /MIG, CCL3 /MIP-1α, CCL15 /MIP-1δ, EpCAM, MMP 3, SPP1 /OPN, TIMP1, Adipsin /CFD, CCl4 /MIP-1β, CCL20 /MIP-3α, PDGFR-B y IGFBP-3) encontrado que se sobreexpresa en cánceres gástricos con relación a PN y AN (con la excepción de CFD /Adipsin que se sobreexpresa en PN en relación con los cánceres gástricos y AN) fueron estudiados por sus niveles de proteína en el tumor, PN correspondiente y en un tejido. Además, los niveles plasmáticos de estas proteínas en los pacientes que habían sido sometidos OGDscopy se calcula utilizando el mismo formato de matriz (58 pacientes con cáncer gástrico, 6 con úlcera gástrica o duodenal benigna o gastritis y 12 con el informe de la normalidad OGDscopy). En 8 pacientes con cáncer gástrico que habían sido sometidos a cirugía radical, se recogieron y analizaron muestras pre y post-operatorio. Francia El ensayo se realizó como se describe en el protocolo del fabricante. En pocas palabras, en el caso de los lisados ​​de tejidos de 100 g de lisado de proteínas se preparó diluyendo la solución madre de lisado de tejido usando tampón de muestra diluyente suministrado por el fabricante a una concentración final de 1 mg /ml. 100 l de lisado diluido se incubó en la cámara de matriz durante 2 horas. En el caso de las muestras de plasma, el plasma se diluyó con tampón de muestra diluyente suministrado con el kit en una relación de 1: 1. 100 l de la muestra de plasma diluido se incubó en la cámara de matriz durante 2 horas. Para cada experimento array, estándares suministrados junto con el kit estaban recién preparados tal como se describe por el protocolo de los fabricantes y se incluye junto con un control de tampón diluyente de muestra (control negativo), que no tenía estándar o muestras. Los arrays se procesaron tal como se describe por el protocolo del fabricante. Las diapositivas fueron escaneadas a 5 μ de resolución y un PMT de 70 usando Pro Scan ™ de matriz (Perkin Elmer Inc., EE.UU.). En estos ajustes del escáner las señales de la más alta concentración estándar no alcanzó la saturación. Los datos fueron analizados utilizando el Quantibody Q-Analyzer, una matriz específica, programa basado en Microsoft Excel, suministrado con los arreglos personalizados. El análisis estadístico
Francia El mediana y el rango de los valores plasmáticos fueron calculados usando la hoja de cálculo de Microsoft Excel ™ software (Microsoft, Inc.,). Mann Whitney U test (http:... //Facultad vassar edu /Lowry /uTest html) se utilizó para estudiar la importancia de los valores de la mediana del plasma y dos pruebas de cola se utiliza para la obtención de la p valor.
resultados
los datos clínico-patológicas de todos los pacientes, cuyas muestras se utilizaron para el análisis de microarrays y sus muestras de tumores, se da en el archivo adicional 1 y 2. los datos clínico-patológicas de los pacientes de los cuales se obtuvieron muestras de sangre para la estimación de los niveles plasmáticos de citoquinas /quimioquinas /factores de crecimiento se da en el archivo adicional 3.
de los 24 pacientes cuyas muestras de tumor se utilizaron para el estudio de microarrays, 16 eran mayores de 45 años de edad y 8 con 45 años o menos; 18 eran varones y 6 eran mujeres; 5 eran tumores que surgen en la región del cardias, 2 de cuerpo y 17 del antro. Todas las veinticuatro tumores fueron adenocarcinomas con uno de ellos siendo el adenocarcinoma pobremente diferenciado con áreas de características neuro-endocrino. Entre los adenocarcinomas, subtipo intestinal fue la más frecuente (n = 16), mientras que el subtipo difuso se observó en 5 y se mezcla en tumores de grado III 2. predominaron (n = 20), sin que los tumores de grado I en nuestra serie. Diecisiete de 24 fueron los ganglios positivos y 4 tenían metástasis a distancia en la presentación.
Con base en el análisis comparativo de clase (valor de p = 0,001 diferencia y 2 veces), tuvimos 61 genes sobreexpresados ​​en el cáncer, 66 en condiciones normales pareados y 61 con una p valor de < 1e-07 en aparentemente normal (Servicio de archivo 4). Utilizamos Taqman cuantificación relativa RT-PCR para la validación de algunos de los genes identificados por el análisis de microarrays. ACTB fue elegida como control endógeno, que era además de los 18S control presente en la tarjeta TLDA.
Todas las 49 muestras trabajadas en el ensayo, pero TLDA 2 genes, C11orf42 y IGLL1 no habían funcionado. HSPE que se había encontrado que tienen expresión diferencial en las muestras en nuestro análisis de microarrays no mostraron ninguna variación en los niveles, en el ensayo de TLDA y se incluyó como control endógeno adicional. La normalización se realizó utilizando ACTB y HSPE como controles endógenos. De los 63 genes seleccionados, con exclusión de los controles endógenos (ACTB y HSPE) y los dos genes que no habían trabajado, tuvimos 59 genes para su posterior análisis.
Tres de los genes (REG4, CLDN18, MXRA5) se había incluido validación de su potencial como marcador pronóstico para el fracaso. Sin embargo, en el intervalo entre el momento en que se completó el análisis de microarrays y el análisis de RQ-RT-PCR se realizó (aproximadamente 3 meses) hubo más pacientes que recayeron y por lo tanto los genes no se consideraron para su posterior análisis como marcadores de pronóstico. Sin embargo, se incluyeron para evaluar si estaban expresados ​​diferencialmente entre PN y los tumores. México La lista de genes que fueron identificados para ser expresadas diferencialmente en el cáncer gástrico se dan en la Tabla 1 y la Tabla 2. La Tabla 1 enumera los genes identificados a ser expresadas diferencialmente en el cáncer gástrico por primera vez y en la Tabla 2, enumera los genes que han sido conocidos por estar asociados con el cáncer gástrico, y se encuentra también en nuestro estudio. (Archivos adicionales 5 y 6 proporcionan información sobre estos genes y las referencias correspondientes). Hay cuatro patrones diferentes de la expresión génica - Patrón 1 - sobreexpresa en PN y en tumores; Patrón 2 - sobreexpresa en PN, pero regulado por disminución en los tumores; Patrón 3 - cambio mínimo en el PN pero sobreexpresada en tumores y patrón de 4 - cambio mínimo en el PN, pero regulado por disminución en los tumores (Figura 1) 1 .table genes se informó que se expresó diferencialmente por primera vez en el cáncer gástrico [Referencias y detalles adicionales en el archivo 4]
SNO
GENE SÍMBOLO
regulación al alza MENCIONADAS EN
referencia
1
CCL15 /MIP5 /MIP-1d /LKN1
NSCLC
[SF5-R1]
2 ASPN
cáncer de mama
[SF5-R2] página 3
MMP 3
cáncer colorrectal
[SF5-R3]
4 de SPON2
pulmón, ovario, cánceres de próstata
[SF5-R4]
[SF5-R5]
[SF5-R6] página 5
PRSS22
cáncer de ovario
[SF5-R7] página 6
CCL3 /MIP 1A
vía oral SCC
[SF5-R8 ] página 7
TMEPAI /PMEPAI
Neuro-endocrina tumores
[SF5-R9] página 8
SIX3 página 9
MFNG
regulados a la baja en el cáncer cervical
[SF5-R10]
10
SGNE1 /SCG5
tumores endocrinos página 11
SOSTDC1
regulados a la baja en el cáncer renal
[SF5-R11] página 12
SST
regulados a la baja en el adenocarcinoma esofágico
[SF5-R12] página 13
IGHA1 página 14
AKR1B10
El aumento en el epitelio de Barrett
[SF5-R13]
15
FCGBP
abajo regulado en el colon ca
[SF5-R14]
16
ATP4B
17
NCAPH2
Tabla 2 Los genes que se sabe están involucrados en tumorigénesis cáncer gástrico identificado en este estudio [Referencias y detalles en el archivo adicional 5]
S NO
GENE SÍMBOLO
la arriba o hacia abajo rEGULADO
referencia
1

• Correlación entre HER-2 /neu (-2 erbB) nivel de expresión y el efecto terapéutico de tratamiento de combinación con HERCEPTIN® y agentes quimioterapéuticos en gástrico Correlación lines
• Estudio de fase I de la quimiorradioterapia neoadyuvante con S-1 y cisplatino cada dos semanas para pacientes con cáncer gástrico avanzado con metástasis en los ganglios linfáticos: -KOGC04-