Identificazione e validazione dei geni coinvolti nella gastrica Identificazione tumorigenesis

e validazione dei geni coinvolti nella tumorigenesi gastrica
Abstract
sfondo
cancro gastrico è uno dei tumori più comuni osservati nel sud dell'India. Purtroppo più del 90% sono avanzati dal tempo riferiscono ad un centro superiore del paese. Vi è un urgente bisogno di caratterizzare questi tipi di cancro e cercare di identificare potenziali biomarcatori e nuovi bersagli terapeutici.
Materiali e metodi
Abbiamo usato 24 tumori gastrici, 20 tessuti gastrici apparentemente normali, normali (PN) e 5 appaiati ottenuti da pazienti con tumori non-gastrico (apparentemente normale - AN) per lo studio di microarray seguita dalla validazione dei geni significativi (n = 63) di relativa quantificazione utilizzando Taqman Low Density Array Real Time PCR. Abbiamo poi utilizzato una matrice proteica Quantibody su misura per convalidare l'espressione di 15 proteine ​​nei tessuti gastrici (4 AN, 9 PN e 9 tumori gastrici). Lo stesso formato array è stato usato per studiare i livelli plasmatici di queste proteine ​​in 58 pazienti affetti da tumori gastrici e 18 da pazienti con condizioni gastriche normali /non-maligne
. Risultati
Diciassette geni (ASPN, CCL15 /MIP-1δ , MMP3, SPON2, PRSS2, CCL3, TMEPAI /PMEPAI, SIX3, MFNG, SOSTDC1, SGNE1, SST, IGHA1, AKR1B10, FCGBP, ATP4B, NCAPH2) hanno dimostrato di essere differenzialmente espressi tra i tumori e la normale accoppiato, per la prima tempo. EpCAM (p = 0.0001), IL8 (p = 0,0003), CCL4 /MIP-1β (p = 0,0026), CCL20 /MIP-3α (p = 0,039) e TIMP1 (p = 0,0017) livelli di proteine ​​dei tessuti erano significativamente differenti (Mann Whitney U test) tra tumori rispetto a un & PN. Inoltre, i livelli plasmatici medi di IL8, CXCL9 /MIG, CCL3 /MIP-1α, CCL20 /MIP-3α, PDGFR-B e proteine ​​TIMP1 erano significativamente differenti tra il gruppo non-maligne e il gruppo di cancro gastrico. I livelli post-chirurgici di EpCAM, IGFBP3, IL8, CXCL10 /IP10, CXCL9 /MIG, CCL3 /MIP-1α, CCL20 /MIP-3α, SPP1 /OPN e PDGFR-B hanno mostrato un calo uniforme in tutti i campioni studiati.
Conclusioni
il nostro studio ha identificato diversi geni differenzialmente espressi nei tumori gastrici, alcuni per la prima volta. Alcuni di questi sono stati confermati a livello proteico, pure. Alcune di queste proteine ​​dovrà essere valutata ulteriormente per il loro potenziale come biomarker diagnostici nei tumori gastrici e alcuni potrebbero essere utili come indicatori di follow-up di cancro gastrico.
Introduzione
cancro gastrico è uno dei tumori più comuni visti in sud dell'India, classificata 2 nd tra gli uomini e 5 th tra le donne nella zona di Chennai Metropolitan [1]. Dei pazienti che presentano all'istituzione terziaria, più del 90% sono avanzati a presentazione e solo palliativo è fattibile in questi pazienti [2]. Nel 2005 e 2006, per un totale di 1239 pazienti affetti da cancro gastrico sono stati visti presso l'Istituto, di cui 211 pazienti erano stati precedentemente trattati altrove. Tra i pazienti naïve trattamento (n = 1028), il 61% sono stati localmente avanzato e il 39% erano con metastasi a distanza. In considerazione della natura avanzata della malattia e causa della scarsa performance status, solo 91 pazienti si avvicinò per un intervento chirurgico con l'intento di curare. Questo mette in evidenza il problema della mancanza di diagnosi precoce per il cancro gastrico in India.
In Giappone, che ha una alta incidenza di cancro gastrico, lo screening photofluorography è fatto come un programma di screening per la popolazione, con conseguente diagnosi precoce delle lesioni, alcuni confinata mucosa solo [3]. Tale procedura è improbabile che sia la soluzione in un grande paese come l'India. In considerazione dei sintomi sottili come indigestione, graduale perdita di peso che sono generalmente ignorati, la maggior parte dei pazienti si presentano con malattia avanzata. E 'quindi essenziale per sviluppare test di screening affidabili che possono aiutare nella diagnosi precoce della malattia. test basati siero per Pepsinogen e anticorpi da H. pylori non hanno guadagnato l'accettazione diffusa e non sono stati presi in considerazione per lo screening individui dal National Cancer Center, Tokyo, Giappone [3]. Il test diagnostico dovrebbe essere preferibilmente sangue o nelle urine del campione basata e deve essere specifica.
Tra i principali fattori di rischio per il cancro gastrico, la dieta gioca un ruolo importante. Il consumo di cibi salati (pesce e carne) e il tabacco sono associati ad un aumentato rischio [4-6]. Cronica gastrite atrofica e metaplasia intestinale sono stati considerati come i cambiamenti pre-maligne della mucosa gastrica. Il fumo di tabacco, H. pylori, le diete ad alto contenuto di sale, nitriti e nitrati, e basso apporto di frutta e verdura sono noti fattori di rischio per la gastrite cronica atrofica [7]. La dieta del sud indiana, tradizionalmente costituito da alto contenuto di freddo e profondo cibi fritti, con l'olio usato per friggere in fase di diversi cicli di utilizzo prima di essere scartato e quindi contiene un alto contenuto di sostanze cancerogene [5, 8, 9].
Tumori gastrici sono prevalentemente adenocarcinomi e potrebbero essere di tre sottotipi - intestinali, diffusa e misti [10]. Il tipo di cancro gastrico intestinale di solito è visto nella parte distale dello stomaco, ha fasi precancerose e si compone di cellule tumorali coesivi che formano ghiandola come strutture [11]. La maggior parte dei tipi intestinali sono ben al differenziato moderatamente (WHO Classification). Il tipo diffuso è costituito da singole cellule tumorali infiltranti e diffusione ben oltre i suoi confini macroscopiche. Di solito sono poco differenziate per indifferenziata [12]. A Chennai, tumori distali sono più comuni di tumori prossimali. Gli studi di espressione genica
in diversi tipi di cancro hanno aiutato a identificare geni coinvolti nel processo di tumorigenesi [13]. sono stati riportati studi di microarray a confronto le differenze di espressione genica tra normale stomaco e cancro gastrico [14], tra i tumori gastrici giovani ed anziani dei pazienti di cancro [15], tra tumore primitivo e metastasi [16]. Il nostro studio mette a confronto l'espressione genica tra apparentemente normali tessuti gastrici ottenuti da pazienti con tumori non-gastrico (apparentemente normale - AN), campioni di tessuto gastrico ben lontano dal tumore e confermati dalla sezione ghiacciato di non avere le cellule tumorali (in coppia normale - PN) e tumori gastrici (tumori - T). Questo è il primo studio per esaminare i modelli di espressione genica dei tumori gastrici in pazienti sud indiano e convalidare alcuni di questi geni a livello di proteina per il loro potenziale come biomarcatori per il cancro gastrico.
Materiali e metodi
cinque campioni AN (2 da pazienti con cancro ipofaringea, 1 da carcinoma a cellule squamose dell'esofago superiore, 1 da peri-ampollari carcinoma, 1 da cancro al pancreas) da pazienti sottoposti a resezione dello stomaco come parte della loro chirurgia primaria sono stati inclusi nello studio. Inoltre, 24 tumori gastrici e 20 PN sono stati inclusi nello studio. Tutti i pazienti hanno fornito il loro consenso informato per lo studio, che è stato approvato dal Comitato Etico Istituzionale.
I campioni sono stati immediatamente operativi elaborati e le sezioni sono state prese per la sezione congelata. campioni tumorali con cellule tumorali più del 70%; campioni PN e AN con nessuna evidenza di cellule tumorali e la morfologia apparentemente normale sono stati inclusi nello studio.
Inoltre, i campioni di sangue sono stati raccolti da soggetti sottoposti oesophagogastroduodenoscopy (OGDscopy) per i sintomi dispeptici e per escludere eventuali patologie del tratto gastrointestinale superiore. Di questi, 58 sono risultati essere i tumori gastrici, 6 sono stati trovati ad avere patologia benigna nello stomaco (gastriti, ulcera benigna) e il 12 ha avuto un rapporto normale OGDscopy. In 8 pazienti affetti da cancro gastrico sottoposti a chirurgia radicale, campione di sangue post-operatorio sono stati raccolti anche tra il giorno 7 e il giorno 15, tranne due pazienti in cui il campione è stato raccolto al momento del loro primo follow-up dopo l'intervento chirurgico (giorni 55 e 64) .
estrazione di RNA
l'RNA è stato estratto da campioni di tessuto utilizzando il kit di estrazione di RNA RNeasy (Qiagen, Gmbh, Hilden; Cat: 74106) come da istruzioni del produttore. La qualità dell'RNA utilizzato per l'analisi micro-array è stata controllata usando l'Bioanalyzer e campioni con un RNA Integrity Number (RIN) di 7 o più stati inclusi nello studio. RNA è stato quantificato usando NanoDrop ™ ND1000 (NanoDrop Technologies, USA) spettrofotometro
. Rilevamento di H pylori
analisi per H pylori in campioni di tessuto gastrico è stata effettuata utilizzando la PCR come descritto in precedenza [17]. primer PCR disegnati per amplificare regione S2 di Vac Un gene nel genoma pylori H sono stati utilizzati per il rilevamento. La reazione amplifica un amplicone di circa 194 bp lunghezza
esperimento microarray
1 mg di RNA totale dal tumore /PN /un campione e l'RNA universale (Stratagene; Cat: 740,000-41). Sono stati trascrizione inversa utilizzando Array scritto a 42 ° C per 2 ore per ottenere cDNA utilizzando il kit di amplificazione Amino allile MessageAmp II aRNA (Ambion, Austin, TX; Cat: AM1797). Il cDNA è stato amplificato, etichettato, ibridato e diapositive scansione come descritto in precedenza [18] in tutte le nazioni sono state presentate i file di dati grezzi di geo con un numero di GEO adesione assegnato -.. GSE17154
analisi dei dati microarray
Il primo piano e sfondo intensità mediana per Cy3 e Cy5, sono stati importati in un software BRB-ArrayTools [19] utilizzando la funzione di importazione guidata. Correzione di fondo non è stato fatto. normalizzazione globale è stato utilizzato per il centro mediano i log-rapporti su ogni array, al fine di compensare le differenze di intensità di etichettatura dei coloranti Cy3 e Cy5. I dati sono stati analizzati utilizzando il modulo di confronto Class [20] nel software BRB-ArrayTools.
Classe confronto in Strumenti BRB-Array
Abbiamo identificato i geni che sono state espresse in maniera differenziale tra le 3 classi (tumore /PN /AN) utilizzando il modulo di Classe confronto. Univariata F-test è stato utilizzato ed i geni sono stati considerati statisticamente significativo se il loro valore p era < 0.001. Inoltre, una differenza di due volte è stato richiesto tra le diverse classi
quantitativa in tempo reale PCR
convalida in tempo reale dell'espressione genica è stata fatta usando il tempo reale TLDA PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA; Cat.: 4.342.261). campioni del modello triplice copia di cDNA sono stati amplificati e analizzati sul sistema ABI Prism 7900HT rilevamento sequenza (Applied Biosystems, Foster City, CA), come descritto in precedenza [18].
I dati grezzi provenienti dal sistema di rilevazione sequenza di Prism 7900HT è stato importato in Microsoft Excel software per l'analisi statistica dei dati. Tra i geni di riferimento endogeni inclusi sulla matrice (18S gene ribosomiale, ACTB), ACTB è stato scelto dopo la visualizzazione della distribuzione del valore Ct globale, per normalizzare i dati. Inoltre, HSPE1 che era stato incluso in base alla espressione differenziale visto su microarray, è stato trovato per avere variazioni minime e, quindi, è stata inclusa come controllo endogeno aggiuntivo. I saggi TLDA sono stati eseguiti a LabIndia Strumenti laboratori Pvt Ltd a Gurgaon, New Delhi.
I campioni AN sono stati utilizzati come calibratori ed i valori di quantificazione relativi sono stati calcolati per tutti i geni ed i campioni.
Gene Ontology Analisi
i geni trovati ad essere differenzialmente espressi nei tumori e normali 'sulla base dei dati di microarray appaiati sono stati importati nel modulo Fatigo di Babelomics [21] e analizzati per la sovrarappresentazione dei termini GO in confronto al resto del genoma, utilizzando test esatto di Fisher per le tabelle 2 × 2 di emergenza. Il valore p è stato fissato a < 0.05.
Preparazione di lisati proteine ​​dei tessuti e raccolta di plasma
lisati proteici per l'analisi utilizzando gli array di anticorpi sono stati preparati 60-80 mg di campioni di tessuto gastrico congelati. I campioni di tessuto sono stati macinati in presenza di azoto liquido con mortaio e pestello. Il tessuto in polvere è stato risospeso in tampone di lisi tissutale (Tris. HCL pH7.5, 150 mM Sodio cloruro, 1% desossicolato di sodio, 1% NP40). Prima dell'uso, tampone di lisi è stato integrato con inibitore della proteasi completa i mini cocktail ™ (Roche Diagnostics GmbH, Germania). I lisati proteici sono stati sottoposti a sonicazione utilizzando cellule Vibra ™ (Sonics Inc., USA) sonicatore. I lisati sono stati liquidati per centrifugazione e quantificate con Coomassie Plus Bradford saggio ™ reagente (Pierce Inc., USA) come da protocollo del produttore. La qualità delle proteine ​​è stata analizzata risolvendo 50 ug del lisato in sodio dodecil solfato poliacrilammide gel 10% (SDS) e successivamente visualizzati mediante colorazione con Coomassie Blu.
Plasma è stato ottenuto da 5 ml di sangue raccolti in presenza di 200 ml di 10% etilendiammina tetra acido acetico (EDTA). Il plasma isolati da campioni di sangue è stato centrifugato a 3000 g e conservato a -80 ° C in aliquote
Antibody Array
array di anticorpi personalizzati matrice Quantibody ™ (Numero di catalogo: QAA-CUST). Basati su un sistema ELISA multiplex per la misurazione quantitativa di proteine ​​più acquistati da Ray Biotech, Inc., Stati Uniti d'America è stato usato per studiare i livelli di espressione della proteina nei tessuti gastrici e campioni di plasma [22, 23]. I seguenti geni (CXCL5 /ENA-78, CXCL8 /IL8, CXCL10 /IP10, CXCL9 /MIG, CCL3 /MIP-1α, CCL15 /MIP-1δ, EpCAM, MMP3, SPP1 /OPN, TIMP1, Adipsin /CFD, CCL4 /MIP-1β, CCL20 /MIP-3α, PDGFR-B e IGFBP-3) è risultata essere sovraespresso nei tumori gastrici rispetto al PN e AN (con l'eccezione di CFD /Adipsin che è stato sovraespresso in PN relativi a tumori gastrici e AN) sono stati studiati per i loro livelli di proteine ​​nel tumore, corrispondenti PN e in una tessuti. Inoltre, i livelli plasmatici di queste proteine ​​nei pazienti che avevano subito OGDscopy sono stati stimati utilizzando lo stesso formato array (58 pazienti affetti da cancro gastrico, 6 con ulcera gastrica o duodenale benigna o gastrite e 12 con normale rapporto OGDscopy). In 8 pazienti affetti da cancro gastrico che avevano subito un intervento chirurgico radicale, campioni di pre e post-operatorio sono stati raccolti e analizzati.
Il test è stato eseguito come descritto dal protocollo del produttore. Brevemente, nel caso dei lisati tissutali 100 ug di lisato proteico è stata preparata diluendo la soluzione madre tessuto lisato utilizzando tampone diluente fornito dal fabbricante ad una concentrazione finale di 1 mg /ml. 100 ml di lisato diluito è stata incubata nella camera matrice per 2 ore. Nel caso dei campioni di plasma, il plasma è stato diluito con il tampone diluente fornito con il kit a un rapporto di 1: 1. 100 microlitri del campione di plasma diluito è stata incubata nella camera matrice per 2 ore. Per ogni esperimento array, gli standard in dotazione con il kit sono stati preparati come descritto dal protocollo di produttori e incluso insieme a un controllo di esempio tampone diluente (controllo negativo), che non aveva standard o campioni. Gli array sono stati trattati come descritto per il protocollo del produttore. I vetrini sono stati scansionati alla risoluzione di 5 μ e un PMT di 70 utilizzando Pro Scan ™ Array (Perkin Elmer Inc., USA). A queste impostazioni scanner i segnali dalla più alta concentrazione standard non ha raggiunto la saturazione. I dati sono stati analizzati utilizzando il Quantibody Q-Analyzer, un allineamento preciso, programma basato su Microsoft Excel, fornito con gli array personalizzati. Analisi statistica

la mediana e l'intervallo per i valori di plasma sono stati calcolati utilizzando il foglio di calcolo di Microsoft Excel ™ software (Microsoft, Inc.,). Mann Whitney U Test (http:... //Facoltà Vassar edu /Lowry /uTest html) è stato utilizzato per studiare il significato dei valori mediani di plasma e due test di coda è stato utilizzato per ottenere il p valore.
Risultati Aziende il clinico-patologici dettagli di tutti i pazienti, i cui campioni sono stati utilizzati per l'analisi di microarray e loro campioni di tumore, sono riportati nella File complementari 1 e 2. i dettagli clinico-patologici dei pazienti da quali campioni di sangue sono stati ottenuti per la stima dei livelli plasmatici di citochine /chemochine /fattori di crescita è dato in file aggiuntivi 3.
dei 24 pazienti i cui campioni tumorali sono stati utilizzati per lo studio di microarray, 16 erano di età superiore ai 45 anni di età e 8 erano 45 anni o meno; 18 erano maschi e 6 erano femmine; 5 erano tumori che derivano nella regione del cardias, 2 dal corpo e 17 da antro. Tutti i ventiquattro tumori erano adenocarcinomi con uno di loro che sono adenocarcinoma scarsamente differenziato con aree di funzioni neuro-endocrino. Tra gli adenocarcinomi, sottotipo intestinale è stato il più comune (n = 16), mentre il sottotipo diffuso è stato visto in 5 e mixato a 2. Grado tumori III predominavano (n = 20), con nessun tumore di grado I nella nostra serie. Diciassette dei 24 erano nodo positivo e 4 avevano metastasi a distanza al momento della presentazione.
In base alla classe di analisi di confronto (valore p = 0,001 differenza e 2 volte), abbiamo avuto 61 geni sovraespressi nel cancro, 66 in abbinato normale e 61 con ap il valore di < 1e-07 in apparentemente normale (File supplementare 4). Abbiamo usato Taqman quantificazione relativa RT-PCR per la convalida di alcuni dei geni identificati dall'analisi microarray. ACTB stato scelto come controllo endogeno, che era in aggiunta alle 18S controllare presente sulla carta TLDA.
Tutti i 49 campioni lavorato nel saggio TLDA ma 2 geni, C11orf42 e IGLL1 non hanno funzionato. HSPE che era stato trovato per avere espressione differenziale nei campioni nella nostra analisi microarray non hanno mostrato alcuna variazione nei livelli, nel test TLDA ed è stato incluso come controllo endogeno aggiuntivo. La normalizzazione è stato fatto utilizzando ACTB e HSPE come controlli endogeni. Dei 63 geni selezionati, esclusi i controlli endogeni (ACTB e HSPE) ei due geni che non avevano lavorato, abbiamo avuto 59 geni per ulteriori analisi.
Tre dei geni (REG4, CLDN18, MXRA5) era stato incluso per la convalida del loro potenziale come marker prognostico per il fallimento. Tuttavia, nell'intervallo tra il tempo che l'analisi microarray è stata completata e l'analisi RQ-RT-PCR è stato fatto (circa 3 mesi) c'erano aggiuntivi pazienti che recidiva e quindi i geni non sono state considerate per ulteriori analisi come marcatori prognostici. Tuttavia, essi sono stati inclusi per valutare se sono stati espressi in modo differenziale tra PN e tumori.
La lista dei geni che sono stati identificati per essere differenzialmente espressi nei tumori gastrici sono riportati nella tabella 1 e Tabella 2. Tabella 1 elenca i geni identificati per essere espressi in modo differenziale nel cancro gastrico per la prima volta e la Tabella 2, elenca i geni che sono stati noti per essere associati con il cancro gastrico, e trovato anche nel nostro studio. (File aggiuntivi 5 e 6 forniscono informazioni su questi geni ei corrispondenti riferimenti). Ci sono quattro diversi modelli di espressione genica - Modello 1 - sovraespresso in PN e tumori; Pattern 2 - sovraespresso in PN, ma downregulated nei tumori; Modello 3 - minime modificazioni della PN, ma sovraespresso in tumori e Pattern 4 - minime modificazioni della PN, ma downregulated a Tumori (Figura 1) .table 1 Geni segnalati per essere differenzialmente espressi per la prima volta nel cancro gastrico [riferimenti e dettagli in file aggiuntive 4]
SNO
GENE SIMBOLO
upregulation RILEVATE NELLE
RIFERIMENTO
1
CCL15 /MIP5 /MIP-1D /LKN1
NSCLC
[SF5-R1] 2
ASPN
cancro al seno
[SF5-R2]
3
MMP3
cancro colorettale
[SF5-R3] 4
SPON2
polmone, dell'ovaio, tumori della prostata
[SF5-R4]
[SF5-R5]
[SF5-R6]
5
PRSS22
cancro ovarico
[SF5-R7]
6
CCL3 /MIP 1A
orale SCC
[SF5-R8 ] 7
TMEPAI /PMEPAI
Neuro-endocrino tumori
[SF5-R9] Pagina 8
SIX3
9
MFNG
inibiti nel cancro cervicale
[SF5-R10] 10
SGNE1 /SCG5
tumori endocrini
11
SOSTDC1
inibiti in renale cancro
[SF5-R11]
12
SST
inibiti in adenocarcinoma esofageo
[SF5-R12]
13
IGHA1
14
AKR1B10
Aumento nell'epitelio di Barrett
[SF5-R13]
15
FCGBP
giù regolamentato in due punti ca
[SF5-R14]
16
ATP4B
17
NCAPH2
Tabella 2 geni noti per essere coinvolti in gastrica tumorigenesi cancro che, in questo studio [riferimenti e dettagli in file aggiuntive 5]
S NO
GENE SIMBOLO
SALITA O DISCESA rEGOLATO
RIFERIMENTO
1
CTSB
up-regolati soprattutto in cardia tumours
[SF6-R1]
2
SPARC/Osteonectin
Up-regulated
[SF6-R2]
3
COL1A1
Up-regulated
[SF5-R3]
4
COL1A2
Up-regulated
[SF5-R3]
5
COL4A1/Arresten
Up-regulated
[SF5-R4]
6
CXCL1/GRO1/MGSA
Up-regulated
[SF5-R5]
7
SPP1/osteopontin
Up-regulated
[SF5-R6]
8
CXCL9/MIG
Up-regulated
[SF5-R7]
9
IL8/CXCL8
Up-regulated
[SF5-R8]
10
TIMP1
Up-regulated
[SF5-R9]
11
LUM/SLRR2D/LDC
Up-regulated
[SF5-R10]
12
CXCL5/ENA78
Up-regulated
[SF5-R11]
13
CXCL10/INP10/IP10
Up-regulated
[SF5-R4]
14
CEACAM6
Up-regulated
[SF5-R12]
15
REGIV
Up-regulated
[SF5-R13]
16
S100A10/ANX2L/CAL1L
Up-regulated
[SF5-R14]
17
SERPINH1/HSP47/CBP1
Up-regulated
[SF5-R15]
18
CDH3
Up-regulated
[SF5-R16
19
TACSTD1/EPCAM/CD326
Up-regulated
[SF5-R17]
20
IFITM1/LEU13
Up-regulated
[SF5-R18]
21
CTHRC1
Up-regulated
[SF5-R19]
22
SULF1
Up-regulated
[SF5-R20]
23
RNASE1
Down-regulated
[SF5-R21]
24
PGC
Down-regulated
[SF5-R22]
25
PGA5
Down-regulated
[SF5-R22]
26
GIF
Down-regulated
[SF5-R23]
27
LTF
Down-regulated
[SF5-R24]
28
TFF1
Down-regulated
[SF5-R25]
29
CLDN18
Down-regulated
[SF5-R26]
30
CFD/Adipsin
Secreted da cellule ca gastrico lines
[SF5-R27]
31
GHRL/Obestatin
Down-regulated
[SF5-R28]
32
LIPF
Down-regulated
[SF5-R29]
33
ANXA10
Down-regulated
[SF5-R30]
Figura 1 Valori RQ di normali accoppiati (PN) (n = 20) e tumorali (n = 24), utilizzando apparentemente normale (AN) (n = 5) come calibratore. La variazione piega è relativo ai apparentemente normali.
Abbiamo poi proceduto per confermare l'espressione della proteina per alcuni dei geni nel AN (n = 4), PN (n = 9) e tumori (n = 9). Abbiamo usato l'array Quantibody, che si basa sul principio sandwich ELISA per determinare i livelli di proteina di 15 citochine, chemochine e fattori di crescita [22, 23]. I valori mediani e la gamma dei livelli sono riportati nella Tabella 3. CFD /Adipsin livelli mediani sono stati trovati ad essere più bassa nei tumori rispetto ai livelli di PN e AN (p = 0,0324), mentre CXCL5 /ENA78, CCL20 /MIP 3α, IGFBP3, SPP1 /OPN e TIMP1 sono stati aumentati in PN e tumori rispetto a un, con livelli più elevati osservati nei tumori. Al contrario, EpCAM, IL8, CXCL10 /IP10, CCL3 /MIP-1α, CCL4 /MIP-1β, CCL15 /MIP-1δ, PDGFR-B sono stati prevalentemente elevata nei tumori rispetto ad una e PN. EpCAM (p = 0,0001), IL8 (p = 0,0003), MIP-1β (p = 0,0026), MIP-3α (p = 0,039) e TIMP1 (p = 0,0017), i livelli erano significativamente differenti (Mann Whitney U test) tra tumori rispetto a un & PN. Inoltre, EpCAM (p = 0,0004), IL8 (p = 0,0015) e MIP-1β (p = 0,0061) erano significativamente elevati nei tumori rispetto ai loro corrispondenti PN.Table 3 valori mediani di citochine e chemochine in una, lisati PN e tumorali

AN
AN
PN

PN
TUMORE
TUMORE

mediana in pg /ml
Gamma in pg /ml
mediana in pg /ml
Gamma in pg /ml
mediana in pg /ml
Gamma in pg /ml
CFD /Adipsin
27.295,0 22.097,9-31759,9

27.162,9
19.515,1-38.224,3 13.021,0
*
9441,5-36873,1
CXCL5 /ENA-78
283,8
39,3-4206,1
2.922,7
84,9-31628,7
3.978,0
723,9-40669,6
EpCAM
1.466,0
905,7-2266,6
2.243,5
915-8885,8
18.717,6 *** /## #
8.966,1-34.529
IGFBP-3
3.149,8
124,0-17530,2
12.286,0
134,6-34036,3
17.662,7
196,9-55671,5
IL-8 /CXCL8
22.1
0-62,3
53.1
27,4-190,6
1.240,4 *** /###
93,1-3660,7
CXCL10 /IP-10
20.4
1,4-146,1
147,0
0,8-3940,9
384,4
0,7-1643,1
CXCL9 /MIG
369,5
0-8569,7
4.336,1 1.077,2
- 19.396,6 7.540,3

727,7-73975,9
CCL3 /MIP-1α
0.0
0-187,4
203,6
0-1177,2
359.0
0-3.231,5
CCL4 /MIP-1β
49,5
0-261,8
94,3
0-335,8
578,6 ** /#
28,7-1185,2
CCL15 /MIP-1δ
86.0
54-157,3
169,3
51,7-748,9
374,3
63,4-2825,4
CCL20 /MIP-3α
859,3
76,1-1.784,8
3.049,6
893-16262,9
4.773,4 *
1014,4-13280,7
MMP-3
269,0
0-648,6
143,9
0-353,1
0.0
0-2908,2
SPP1 /OPN
447,0
9,1-896,3
2.054,0
193,6-3183,7
1.407,1
12,6-5.819,2
PDGF RB
222,3
174,3-521,4
295,3
184,9-1079,3
578,6
123,7-1516,8
TIMP-1
9.676,2
4373,3-17133,2
27.022,2 17.028,3
- 194.387,8 139.365,6
**
48.146,4-367.203,2
AN - apparentemente normale; PN - Viene
normale valore di p significativo per AN + PN contro Tumori -
* - < 0,05; ** - ≪ 0,005; *** - ≪ 0,0005 da Mann Whitney U test di
valore p significativo per PN contro Tumori -
# - < 0,01; ## - ≪ 0,005; ### - ≪ 0,0005 da Mann Whitney U test di
I livelli plasmatici di citochine /chemochine /fattori di crescita 15 sono stati stimati utilizzando la matrice Quantibody. I 18 casi non maligne (12 con nessuna anomalia rilevata da OGDscopy e 6 con patologia benigna nello stomaco) sono stati bastonati insieme ei valori mediani sono stati confrontati tra i tumori e il gruppo non-maligne. test di Mann Whitney U è stata effettuata per valutare la significatività statistica (due test di code). IL8, CXCL9 /MIG, CCL3 /MIP-1α, CCL20 /MIP-3α, PDGFR-B e plasma TIMP1 livelli erano significativamente differenti tra il gruppo non-maligne e il gruppo di cancro gastrico (Tabella 4). SPP1 livello /OPN sono stati anche maggiore nei pazienti affetti da cancro gastrico rispetto al gruppo non-maligne, ma era borderline significativa (p = 0,05). I livelli post-chirurgici di EpCAM, IGFBP3, IL8, CXCL10 /IP10, CXCL9 /MIG, CCL3 /MIP-1α, CCL20 /MIP-3α, SPP1 /OPN e PDGFR-B hanno mostrato un calo uniforme in tutte le 8 campioni studiati. In TIMP1 contrario, i livelli di CCL15 /MIP-1δ e CFD /Adipsin realtà aumentata nel periodo post-operatorio nella maggior parte dei campioni (Figura 2) .table 4 valori mediani di citochine e chemochine nel plasma di pazienti non-maligne rispetto a plasma da i pazienti con carcinomi gastrici

mediano per non maligno (n = 18) (in pg /ml)
GAMMA (in pg /ml)
mediano per i tumori (n = 58) (in pg /ml)
GAMMA (in pg /ml)
CFD /Adipsin
71.520,0
58.000,8-77.527,9 69.236,4

27.926,9-95255,7
CXCL5 /ENA-78
1.100,6
0-7203,2
1.702,8
0-11588,5
EpCAM
1.789,8
0-13627,3
3.527,1
0-35009,2
IGFBP-3
119.467,1
20.164,6-174.498
110.395,1
0-979359,6
IL-8 /CXCL8
22.5
0-69,9
48,9 *
0-396,3
CXCL10 /IP-10
670,2
0-3328,9
931,1
0-5158,9
CXCL9 /MIG
6.069,2
0-18739,7
7.561,8 *
505-6 - 86999
CCL3 /MIP-1α
1.464,8
0 - 10.602,2 2.335,1
*
0-32.199
CCL4 /MIP-1β
43,0
0-440,1
127,9
0-2138,5
CCL15 /MIP-1δ
6.628,8
1237,8-13.178,1 5.577,9

696,3-11054,4
CCL20 /MIP-3α
139,9
0-1994,1
654,6 #
0-12013,1
MMP-3
10.966,2
3891,2-38.928,9 13.680,1

1358,7-80588,8
SPP1 /OPN
4.621,5
0-20518,1
8.680,5
0-110.373,2
PDGF RB
1.391,5
0-5461,8
2.300,5 *
0-34754,4
TIMP-1
31.048,9
15.603,8-220.729,6
98.054,6 #
6.252,5 - 463.941
# - valore di p < 0,01; * - Valore di p < 0.05 da Mann Whitney U test di
Figura 2 Pre (1) e post-operatoria (2) i livelli plasmatici delle citochine /chemochine /fattori di crescita nei tumori gastrici (n = 8). I livelli plasmatici sono stati misurati utilizzando la matrice Quantibody, che utilizza il principio di ELISA a sandwich in un formato multiplex. I dettagli per la stima dei livelli sono forniti nella sezione Metodi.
I livelli plasmatici di citochine /chemochine /fattori di crescita sono stati poi correlati con le caratteristiche clinico-patologici. 28 dei 58 pazienti affetti da cancro gastrico avevano subito un intervento chirurgico potenzialmente curativo radicale (R0 resezione) e 6 pazienti sono stati sottoposti a resezione solo R1. Questi 34 campioni patologici erano disponibili per le correlazioni patologiche (PT, pN, pStage, diffusione perilinfonodale emboli linfatica emboli vascolare), mentre l'analisi della sopravvivenza è stato fatto su 28 pazienti che avevano subito una resezione R0. Dieci pazienti sono stati sottoposti procedure chirurgiche palliative mentre 13 pazienti hanno declinato un intervento chirurgico o erano inadatto a qualsiasi intervento diverso da terapia di supporto. Un paziente ha avuto un cancro indifferenziata, che da studi di immunoistochimica supplementari è risultato essere un linfoma gastrico primaria, diffuso a grandi cellule B di tipo. I livelli plasmatici di MMP3 dove maggiore nei maschi rispetto alle femmine (valore mediano 16.772,1 pg /mL rispetto a 8.512,5 pg /ml) (valore p = 0.011);

• Correlazione tra HER-2 /neu (2-erbB) livello di espressione e l'effetto terapeutico del trattamento di combinazione con Herceptin e agenti chemioterapici in linee cellulari di cancro gastrico
• Studio di fase I chemioradioterapia neoadiuvante con S-1 più cisplatino bisettimanale per i pazienti affetti da cancro gastrico avanzato con metastasi linfonodali: -KOGC04-