PLoS ONE: Экстра-пищеводного Пепсин от Желудок рефлюксата продвигаемых миндалин Гипертрофия

Абстрактный

Фон
<р> Гастроэзофагеальная рефлюксная связано с многочисленными патологическими условиями верхнего дыхательного и пищеварительного тракта. Желудочный пепсин в рефлюкса способствует иммунологических реакций в миндалины. В данном исследовании мы стремились найти отношения между пепсина и гипертрофии миндалин.

Методы и найти
<р> Мы исследовали понятие было ли гипертрофии миндалин из-за пепсина-опосредованной желудочного рефлюкса в миндалин гипертрофии. Пятьдесят четыре ребенка с миндалин гипертрофии и 30 взрослых с ангиной были набраны до хирургического лечения. Кровь и миндалин ткани от каждого пациента были собраны для анализа изменений в лимфоцитах и ​​макрофагами числа связанных с гистологическим и биохимического анализа. Была выражена Пепсин на различных уровнях в тканях миндалин от каждого гипертрофии миндалин. Пепсина-позитивные клетки были обнаружены в крипты эпителия, окружающих лимфоидных фолликул с развивающимися фиброзом, а также окружающих лимфоидную фолликула, которая стояла перед склеп. А также, пепсин окрашивание хорошо коррелируют с поврежденной миндалин эпителием и TGF- 1 и выражение INOS в разделе миндалин. Кроме того, пепсин и TGF- 1-позитивные клетки были совместно локализованы с CD68-положительных клеток в крипты и окружающих зародышевых центров. По сравнению с макрофагами отзывчивость к пепсина, одноядерные клетки периферической крови (PBMNCs) были заметно больше в присутствии активированного пепсина в детской группе. Кроме того, CD11c и CD163-позитивных клеток была значительно увеличена с помощью активированного пепсина. Тем не менее, это не было видно для культуры PBMNCs из взрослой группы.

Выводы
<р> Лимфоциты и моноциты находятся в весьма пролиферативного состояния в гипертрофии миндалин и связано с повышенной экспрессией про -inflammatory факторы, в результате воздействия желудка рефлюксной пепсина
<р> Образец цитирования: Ким. JH, Jeong HS, Ким К., Ли YJ, Юнг MH, Парк JJ, и др. (2016 г.) Экстра-пищеводного Пепсин от Желудок рефлюксата продвигаемых миндалин гипертрофия. PLoS ONE 11 (4): e0152336. DOI: 10.1371 /journal.pone.0152336
<р> Редактор: Гернот Zissel, Universitätsklinikum Фрайбург, Германия
<р> Поступило: 5 октября 2015 года; Принято: 11 марта 2016 г. Опубликовано: 8 апреля 2016
<р> Copyright: © 2016 г. Ким и др. Это статья открытого доступа распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник приписывают наличие
<р> Data:. Все соответствующие данные находятся в пределах своих подтверждающей информации, файлов бумаги и
<р> Финансирование:. Это исследование было поддержано программой исследований фундаментальной науки, через Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF), при финансовой поддержке Министерства науки, информационные технологии, и будущего планирования (2013R1A1A1012542). Это исследование было также поддержано ведущими зарубежными научно-исследовательского института Программы вербовкой, через Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF), финансируемой Министерством образования, науки и техники (МОНТ) (2012K1A4A3053142)). Эта работа была поддержана biomedcal исследовательским институтом фонда (GNUHBIF-2014-0009) из Национального госпиталя Кёнсан университета. Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> миндалин гипертрофия в настоящее время является наиболее распространенной причиной для тонзиллэктомии. Увеличение миндалин происходит за счет абсолютного увеличения общего количества лимфоцитов в ткани и приводит к увеличению объема ткани. [1, 2] Точный механизм, с помощью которого лимфоцит стимуляция пролиферации и происходит еще предстоит определить. Сделан вывод, что антигенный стимуляция лимфоцитов ткани приводит к увеличению числа лимфоцитов и активности. Предыдущие попытки выявления патофизиологических механизмов были сосредоточены на микробиологических и иммунологических изменений в увеличенных миндалин. Во многих исследованиях сообщалось о возможной роли бактериальных организмов в патогенезе миндалин гипертрофией. [3-5] Однако увеличение абсолютного количества лимфоцитов в пределах миндалин без клинической инфекции как было показано ранее [2], а также специфические антигены отвечают за эти изменения не были идентифицированы.
<р> Недавнее исследование посмотрел на отношения между extraesophageal рефлюксной болезни и верхних заболеваний дыхательных путей. Хронический синусит [6], средний отит с выпотом [7-9] и расстройства гортани все были изучены с возможными этиологической связи с extraesophageal рефлюкс. [10, 11] рефлюксата содержит желудочные ферменты (пепсин и HCl), а также дуодено-панкреатический ферменты (желчные кислоты и трипсин). Роль пепсина в желудочном соке как часть рефлюксата и взаимодействия с системами отоларингологии и в ЛОР-органов (ухо, нос и горло) была тщательно изучена. [1, 10, 11]
<р> Пепсин является фермент преобразован из пепсиногена, который производится главным клетки желудка, и играет важную роль в пищеварении. Как правило, пепсин встречается только в содержимом желудка. Тем не менее, если происходит extraesophageal рефлюкс, содержимое желудка от рефлюкса может достигать гортаноглотки, и пепсин как часть рефлюкса желудка могут быть обнаружены в области гортаноглотки. Это действительно так, как Джонстон и др. [12] сообщили, что пепсин была обнаружена в верхней слизистой оболочки дыхательных путей и индуцирует провоспалительных цитокинов цикл, что приводит к воспалительным повреждением гортани слизистой оболочки. Эти данные предложили роль кипятили пепсина в пробое механизма иммунной защиты в слизистой оболочке или эпителиальных накладок и продвижение воспалительных возбудителей. [12-15]
<р> Аналогично для миндалин, мы предположили, что в желудке пепсин в рефлюкс ключевую роль в ее иммунологической реакции миндалины и что воздействие пепсина индуцирует миндалины гипертрофию. В данном исследовании мы стремились найти связь между желудочном пепсина и гипертрофии миндалин.

Материалы и методы

Этика заявление
<р> Это исследование было одобрено Национальной больнице Кёнсан университета Совет Institutional Review (# GNUHIRB-2014-02-006). Письменное информированное согласие было получено от всех пациентов (или родителей) до их включения в исследование.

Испытуемых
<р> Это исследование было проведено на 84 больных с клиническим диагнозом гипертрофии миндалин. Они посещают нашу клинику для удаления миндалин, потому что они страдают от хронического воспаления в миндалинах или храпа /апноэ во время сна из-за увеличения миндалин. Все пациенты прошли медицинский осмотр, чтобы подтвердить диагноз гипертрофии миндалин или хронического тонзиллита. Средний размер миндалины был класс 2.5 в миндалине гипертрофии группы и степень 1,0 при хроническом тонзиллите группе. (Таблица 1). Мы получили ткани миндалин от 54 детей до их хирургического лечения (41 мальчиков и 13 девочек; возрастная группа 4-16 лет, средний возраст 8 лет) и от 30 взрослых (17 мужчин и 13 женщин, возрастной диапазон 17 лет и старше, значит, возраст 29 лет). У пациентов с системными заболеваниями и другими клиническими проблемами, не были включены в данное исследование. Всего тонзиллэктомии проводили под общим наркозом с использованием метода рассечение и уступает часть миндалины была выбрана для взятия проб тканей. Ни один не имел каких-либо осложнений в послеоперационном периоде

белковый препарат и анализ иммуноблот
<р> Тканевые экстракты из миндалин были приготовлены следующим образом:. Миндалины были удалены, и гомогенизируют в буфере для лизиса из PBS (рН 7,4), 1 % Тритон Х-100, 1 мМ ЭДТА, содержащем 10 мкМ лейпептин и 200 мкМ фенилметилсульфонилфторида. Лизаты обрабатывали ультразвуком в несколько раз в течение 3-х до 5 мин каждый и центрифугировали со скоростью 12000 оборотов в минуту в течение 20 мин при температуре 4 ° С. Супернатанты собирали и концентрацию белка каждого лизата определяли с использованием бицинхониновой кислоты (ВСА) для анализа белка комплект (Pierce, Rockford IL, USA) в соответствии с протоколом производителя. Бычий сывороточный альбумин был использован в качестве стандарта. Равные количества белка (50 мкг) наносили на полиакриламидный гель 10% додецилсульфата натрия (SDS). После электрофореза белки в геле переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Schleicher &Amp; Schuell, Дассель, Германия). Мембраны блокировали 5% обезжиренным молоком в Трис-буферном солевом растворе, содержащем 0,1% Tween-20. Пятна зондировали первичными антителами к поликлональной анти-пепсина А (SC-99081, Santa Cruz Biotechnology Калифорния, США) при 4 ° С в течение ночи. В качестве контроля нагрузки, блоты повторно зондировали с использованием анти-β-актин антитела (Sigma, St. Louis MO, USA). Первичные антитела визуализировали с использованием вторичных антител (конъюгированного с пероксидазой хрена козьих антител против кроличьего IgG, 1: 10000; Pierce) с комплектом ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, США)

Иммуногистохимия
. <р> Иммунологическое проводили на толстых корональных секций 5-мм параформальдегида фиксированных и залитых парафином секций с использованием авидин-биотинилированные-пероксидаза хрена-комплекс наборы (ABC, Vector Laboratories, Burlingame CA, USA). После депарафинизации в ксилоле, срезы регидратации с этанолом. После промывки в PBS, срезы блокировали 1% нормальной козьей сыворотки, а затем обрабатывали анти-пепсина А (SC-99081, Santa Cruz), иОАС, TGF-β1 и CD68 антитела приобрели от Santa Cruz Biotechnology при 4 ° с в течение ночи во влажной камере. После промывания в PBS, их инкубировали в течение 90 мин при комнатной температуре с вторичным антителом (Santa Cruz Biotechnology, биотин-конъюгированные анти-кроличьим иммуноглобулином G, 1: 200). И, наконец, срезы инкубируют с ABC в течение 60 мин при комнатной температуре, промывали в PBS, а затем разработаны с 0,027% 3,3'-диаминобензидина тетрагидрохлорид (Sigma) с 0,003% перекиси водорода. Срезы подвергали контрастному окрашиванию гематоксилином (Sigma).

Двойной иммунофлюоресценции окрашивание
<р> Чтобы охарактеризовать пепсина А-позитивных клеток, двойной иммунофлуоресценции проводили на тканях миндалин. Депарафинирование и поиска антигена были выполнены. Неспецифическое связывание антитела блокировали в PBS с 0,1% нормальной сыворотки осла (Vector Laboratories) и 0,3% Тритон Х-100 (Sigma) в течение 45 мин. Затем срезы инкубировали с анти-пепсина А антитела (1: 100; SC-99081, Санта Круз), разведенного в PBS, содержащем 0,1% бычьего сывороточного альбумина (Sigma) при 4 ° С в течение ночи. После промывки, осел Су3-конъюгированные антитела против кроличьего IgG вторичного антитела (1: 100; EMD Millipore, Биллерика Массачусетс, США) наносили в течение 1 часа при комнатной температуре. Для получения двойной маркировки, после блокирования в PBS, содержащем 10% нормальной сывороткой козы и 0,3% Тритон Х-100, срезы инкубировали с анти-CD68 (1: 100; Santa Cruz) при 4 ° С в течение ночи. Alexa488-конъюгированные антитела против мышиного IgG вторичного антитела (1: 100; Invitrogen, Carlsbad CA, USA) затем прикладывают в течение 1 часа при комнатной температуре. Срезы были установлены с анти-выцветанию раствор, содержащий 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (Vector Laboratories), и наблюдали под флуоресцентным микроскопом (Carl Zeiss Микроскопия GmbH, Jena, Германия). Для того, чтобы охарактеризовать CD68-позитивных клеток, двойной иммунофлуоресценции осуществляли, как описано выше. Для получения двойной маркировки, анти-TGF- 1 (1: 100; Santa Cruz) и анти-иСОА (1: 100; Santa Cruz) были применены, а затем осел Су3-конъюгированные антитела против кроличьего IgG вторичного антитела (1: 100; EMD Millipore ) на CD68 окрашенных участках.

с обратной транскрипцией полимеразной цепной реакции (RT-PCR)
<р> Суммарную РНК экстрагировали из тканей миндалин с использованием метода TRIzol в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем ( Gibco, Гранд-Айленд, Нью-Йорк). Равные количества (5 мкг) ДНК-РНК, свободной общей из каждого образца были преобразованы в кДНК с использованием 200 ЕД SuperScript II RT (GIBCO, Grand Island, NY) в объеме реакционной смеси 20 мкл. Обратную транскрипцию проводили при 22 ° С в течение 10 мин, при 42 ° С в течение 45 мин, а при 95 ° С в течение 5 мин. Продукты реакции (2,0 мкл) подвергали ПЦР-амплификации (Promega, Madison, WI, USA) в объеме реакционной смеси 50 мкл. Каждый праймер последовательности были следующими: IL-1 (189 п.о.), 5'-TCATTGCTCAAGTGTCTGAAGC-3 '(смысловой) и 5'-TGGTCGGAGATTCGTAGC-3' (антисмысловой); IL-6 (628 п.н.), 5'-ATGAACTCCTTCTCCACAAGCGC-3 '(смысловой) и 5'-GAAGAGCCCTCAGGCTGGACTG-3' (антисмысловой); ФНО-β (443 п.н.), 5'-AGTGACAAGCCTGTAGCCC-3 '(смысловой) и 5'-GCAATGATCCCAAAGTAGACC-3' (антисмысловой). ПЦР проводили с использованием термоциклеру BioRad в соответствии с инструкциями изготовителя. Равные объемы продуктов амплификации анализировали с помощью 1,5% электрофореза в агарозном геле с 0,5 мг /мл окрашивания бромистым этидием.

Цитометрический анализ и в пробирке
культивирование
<р> Все образцы крови были обработаны в течение 2-х часов после взятия крови. Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMNCs) выделяли путем центрифугирования в градиенте плотности над градиентом Ficoll (Sigma, St. Louis MO, USA) в течение 25 мин при 2300 оборотах в минуту и ​​промывали три раза в PBS. PBMNCs при 1 × 10 5 Затем клетки анализировали с помощью проточной цитометрии. Является ли пепсин участвует в моноцитов к макрофагальной дифференцировки, а остальные клетки высевали на чашки для культивирования в присутствии /или отсутствии активированного пепсина (Thermo Scientific, Рокфорд Иллинойс, США), содержащей условия моноцитов культуры. Для того, чтобы определить уровень макрофагальной населения, через 8 и 15 дней, клетки собирали и анализировали с помощью проточной цитометрии с использованием антитела к CD11c и CD163. Все клеточные культуры поддерживали при 37 ° С с 5% СО <суб> 2 в увлажненной атмосфере.

Жизнеспособность клеток
<р> RAW264.7 клетки, мышь микрофагоподобных клеточная линия, культивировались исследовать влияние пепсина на пролиферацию макрофагов. Клетки обрабатывали в различной концентрации пепсина (0,01-5 мкг /мл) и жизнеспособность клеток исследовали с помощью ССК-8 комплект (Cell Counting Kit-8, Dojindo Молекулярный Tech. Inc., Роквилл, Мэриленд, США). Жизнеспособность клеток в каждой концентрации была представлена ​​в виде кратного изменения. Эти складчатые изменения рассчитываются как отношение конечного значения в каждом присутствии пепсина к значению в отсутствие пепсина (устанавливается как "1"). Значения представлены как среднее ± SEM. * P
&л; 0,05 по сравнению с соответствующим отсутствие пепсина (0 мкг /мл).

В пробирке
анализа миграции
<р> стандартный монослой царапина модель рана была использована для характеристики отклика макрофаги пепсина. RAW264.7 клетки высевали в 6-луночные планшеты для тканевых культур, культивируемых до слияния, и монослои ранеными царапанием по поверхности тканевой культуры пластика с лезвием бритвы. Лопатка была нажата вниз в середине тарелки, тем самым сокращая клеточный слой и одновременно маркировка "намотана границу" на нижележащей пластмассы. Затем лезвие осторожно скользнул однонаправленно, чтобы удалить половину слоя сливающийся клеток. «Раненый монослой" дважды промывали фосфатно-солевого буферного раствора, рН 7,4 (PBS) подпитывали 1 мМ митомицина содержащих сыворотку лишенный среды, и инкубировали в стандартных условиях культивирования в течение 24 ч.

Статистические анализ
<р> Все данные представлены в виде среднего значения ± SEM Сравнения между группами были проанализированы с помощью двухвостый т
тест. значения вероятности ( P
) &Лт; 0,05 считались значимыми.

Результаты

Пепсин выразилось в миндалин
<р> данные иммуноблот показал, что было выражено пепсин белок в виде одной полосы из экстрактов как миндалин больных с миндалин гипертрофии. Пепсин была высоко выражена в виде нескольких полос в положительном контроле экстрактов тканей желудка. Практически не пепсин окрашивание не наблюдалось и в других тканях, включая опухоли, лимфатического узла (LN), щитовидной железы (ТНУ), околоушной слюнной железы (околоушной г.), Слюнные железы (SG) (Фиг.1А). Все миндалин ткани демонстрировали позитивный сигнал для пепсина (фиг.1В). Тем не менее, уровень обнаружения пепсина в миндалине немного отличались у каждого пациента (фиг.1В). Иммуногистохимическое окрашивание проводили для выявления пепсин-позитивных клеток в миндалинах ткани. Пепсина-позитивные клетки выборочно приведены ниже поверхностного эпителия, в основном расположены в крипте (рис 1С-а и б), окружающих более негативных зародышевых центров (рис 1C-C и D), а также окружающих лимфоидную фолликул с чрезмерным развитии фиброза (рис 1C-е и е). Желудочные секции, используемые в качестве положительного контроля показал типичный образец пепсина окрашивания, преимущественно в железистые клетки (рис 2D-а), но не в лимфатических узлах (рис 1D-б) и щитовидной железы (рис 1D-с).

пепсина-позитивные клетки были обнаружены в поврежденном миндалин эпителий
<р>, чтобы подтвердить связь с миндалин плоскоклеточного повреждения эпителия и обратным холодильником, мы пытались найти пепсина-позитивных клеток в поврежденной или неповрежденной миндалин эпителиальные архитектура. Поврежденный эпителий, нерегулярным или сломана, были обнаружены в тканях миндалин с гипертрофией миндалин (рис 2А и 2D, ниже). Пепсин-позитивные клетки были обнаружены в поврежденных участках (правая вставка на фиг.2A, 2D, 2E и 2F) по сравнению с нормальным эпителием (левая вставка на рис 2А и 2В). В частности, сигналы были сильно обнаружены вокруг расщелин и поврежденные миндалины эпителием (пунктирные линии на рис 2C и 2E).

TGF- 1 и иОАС-позитивные клетки были обнаружены в миндалине больных с миндалин гипертрофии
<р> иммуногистохимическое окрашивание на TGF- 1 и иСОА было проведено с целью изучения взаимосвязи между пепсина окрашивания и воспаления. Оба TGF- 1 и иОАС-положительные сигналы, были также обнаружены в регионах по аналогии с пепсином окрашиванию, например, в крипты эпителий (фиг 3А и 3В), окружающих зародышевых центров (фиг.3С и 3D), и окружающие лимфоидную фолликул с чрезмерным развивается фиброз (рис 3E и 3F).

Пепсин и TGF-β1 были обнаружены в CD68-положительных клеток в миндалине гипертрофии ткани
<р> Как описано во введении, мы предположили, что пепсин окрашивание в миндалины берет свое начало из желудка и может быть связано с миндалины воспаление. Двойной иммунофлуоресценции окрашивание на CD68 проводили, чтобы охарактеризовать пепсин-позитивных клеток. CD68 является 110-Kd трансмембранный гликопротеин и представитель маркером человеческих моноцитов и тканевых макрофагов, участвующих в воспалении. CD68-позитивные клетки были четко наблюдались в миндалине с миндалин гипертрофии (рис 4). Следует отметить, что CD68-позитивные клетки сильно локализуется с пепсина и TGF-β1-позитивных клеток как в склепе (рис 4А) и окружающих зародышевых центров (рис 4б). В отличие от колокализации пепсина и CD68, пепсин не совместно локализуется с В-лимфоцитов (CD20-положительных) в фолликулярной центрах и Т-лимфоцитов (CD45) в межфолликулярного областях (рис 4в). Эти данные, а также, что показано на рис 3 предположил, что пепсин окрашивание может быть связано с воспалительными реакциями в миндалине больных с миндалин гипертрофии. А также, чтобы выявить основной механизм травмы миндалин воспалительными медиаторами, опосредованных белыми клетками, включая PBMNCs и макрофаги, уровни для миндалин IL-6, IL-1β и ФНО-α мРНК были исследованы с помощью RT-PCR (рис 4D). Интересно, что все они были выражены в тканях миндалин с гипертрофией миндалин. Эти данные показывают, что основным механизмом гипертрофии миндалин может быть вызвана воспалительными медиаторами.

Пепсин вытеснили пациентов, полученных моноциты дифференцируются в макрофаги
<р> Чтобы подтвердить отношение пепсина окрашивания и макрофагов, мы культивировали одноядерные клетки периферической крови (PBMNCs) из миндалин гипертрофических пациентов в макрофагальной культуральной среде (в присутствии или в отсутствие активированного пепсина) в течение 15 дней. Кроме того, мы установили уровни моноцитов популяции, и проанализированы макрофагального фенотипа с помощью проточной цитометрии. Макрофагах человека получают путем дифференцировки моноцитов в тканях. Они играют важную роль в неспецифической защиты (врожденный иммунитет), а также помочь инициировать конкретные механизмы защиты (адаптивный иммунитет) путем набора других иммунных клеток, таких как лимфоциты. Они могут быть идентифицированы с использованием проточной цитометрии их специфической экспрессии белков в качестве маркеров, включая CD CD11c и CD163. Популяция моноцитов, выведенных из стороны потока и рассеяния вперед (фиг.5А) была значительно увеличена в присутствии активированного пепсина (aPepsin), по сравнению с отсутствием увеличения на 8-й день, и не происходит значительного увеличения на 15-й день (фиг.5В). Кроме того, мы исследовали моноцитов к макрофагальной дифференцировки с использованием CD11c и CD163 антитела. В CD11c и CD163-положительные клетки были значительно увеличены по aPepsin на 8-й день после культивирования. Никакого значения не было найдено в других условиях (рис 5в). Тем не менее, население моноцитов не было статистически значимым, а также уровни для CD11c и CD163 в группе взрослых как на 8-й день и 15. Эти данные показывают, что пепсин потенциально участвует в дифференциации макрофагов и детей с повышенным обратным холодильником в желудке может быть в большей степени подвержены эффекты среда пепсин, чем у взрослых.

пепсин индуцированное жизнеспособность макрофагов и миграция
<р> Мы также исследовали, был ли пепсин участвует в функции макрофагов. RAW264.7 клетки культивировали в присутствии или в отсутствии активированного пепсина в течение 24 часов. Был значительное дозозависимое увеличение жизнеспособности клеток RAW264.7 пепсином (Фиг.6А). Миграция клеток RAW264.7 также индуцируется пепсина в скрэтч ране и Transwell миграция системы анализа (фиг.6В и 6С).

Обсуждение
<р> Это исследование впервые показали, что пепсин был обнаружен в гипертрофический миндалин и пепсина-позитивные клетки были локализованы в крипты эпителия окружающих зародышевых центров, а также в лимфоидных фолликул с чрезмерной развивающейся фиброзной внешний вид. Следует отметить, что пепсин окрашивание коррелирует с экспрессией факторов связанных с воспалением, и пепсин и CD68 локализуется, и активированный пепсин привело к дифференциации моноцитов в макрофаги. [16] Эти результаты указывают на потенциально новых патофизиологических механизмов, лежащих в гипертрофии миндалин.
<р> Интенсивные воспаление является известным фактором риска для миндалин гипертрофии. [17] TGF-β1 и иОАС известны медиаторов воспаления. [18-20] в гипертрофированных миндалин, увеличение отсчетов Т и в клеток показали положительную корреляцию с бактериальным графов и размер миндалин. [21, 22] в эпидемиологических исследованиях, курения, аллергии и рецидивирующих инфекций дыхательных путей может связать с переходным или постоянным гипертрофии лимфоидной ткани. [22, 23] иммунологические параметры, генетическая предрасположенность и локальная дисфункция лимфоцит-видимому, играют роль в этиологии рецидивирующего тонзиллита и гипертрофии миндалин. [22, 24] Некоторые исследования показали, что гипертрофии миндалин был связан с увеличенным размером лимфоидных фолликул, но не количество фолликулов [25] и было также связано с увеличением веса миндалин, увеличение фолликула диаметр, площадь и число. [26]
<р> Повторяющиеся раздражители патогенными агентами, в ходе воспалительного процесса, приводит к активации моноцитов и макрофагов. [27] цитокины, секретируемые макрофагами стимулируют клетки иммунной системы, а также вызывают пролиферацию эндотелиальных клеток и фибробластов. [28] со временем, иммунологически активная ткань заменяется фиброзной ткани. [28] в этом исследовании мы предположили, что антиген пепсина и мы выдвинули две гипотезы для объяснения наблюдения гипертрофии миндалин с желудочного рефлюкса (рис 7). Одним из механизмов может быть прямой стимуляции лимфоцитов под действием пепсина из рефлюксата, которые признаны как антигенные. Другой возможный механизм включает в себя пепсин индуцированное повреждения эпителия миндалин крипт, что приводит к cryptitis от резидентных бактерий с постоянной антигенной стимуляции специализированного крипты эпителия. Это приведет к увеличению числа лимфоцитов и может играть определенную роль в гипертрофии миндалин.
<Р> Первоначально пепсин вступает в контакт с эпителием и представляется интраэпителиальной лимфоциты, подэпителиальная лимфоциты, интерфолликулярной и intrafollicular лимфоциты , в этой последовательности. Лимфоциты затем пролиферируют в ответ на действия пепсина в качестве антигена, в результате чего миндалин фолликулы, чтобы увеличить и ткани миндалин пройти гипертрофию. В качестве альтернативы, макрофаги миндалине-тканевые признают рефлюкс-опосредованной пепсин на их клеточной поверхности как чужеродное тело и активируются. Макрофаги активации вызывает секрецию провоспалительных цитокинов, и эти цитокины вызывают воспаление, а также дополнительную активацию лимфоцитов, которые приводят к гипертрофии миндалин. Эта последняя гипотеза, как представляется, имеют больше поддержки, чем первый, поскольку, как показано на фиг.4, пепсин и CD68-позитивных клеток локализуется ниже поверхностного эпителия, расположенного в крипты (Фиг.4А), а также окружающие лимфоидный фолликул с чрезмерным последовавшей фиброза (рис 4В). Тем не менее, небольшая корреляция с пепсина и CD20 и CD45, в качестве маркеров В- и Т-клеток, соответственно, наблюдалось в миндалинах ткани (рис 4в).
<Р> Мы также оценили экспрессию CD163 от PBMNCs культуры с миндалин гипертрофия , CD163 экспрессируется только зрелых макрофагов, но отсутствует на моноцитах. Мы культивировали PBMNCs в течение 8 и 15 дней в присутствии 10% FCS и 10 нг /мл M-CSF, в соответствии со стандартными условиями для культуры человеческих макрофагов. Результаты в пробирке
PBMNCs исследования культуры показали, что в детской группе, CD163-положительные числа клеток были значительно выше в присутствии активированного пепсина, а также CD11c-положительных клеток. Для сравнения, не было никакого различия в экспрессии CD11c и CD163 от культуры PBMNCs от взрослых (S1) Рис. Эти данные свидетельствуют о том, что реакция PBMNC с активированной пепсина у детей могут быть более чувствительны, чем у взрослых. Несмотря на то, что мы не можем объяснить, какой механизм пепсин-индуцированное участвует в макрофагальной дифференцировки, мы не можем исключить, что сама макрофагальной дифференцировки может ускорить рефлюкс-опосредованного повреждения миндалины.
<Р> Согласно действующему исследованию, пепсин-опосредованной рефлюкс вызывает не только прямое повреждение эпителия миндалин, но и стимулировали миндалин макрофаги и миндалин эпителиальные клетки секретируют хемокины /цитокины, привлекших и активированные иммунные клетки, которые опосредованных некоторые повреждения слизистой оболочки миндалин. Микроскопическое воспаление, характеризуется TGF-β 1 и экспрессией ИНОС в миндалине ткани (крипты эпителия, окружающих зародышевый центр, а лимфоидных фолликул с чрезмерным развивается фиброзный внешний вид), наблюдается у пациентов с тяжелыми симптомами (данные не показаны). Из этого следует, что пепсин (и кислота) индуцированная продукция IL-8 и других воспалительных медиаторов рефлюксата способствуют миграции и активации лейкоцитов периферической крови [14]. Эти данные подтверждают гипотезу о том, что механизм, цитокин-опосредованного отвечает за миндалины травмы у детей с гипертрофией миндалин. Слизистая пациентов с гипертрофией миндалин производит значительно большие количества различных цитокинов. [29, 30] Эти воспалительные медиаторы активировать набор иммунных клеток и миграцию к местам рефлюксата взаимодействия и может быть вовлечен в патофизиологию миндалин гипертрофии.
<р> на основании полученных данных из литературных источников и результатов в этом исследовании, мы предполагаем, что локальная и системная активация воспалительных путей будет способствовать инфильтрацией лимфоцитами и пролиферации (в том числе Т-клетки) наряду с макрофагальной дифференцировки и пролиферации приводит к гипертрофии миндалин от возросший моноцитарного и лимфоцитарного числа клеток. Если текущие результаты доказывают, чтобы быть точным, то они могут обеспечить жизнеспособную мишень для разработки интервенционной подходов для лечения или профилактики гипертрофии миндалин у детей. Несмотря на значительные доказательства медиаторов воспаления и пролиферации лимфоцитов в патогенезе миндалин гипертрофия, взаимодействие между гиперчувствительностью к пепсина рефлюкса и миндалин воспаление остается неясным, в данном исследовании. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы лучше понять сигнальные пути, участвующие в возникновении симптомов рефлюкса и воспаления и выявить наряду с разработкой новых терапевтических подходов.

Выводы
<р> Мы установили, что лимфоциты и моноциты в весьма пролиферативного состояния в миндалинах с миндалин гипертрофия и связанные с повышенной экспрессией провоспалительных факторов, в результате воздействия желудочного рефлюкса пепсина. Эти результаты указывают на потенциально новых патофизиологических механизмов, лежащих в основе гипертрофии миндалин. Из наших
пробирке данных, мы устанавливаем, что может существовать возможность объективной характеристики механизмов, участвующих в целях разработки конкретных методов лечения этого заболевания индикации. Наши данные свидетельствуют о том, что механизмы, лежащие в основе пролиферации лимфоидной ткани миндалин гипертрофия различны и может позволить в будущем нехирургических терапевтические методы вмешательства пепсин, которые могут устранить необходимость в тонзиллэктомии, и приводит к инволюции гипертрофированных миндалин.

поддержка информация
S1 рис. Цитометрический анализ моноцитов населения и моноцитов дифференциации от PBMNCs взрослых с хроническим тонзиллитом.
Лимфоцитов и моноцитов были определены с боковой и рассеяния вперед. Лимфоциты и моноциты были также подтверждены с помощью окрашивания CD4 и CD8 и CD14 антител. PBMNCs культивировали в макрофагами конкретных условиях культивирования с или без активированного пепсина в течение 15 дней. Моноциты популяция была определена из стороны и вперед профилей рассеяния в проточной цитометрии в каждом состоянии. Каждый уровень сравнивали со значением 8-й день клеток в отсутствие пепсина, которые были даны произвольное значение "1". Моноцитов в макрофаги дифференцировки исследовали путем окрашивания CD11c и CD163 антител
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0152336.s001
(TIF)

• PLoS ONE: Геометрический Смешение, перистальтика, и геометрическая фаза желудка
• PLoS ONE: Кишечные маркеры стволовых клеток в кишечная метаплазия желудка и Esophagus