PLoS ONE: Extra-Oesofageale Pepsine van de maag refluxaat Promoted Tonsillen Hypertrophy

De abstracte

Achtergrond

Gastro-oesofageale reflux wordt in verband gebracht met tal van pathologische aandoeningen van de bovenste luchtwegen aerodigestive. Maag pepsine onder reflux bij aan immunologische reacties in de tonsil. In deze studie hebben we geprobeerd om de relatie tussen pepsine en tonsilhypertrofie voorbeeld.

Werkwijzen en vinden

We onderzochten de gedachte of tonsilhypertrofie werd door pepsine-gemedieerde maagzuur in tonsil hypertrofie. Fifty-vier kinderen met tonsillen hypertrofie en 30 volwassenen met een amandelontsteking werden gerekruteerd voor de chirurgische behandeling. Bloed en tonsil weefsel van elke patiënt werden geoogst voor analyse van veranderingen in lymfocyten en macrofagen nummers gekoppeld aan histologische en biochemische analyse. Pepsine werd uitgedrukt op verschillende niveaus in tonsil weefsel uit elk tonsilhypertrofie. Pepsine-positieve cellen in de crypte epitheel, rond de lymfoïde follikel ontwikkeling van fibrose, en ook rondom de lymfoïde follikel dat de crypte geconfronteerd. En ook, pepsine kleuring werd goed gecorreleerd met beschadigde tonsillar plaveiselepitheel en TGF-β1 en iNOS expressie in de tonsillen sectie. Bovendien, pepsine en TGF-β1-positieve cellen werden co-gelokaliseerd met CD68-positieve cellen in de crypte en omringende kiemcentra. In vergelijking macrofagen gevoeligheid voor pepsine, perifere bloed mononucleaire cellen (PBMNCs) waren aanzienlijk groter in de aanwezigheid van geactiveerde pepsine in het kind groep. Verder CD11c en CD163-positieve cellen werden significant verhoogd door geactiveerde pepsine. Echter, dit werd niet gezien voor de cultuur van PBMNCs van de volwassen groep.

Conclusies

De lymfocyten en monocyten zijn in een zeer proliferatieve staat in de tonsillar hypertrofie en geassocieerd met een verhoogde expressie van pro -inflammatory factoren als gevolg van blootstelling aan de maag reflux pepsine

Visum:. Kim JH, Jeong HS, Kim KM, Lee YJ, Jung MH, Park JJ, et al. (2016) Extra-oesofageale Pepsine van de maag refluxaat Bevorderd tonsillen hypertrofie. PLoS ONE 11 (4): e0152336. doi: 10.1371 /journal.pone.0152336

Editor: Gernot Zissel, Universitätsklinikum Freiburg, Duitsland

Ontvangen: 5 oktober 2015; Aanvaard: 11 maart 2016; Gepubliceerd: 8 april 2016

Copyright: © 2016 Kim et al. Dit is een open toegang Artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Availability:. Alle relevante gegevens binnen het papier en de Ondersteunende informatie bestanden

Financiering:. Deze studie werd ondersteund door de Basic Science Research Program, door middel van de National Research Foundation Korea (NRF), gefinancierd door het ministerie van Wetenschap, ICT, en Toekomst Planning (2013R1A1A1012542). Deze studie werd verder ondersteund door de belangrijkste buitenlandse Research Institute Recruitment Program, door middel van de National Research Foundation Korea (NRF), gefinancierd door het Ministerie van Onderwijs, Wetenschap en Technologie (MEST) (2012K1A4A3053142)). Dit werk werd ondersteund door Biomedische onderzoeksinstituut fund (GNUHBIF-2014-0009) van het Gyeongsang National University Hospital. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

tonsillen hypertrofie is op dit moment de meest voorkomende reden voor tonsillectomy. Vergroting van de amandelen optreedt als gevolg van een absolute toename in het aantal lymfocyten in het weefsel en resulteert in een toename van weefselvolume. [1, 2] Het precieze mechanisme waardoor lymfocyt stimulatie en proliferatie optreedt moet nog worden bepaald. Er werd geconcludeerd dat antigene stimulatie van het weefsel lymfocyten leidt tot een toename van lymfocytaire aantal en activiteit. Vorige pogingen om het identificeren van de pathofysiologische mechanismen gericht op microbiologische en immunologische veranderingen in vergrote amandelen. Veel studies hebben een mogelijke rol van bacteriële organismen in de pathogenese van tonsil hypertrofie gemeld. [3-5] Een verhoging van het absolute aantal lymfocyten in de amandelen zonder klinische infectie eerder aangetoond [2], en de specifieke antigenen verantwoordelijk voor deze veranderingen zijn niet geïdentificeerd.

Uit recent onderzoek is gekeken naar de relatie tussen extraesophageal refluxziekte en bovenste luchtwegen aandoeningen. Chronische sinusitis [6], otitis media met effusie [7-9] en larynx stoornissen zijn alle onderzocht met mogelijke etiologische verbindingen onder terugvloeikoeling extraesophageal. [10, 11] refluxaat bevat gastrische enzymen (pepsine en HCl) en duodeno pancreas enzymen (galzuren en trypsine). De rol van pepsine in maagsap kader van de refluxaat en interactie met otolaryngology systemen en organen ENT (oor, neus en keel) is uitgebreid bestudeerd. [1, 10, 11]

Pepsine is een enzym omgezet van pepsinogeen, die wordt geproduceerd door de hoofdcel van de maag, en speelt een belangrijke rol bij de spijsvertering. Normaliter wordt pepsine alleen in de maaginhoud. Indien extraesophageal reflux optreedt, de maaginhoud uit de reflux kan de laryngopharynx bereiken en pepsine kader van de maag reflux kan de laryngofaryngeale gebieden worden gedetecteerd. Dit is inderdaad het geval Johnston et al. [12] gemeld dat pepsine werd gedetecteerd in mucosa bovenste luchtwegen induceert en een pro-inflammatoire cytokine komen, waardoor inflammatoire beschadiging van de laryngeale slijmvlies. Deze gegevens een rol voor gerefluxt pepsine bij de afbraak van de immune afweer in het mucosale epitheel of voeringen en bevordering van inflammatoire veroorzakende middelen voorgesteld. [12-15]

Ook de tonsillen veronderstelden we dat de maag pepsine binnen reflux heeft een belangrijke rol in de immunologische reactie van de tonsillen en dat pepsine blootstelling induceert tonsillen hypertrofie. In deze studie hebben we gericht op de relatie tussen de maag pepsine en tonsillar hypertrofie vinden.

Materialen en methoden

Ethics statement

Deze studie werd goedgekeurd door de Gyeongsang National University Hospital Institutional review Board (# GNUHIRB-2014-02-006). Schriftelijke informed consent werd verkregen uit de alle patiënten (of ouders) voorafgaand aan hun opname in de studie.

Proefpersonen

Deze studie werd uitgevoerd bij 84 patiënten met de klinische diagnose van tonsillar hypertrofie. Ze bezoeken ons ziekenhuis voor de verwijdering van tonsillen omdat zij lijden aan chronische ontsteking op tonsillen of snurken /slaapapneu door tonsil uitbreiding. Alle patiënten ondergingen lichamelijk onderzoek om de diagnose van tonsillar hypertrofie of chronische tonsillitis bevestigen. De gemiddelde grootte van de tonsillen was cijfer 2,5 in tonsillen hypertrofie en rang 1,0 bij chronische tonsillitis groep. (Tafel 1). We kregen de tonsillen weefsel van 54 kinderen voorafgaand aan de chirurgische behandeling (41 jongens en 13 meisjes; leeftijdsgroep 4-16 jaar, gemiddelde leeftijd 8 jaar) en vanaf 30 volwassenen (17 mannen en 13 vrouwen, leeftijd 17 jaar en ouder, betekenen leeftijd 29 jaar). Patiënten met systemische aandoeningen en andere klinische problemen werden niet opgenomen in dit onderzoek. Hele tonsillectomy werd uitgevoerd onder algemene verdoving met behulp van dissectie methode en inferieure deel van de tonsillen werd geselecteerd voor weefsel bemonstering. Geen gehad postoperatieve complicaties

eiwitpreparaat en immunoblotanalyse

Weefselextracten van tonsillen werden als volgt bereid:. Tonsillen werden verwijderd en gehomogeniseerd in lysisbuffer bestaande uit PBS (pH 7,4), 1 % Triton X-100, 1 mM EDTA met 10 uM leupeptine en 200 uM fenylmethylsulfonylfluoride. De lysaten werden herhaaldelijk gesonificeerd gedurende 3-5 minuten elk en gecentrifugeerd bij 12.000 rpm gedurende 20 min bij 4 ° C. De supernatanten werden verzameld en de eiwitconcentratie van elk lysaat werd bepaald met een bicinchoninezuur (BCA) eiwitbepalingskit (Pierce, Rockford IL, USA) volgens het protocol van de fabrikant. Bovine serum albumine werd als standaard gebruikt. Gelijke hoeveelheden eiwit (50 ug) werden geladen op een 10% natriumdodecylsulfaat (SDS) polyacrylamide gel. Na elektroforese werden eiwitten in de gel overgebracht op een nitrocellulosemembraan (Schleicher &Schuell, Dassel, Duitsland). Membranen werden geblokkeerd met 5% magere melk in Tris-gebufferde zoutoplossing die 0,1% Tween-20. Blots werden geprobed met primaire antilichamen polyklonale anti-Pepsine A (sc-99081, Santa Cruz Biotechnology CA, USA) bij 4 ° C overnacht. Als belastingsbegrenzing, blots werden opnieuw gesondeerd met anti-β-actine antilichaam (Sigma, St. Louis MO, USA). Het primaire antilichaam werd gevisualiseerd met behulp van secundaire antilichamen (horseradish peroxidase geconjugeerd geiten anti-konijn IgG, 1: 10.000, Pierce) met een ECL-kit (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway NJ, USA)

Immunohistochemie
.

Immunologische kleuring werd uitgevoerd op 5 mm dikke coronale secties van paraformaldehyde gefixeerd en in paraffine ingebedde secties met de avidine-gebiotinyleerd mierikswortelperoxidase complex kits (ABC, Vector Laboratories, Burlingame CA, USA). Na deparaffinisatie in xyleen, gerehydrateerd secties werden met ethanol. Na wassen in PBS werden de coupes geblokkeerd met 1% normaal geit serum en vervolgens behandeld met een anti-Pepsine A (sc-99081, Santa Cruz), iNOS, TGF-β1 en CD68 antilichamen gekocht van Santa Cruz Biotechnology bij 4 ° C gedurende de nacht in een vochtige kamer. Na wassen in PBS werden ze geïncubeerd gedurende 90 min bij kamertemperatuur met secundair antilichaam (Santa Cruz Biotechnology, biotine-geconjugeerd anti-konijn immunoglobuline G, 1: 200). Tenslotte werden de secties geïncubeerd met ABC gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur, gespoeld met PBS en vervolgens ontwikkeld met 0,027% 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (Sigma) met 0,003% waterstofperoxide. De secties werden tegengekleurd met hematoxyline (Sigma).

Double immunofluorescentiekleuring

Om Pepsin A-positieve cellen te karakteriseren, werd dubbele immunofluorescentie uitgevoerd op de tonsillen weefsels. Deparaffinisatie en antigen herstel werden uitgevoerd. Niet-specifieke antilichaambinding werd geblokkeerd in PBS met 0,1% normaal serum ezel (Vector Laboratories) en 0,3% Triton X-100 (Sigma) gedurende 45 min. Daarna werden de secties geïncubeerd met anti-Pepsine A antilichaam (1: 100, SC-99081, Santa Cruz) verdund in PBS bevattende 0,1% runderserumalbumine (Sigma) bij 4 ° C overnacht. Na spoelen, ezel Cy3-geconjugeerd anti-konijn IgG secundair antilichaam (1: 100, EMD Millipore, Billerica MA, USA) werd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Bij dubbele labeling Na blokkeren in PBS met 10% normaal geitenserum en 0,3% Triton X-100, secties geïncubeerd met anti-CD68 (1: 100; Santa Cruz) bij 4 ° C overnacht. Alexa488-geconjugeerd anti-muis IgG secundair antilichaam (1: 100, Invitrogen, Carlsbad, USA) werd vervolgens gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Secties werden gemonteerd met anti-fading oplossing met 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Vector Laboratories), en bekeken onder een fluorescentiemicroscoop (Zeiss Microscopie Carl GmbH, Jena, Duitsland). Om CD68 positieve cellen te karakteriseren, werd dubbele immunofluorescentie uitgevoerd, zoals hierboven beschreven. Bij dubbele labeling, anti-TGF-β1 (1: 100; Santa Cruz) en anti-iNOS (1: 100; Santa Cruz) werd toegepast en ezel Cy3-geconjugeerd anti-konijn IgG secundair antilichaam (1: 100; EMD Millipore ) op CD68-gekleurde coupes.

Reverse transcriptie-polymerasekettingreactie (RT-PCR)

Totaal RNA werd geëxtraheerd uit tonsil weefsel met de TRIzol werkwijze volgens het protocol aanbevolen door de fabrikant ( GIBCO, Grand Island, NY). Gelijke hoeveelheden (5 ug) DNA-vrij totaal RNA uit elk monster werd omgezet in cDNA met behulp van 200 E SuperScript II RT (GIBCO, Grand Island, NY) in een 20 pl reactievolume. Reverse transcriptie werd uitgevoerd bij 22 ° C gedurende 10 minuten, bij 42 ° C gedurende 45 min en bij 95 ° C gedurende 5 minuten. De reactieproducten (2,0 ui) werden onderworpen aan PCR amplificatie (Promega, Madison, WI, USA) in een 50 pl reactievolume. Elke primer sequenties waren als volgt: IL-1β (189 bp), 5'-TCATTGCTCAAGTGTCTGAAGC-3 '(sense) en 5'-TGGTCGGAGATTCGTAGC-3' (antisense); IL-6 (628 bp), 5'-ATGAACTCCTTCTCCACAAGCGC-3 '(sense) en 5'-GAAGAGCCCTCAGGCTGGACTG-3' (antisense); TNF-β (443 bp), 5'-AGTGACAAGCCTGTAGCCC-3 '(sense) en 5'-GCAATGATCCCAAAGTAGACC-3' (antisense). PCR werd uitgevoerd met de BioRad thermocycler volgens de instructies van de fabrikant. Gelijke volumina van de amplificatieproducten werden geanalyseerd door 1,5% agarose gelelektroforese met 0,5 mg /ml ethidiumbromide kleuring.

Flow cytometrische analyse en in vitro kweek

alle bloedmonsters werden binnen 2 uur verwerkt na het nemen van bloed. Perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMNCs) werden geïsoleerd door centrifugeren met een dichtheidsgradiënt over een Ficoll-gradiënt (Sigma, St. Louis MO, USA) gedurende 25 min bij 2300 rpm en werden driemaal gewassen in PBS. PBMNCs van 1 x 10 ^{5 cellen werden daarna geanalyseerd met stroomcytometrie. Of pepsine is betrokken bij monocyt macrofaag differentiatie werden de resterende cellen op kweekschalen in aanwezigheid /of afwezigheid van geactiveerde pepsine (Thermo Scientific, Rockford IL, USA) met monocyt kweekomstandigheden. Om het niveau van macrofaag bevolking te identificeren, na 8 en 15 dagen werden cellen geoogst en geanalyseerd door flow cytometrie middels antilichaam voor CD11c en CD163. Alle celkweken werden bij 37 ° C aangehouden met 5% CO _{2 in een vochtige atmosfeer.}}

Cellevensvatbaarheid

RAW264.7 cellen, muizen macrofaag cellijn, werden gekweekt het effect van pepsine op macrofaag proliferatie onderzocht. De cellen werden in verschillende concentraties van pepsine behandelde (0,01-5 ug /ml) en cellevensvatbaarheid werd onderzocht door CCK-8 kit (Cell Counting Kit-8, DOJINDO Molecular Tech. Inc., Rockville, MD, USA). Cellevensvatbaarheid in elke concentratie werd weergegeven als voudige verandering. De vouw wijzigingen worden berekend als de verhouding van de eindwaarde in elk aanwezigheid van pepsine met die in afwezigheid van pepsine (ingesteld als "1"). Waarden worden weergegeven als het gemiddelde ± SEM. * P
< 0,05 versus de overeenkomstige afwezigheid van pepsine (0 ug /ml).

In vitro
migratieanalyse

Een standaard monolaag kras wond model werd gebruikt om de gevoeligheid van karakteriseren macrofagen pepsine. RAW264.7 cellen werden uitgezaaid in 6-well weefselkweek platen, gekweekt tot confluentie en de monolagen werden verwond door krabben langs het oppervlak van de weefselkweek kunststof met een scheermesje. Het blad werd neergedrukt in het midden van de schotel, dus minder de cellaag en gelijktijdig de markering "gewikkeld boundary" op de onderliggende kunststof. Vervolgens werd het blad voorzichtig gleed unidirectioneel helft van de confluente cellaag verwijderd. De "gewonde monolaag" werd tweemaal onder standaard kweekomstandigheden gedurende 24 uur gewassen met fosfaat gebufferde zoutoplossing pH 7,4 (PBS), opnieuw gevoed met 1 mM-mitomycine-bevattende serum onthouden medium en geïncubeerd.

Statistische analyse

Alle gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM Vergelijkingen tussen groepen werden geanalyseerd met tweezijdige t Electronics Test. Waarschijnlijkheid waarden ( P
) < 0,05 werden significant beschouwd.

Resultaten

Pepsine werd uitgedrukt in de tonsil

Immunoblot gegevens bleek dat pepsine eiwit werd tot expressie gebracht als een enkele band uit extracten van zowel de tonsil patiënten met tonsil hypertrofie. Pepsine was sterk uitgedrukt als meerdere banden in de positieve controle van de maag weefselextracten. Vrijwel geen pepsine kleuring werd waargenomen in andere weefsels, waaronder tumor, lymfeklieren (LN), schildklier (Thy), oorspeekselklier (Parotis g.), Speekselklier (SG) (afbeelding 1A). Al tonsil weefsel vertoonde een positief signaal voor pepsine (figuur 1B). Echter, detectieniveaus van pepsine in de tonsil waren enigszins verschillend in elke patiënt (figuur 1B). Immunohistochemische kleuring werd uitgevoerd om de pepsine-positieve cellen te identificeren in de tonsil weefsel. Pepsine-positieve cellen selectief in onderstaande oppervlakte-epitheel, voornamelijk in de crypte (figuur 1C-a en b) rondom het negatiever kiemcentra (figuur 1C-c en d), en ook rondom de lymfoïde follikel overmatige ontwikkelen fibrose (figuur 1C-e en f). Maag delen die als positieve controle vertoonde een typisch patroon pepsine kleuring, overwegend kliercellen (figuur 2D-a), maar niet in de lymfeklier (figuur 1D-b) en schildklier (figuur 1D-c).

de pepsine-positieve cellen werden gedetecteerd in de beschadigde tonsillen plaveiselepitheel

om de relatie met de tonsillen plaveiselepitheel schade en reflux te bevestigen, hebben we geprobeerd om pepsine-positieve cellen in de gewonde of intacte tonsillar epitheliale vinden architectuur. Beschadigde plaveiselepitheel, onregelmatige of gebroken bleken de tonsillen weefsels tonsilhypertrofie (figuur 2A en 2D, hieronder). Pepsine-positieve cellen werden gedetecteerd in de beschadigde gebieden (rechts invoegen in figuur 2A, 2D, 2E en 2F) vergeleken met normale epitheel (links insert in figuur 2A en 2B). Met name worden de signalen sterk in de omgeving spleten en beschadigd tonsil plaveiselepitheel (stippellijnen in figuur 2C en 2E).

TGF-β1 en iNOS-positieve cellen werden gedetecteerd in de tonsil patiënten met tonsil hypertrofie

Immunohistochemische kleuring voor TGF-β1 en iNOS werd uitgevoerd om de relatie tussen pepsine kleuring en inflammatie onderzoeken. Zowel TGF-β1 en iNOS-positieve signalen werden ook gedetecteerd in gebieden vergelijkbaar met pepsine vlekken, zoals in de crypt epitheel (Figuur 3A en 3B), rondom de germinale centra (Figuur 3C en 3D) en rond de lymfoïde follikel overmatige ontwikkelen fibrose (figuur 3E en 3F).

pepsine en TGF-β1 werden gedetecteerd in CD68-positieve cellen in de tonsil hypertrofie weefsel

Zoals beschreven in de inleiding, veronderstelden we dat pepsine kleuring in de tonsil afkomstig uit de maag en kan worden gerelateerd aan ontsteking tonsillen. Dubbele immunofluorescentie kleuring voor CD68 werd uitgevoerd om de pepsine-positieve cellen te karakteriseren. CD68 is een 110 kD transmembraan glycoproteïne en een vertegenwoordiger marker van humane monocyten en weefsel macrofagen van inflammatie. CD68-positieve cellen werden duidelijk waargenomen in de tonsil met tonsil hypertrofie (Figuur 4). Van de nota, CD68-positieve cellen sterk colocalized met pepsine en TGF-β1-positieve cellen, zowel in de crypte (figuur 4A) en de omliggende kiemcentra (figuur 4B). In tegenstelling tot colocalization pepsine en CD68, pepsine geen medewerking lokaliseren met B-lymfocyten (CD20 positief) in de folliculaire centra en T-lymfocyten (CD45) in de interfolliculaire gebieden (figuur 4C). Deze gegevens, evenals die van figuur 3 voorgesteld pepsine kleuring kan worden gerelateerd aan de ontstekingsreacties in de tonsil patiënten met tonsil hypertrofie. Ook, de belangrijkste mechanisme van tonsil schade openbaren door ontstekingsmediatoren gemedieerd door witte bloedcellen waaronder PBMNCs en macrofagen, tonsil niveaus IL-6, IL-1β en TNF-α mRNA onderzocht door RT-PCR (figuur 4D). Interessant, al deze werden uitgedrukt in de tonsil weefsel met tonsilhypertrofie. Deze gegevens suggereren dat de belangrijkste mechanisme van tonsillar hypertrofie kan worden veroorzaakt door ontstekingsmediatoren.

Pepsine dreef de patiënten-afgeleide monocyten om te differentiëren naar macrofagen

Om de relatie van pepsine kleuring en macrofagen te bevestigen, we gekweekte perifere bloed mononucleaire cellen (PBMNCs) vanaf tonsillaire hypertrofische patiënten in macrofagen kweekmedium (in aanwezigheid of afwezigheid van geactiveerde pepsine) gedurende 15 dagen. Verder hebben we gehaltes aan monocyten bevolking en macrofaag fenotype geanalyseerd met stroomcytometrie. Menselijke macrofagen geproduceerd door de differentiatie van monocyten in weefsels. Ze spelen een cruciale rol in de niet-specifieke afweer (aangeboren immuniteit), en ook helpen aanzet geven tot specifieke afweermechanismen (adaptieve immuniteit) door het aantrekken van andere afweercellen zoals lymfocyten. Ze kunnen worden geïdentificeerd met behulp van flowcytometrie door hun specifieke expressie van eiwitten zoals CD markers inclusief CD 11 c en CD163. De populatie van monocyten afgeleid aanstroomzijde en voorwaartse verstrooiing (figuur 5A) was significant verhoogd in aanwezigheid van geactiveerde pepsine (aPepsin), in vergelijking met geen verhoging op dag 8, en geen significante verhoging op dag 15 (Figuur 5B). Bovendien hebben we de monocyt macrofagen ontwikkeling met behulp CD11c en CD163 antilichamen. De CD11c en CD163-positieve cellen waren significant verhoogd met aPepsin op dag 8 na de teelt. Geen betekenis is in andere omstandigheden (figuur 5C). De monocyten populatie was niet significant en ook niveaus CD11c en CD163 bij volwassen groep zowel op dag 8 en 15. Deze gegevens suggereren dat pepsine mogelijk betrokken is bij macrofaag differentiatie en kinderen met verhoogde maag reflux kan meer worden blootgesteld aan gevolgen van een pepsine milieu dan volwassenen.

Pepsin geïnduceerde macrofaag leefbaarheid en migratie

We hebben ook onderzocht of pepsine was betrokken bij macrofaag-functie. RAW264.7 cellen werden gekweekt in aanwezigheid of afwezigheid van geactiveerde pepsine gedurende 24 uur. Er was een significante dosis-afhankelijke toename RAW264.7 cellevensvatbaarheid in pepsine (figuur 6A). Migratie van RAW264.7 cellen werd ook veroorzaakt door pepsine in zowel de scratch wond en transwell migratie systeem assays (figuur 6B en 6C).

Discussie

Deze studie toonde aan dat de eerste pepsine werd ontdekt in de hypertrofische amandelen en pepsine-positieve cellen gelokaliseerd in de crypte epitheel rondom het kiemcentrum en in de lymfoïde follikel overmatige ontwikkeling fibrotische uiterlijk. Met name werd pepsine kleuring correleerde met expressie van inflammatie factoren en pepsine en CD68 colocalized en geactiveerde pepsine tot differentiatie van monocyten tot macrofagen. [16] Deze bevindingen wijzen op potentieel nieuwe pathofysiologische mechanismen achter tonsilhypertrofie.

Intense ontsteking is een bekende risicofactor voor tonsillen hypertrofie. [17] TGF-β1 en iNOS bekend ontstekingsmediatoren. [18-20] in hypertrofische amandelen, de verhoging van T- en B-cel aantallen toonden een positieve correlatie met bacteriële tellingen en tonsillen grootte. [21, 22] In epidemiologische studies, roken, allergieën en terugkerende infecties van de luchtwegen zou kunnen associëren met tijdelijke of permanente hypertrofie van lymfeweefsel. [22, 23] immunologische parameters, genetische aanleg en lokale lymfocyt disfunctie lijken te spelen rol in de etiologie van recidiverende tonsillitis en tonsillaire hypertrofie. [22, 24] Sommige studies aangetoond dat tonsilhypertrofie in verband met verhoogde lymfoïde follikel grootte, maar niet het aantal follikels [25] en is ook met verhoogde tonsillen gewicht, verhoogde follikel diameter, oppervlakte en aantal. [26]

de periodieke stimuli door ziekteverwekkers, tijdens het ontstekingsproces, leiden tot de activering van monocyten en macrofagen. [27] de cytokines uitgescheiden door macrofagen stimuleren immuuncellen, en ook leiden tot proliferatie van endotheelcellen en fibroblasten. [28] Mettertijd een immunologisch actief weefsel wordt vervangen door fibrotisch weefsel. [28] In deze studie hebben we aangenomen dat het antigeen pepsine en stellen we twee gevallen de waarneming van tonsilhypertrofie met uitleggen maagreflux (figuur 7). Een mechanisme kan directe stimulatie van de lymfocyten door pepsine van refluxaat die erkend worden als antigeen zijn. Een ander mogelijk mechanisme omvat pepsine-geïnduceerd letsel aan het epitheel van de crypten tonsillar, waardoor cryptitis van resident bacteriën continue antigene stimulatie van gespecialiseerde crypt epithelium. Dit zou leiden tot een toename van het aantal lymfocyten en kunnen een rol spelen tonsilhypertrofie.

Aanvankelijk pepsine in contact komt met het epitheel en wordt aan het intra-epitheliale lymfocyten, de subepitheliale lymfocyten, interfolliculaire en intrafollicular lymfocyten , in die volgorde. De lymfocyten vervolgens prolifereren in respons op pepsine fungeren als een antigeen, waardoor de tonsil follikels te vergroten en de tonsil weefsel hypertrofie te ondergaan. Als alternatief tonsillen weefsel macrofagen erkennen de-reflux gemedieerde pepsine op hun celoppervlak als een vreemd lichaam en worden geactiveerd. Macrofaagactivering veroorzaakt secretie van pro-inflammatoire cytokines en deze cytokines induceren ontsteking en andere lymfocyt activatie die leiden tot tonsilhypertrofie. Deze laatste hypothese lijkt meer steun dan de eerstgenoemde, aangezien zoals getoond in figuur 4, zijn pepsine en CD68-positieve cellen onder de oppervlakte epitheel in de crypte (figuur 4A) colocalized en ook rondom de lymfoïde follikel buitensporige daaropvolgende fibrose (Fig 4B). Met respectievelijk weinig verband met pepsine en CD20 en CD45, als merkers van B- en T-cellen werd waargenomen in de tonsil weefsel (Figuur 4C).

We werd ook de expressie van CD163 van PBMNCs cultuur tonsilhypertrofie . CD163 wordt uitgedrukt alleen door volwassen macrofagen, maar afwezig op monocyten. We gekweekt PBMNCs voor 8 en 15 dagen in aanwezigheid van 10% FCS en 10 ng /ml M-CSF, volgende standaard omstandigheden voor het kweken van humane macrofagen. Resultaten van de In vitro
PBMNCs cultuur studies is gebleken dat bij het kind groep, CD163-positieve cel aantallen aanzienlijk hoger in aanwezigheid van geactiveerde pepsine evenals CD11c-positieve cellen waren. In vergelijking was er geen verschil in de expressie van CD11c en CD163 uit de kweek van PBMNCs uit volwassenen (Fig S1). Deze gegevens suggereerden dat een PBMNC reactie op geactiveerde pepsine bij kinderen gevoeliger dan bij volwassenen zouden kunnen zijn. Hoewel we niet kunnen verklaren welke-pepsine veroorzaakte mechanisme is betrokken bij macrofaag differentiatie, kunnen we niet uitsluiten dat macrofaag differentiatie zelf-reflux gemedieerde tonsillen schade zou kunnen versnellen.

Volgens de huidige studie-pepsine veroorzaakte reflux veroorzaken niet alleen directe schade aan de tonsil epitheel, maar stimuleerde ook de tonsillar macrofagen of keelamandelen epitheelcellen chemokines /cytokines die aangetrokken en geactiveerde immuuncellen dat deel van de schade aan de mucosa tonsil gemedieerde afscheiden. Microscopische ontsteking gekenmerkt door TGF- β1 en iNOS expressie in de tonsil weefsel (crypt epitheel, rond het kiemcentrum en de lymfoïde follikel overmatige ontwikkeling fibrotische uiterlijk), waargenomen bij patiënten met ernstige symptomen (gegevens niet getoond). Dit impliceert dat de pepsine (en zuur) geïnduceerde productie van IL-8 en andere inflammatoire mediatoren door refluxaat bevorderen migratie en activering van leukocyten van perifeer bloed. [14] Deze resultaten bevestigen de hypothese dat een cytokine-gemedieerde mechanisme verantwoordelijk is voor de tonsillen letsel bij kinderen met tonsillar hypertrofie. Het slijmvlies van patiënten met tonsilhypertrofie opleveren die grote hoeveelheden van verschillende cytokinen. [29, 30] Deze inflammatoire mediatoren activeert immuuncellen werving en migratie naar de plaatsen van interactie refluxaat en kunnen betrokken zijn bij de pathofysiologie van tonsil hypertrofie.

op basis van de bevindingen uit de literatuur en onze resultaten in deze studie, stellen wij voor dat lokale en systemische activering van ontstekingsreacties lymfocytinfiltratie en proliferatie (waaronder T-cellen) samen met macrofaag differentiatie en proliferatie gevolg tonsilhypertrofie van de toegenomen bevordert monocytische en lymfocytische celaantallen. Als de huidige bevindingen nauwkeurig blijken te zijn, kunnen zij een levensvatbare doelwit voor de ontwikkeling van interventiebenaderingen voor de behandeling of preventie van tonsillaire hypertrofie bij kinderen. Ondanks de aanzienlijke bewijs voor ontstekingsmediatoren en lymfocyten proliferatie in de pathogenese van tonsil hypertrofie, de wisselwerking tussen overgevoeligheid voor pepsine reflux en tonsil ontsteking blijft onduidelijk in deze studie. Verdere studies zijn gerechtvaardigd om beter te begrijpen van de signaalwegen die betrokken zijn bij het ontstaan ​​van reflux symptomen en ontsteking en om mee te identificeren met het ontwikkelen van nieuwe therapeutische benaderingen.

Conclusies

We hebben vastgesteld dat de lymfocyten en monocyten zijn in een sterk proliferatieve toestand met de amandelen en tonsillen hypertrofie geassocieerd met verhoogde expressie van pro-inflammatoire factoren als gevolg van blootstelling aan maagzuur pepsine. Deze bevindingen wijzen op potentiële nieuwe pathofysiologische mechanismen die ten grondslag liggen tonsillar hypertrofie. Vanuit onze In vitro
data, we vaststellen dat er de mogelijkheid van objectieve karakterisering van de betrokken om specifieke behandelingen voor deze ziekte indicatie te ontwikkelen mechanismen kunnen zijn. Onze gegevens suggereren dat de onderliggende mechanismen lymfeweefsel proliferatie in tonsilhypertrofie onderscheiden en kunnen zorgen voor toekomstige niet-chirurgische therapeutische interventies gericht pepsine dat de noodzaak van een tonsillectomie kan voorkomen, en leidt tot involutie van de hypertrofische amandelen.

Ondersteunende informatie
S1 Fig. Flow cytometrische analyse van monocyten bevolking en monocyt differentiatie van PBMNCs van volwassenen met chronische amandelontsteking.
Lymfocyten en monocyten werden geïdentificeerd met kant en voorwaartse verstrooiing. Lymfocyten en monocyten werden bevestigd door kleuring met CD4 en CD8 en CD14 antilichamen. PBMNCs werden in macrofaag-specifieke kweekomstandigheden, met of zonder geactiveerde pepsine gedurende 15 dagen gekweekt. Monocyten populatie werd geïdentificeerd van de zijkant en voorwaartse verstrooiing profielen in flowcytometrie in elke conditie. Elk niveau vergeleken met de waarde van dag 8 cellen in afwezigheid van pepsine dat een willekeurige waarde van "1" gegeven. Monocyten naar macrofaag differentiatie werd onderzocht door kleuring met CD 11 c en CD163 antilichamen
doi:. 10.1371 /journal.pone.0152336.s001
(TIF)

• PLoS ONE: Geometrische Mengen, Peristaltiek, en de geometrische fase van de maag
• PLoS ONE: Intestinale Stem Cell Markers in de intestinale Metaplasie van maag en Barrett-slokdarm