PLOS ONE: Extra-esofágico pepsina a partir do refluxo de estômago Promovido Tonsil Hypertrophy

Abstract

Fundo

O refluxo gastroesofágico está associado a várias condições patológicas do trato aerodigestivo superior. pepsina gástrica dentro refluxo contribui para as reações imunológicas na amígdala. Neste estudo, o objetivo foi encontrar as relações entre a pepsina e hipertrofia das amígdalas.

Métodos e encontrar

Nós exploramos a noção se a hipertrofia tonsilar foi devido ao refluxo gástrico mediada por pepsina na hipertrofia de amígdalas. Cinquenta e quatro crianças com hipertrofia de amígdalas e 30 adultos com amigdalite foram recrutados antes do tratamento cirúrgico. Do sangue e tecidos de amígdalas a partir de cada paciente foram recolhidas para análise de alterações nos números de linfócitos e macrófagos, juntamente com a análise histológica e bioquímica. Pepsina foi expressa em diferentes níveis em tecidos das amígdalas de cada hipertrofia tonsilar. células de pepsina-positivas foram encontradas no epitélio da cripta, em torno do folículo linfóide com o desenvolvimento de fibrose, e também em torno do folículo linfóide que Moderada a cripta. E também, coloração pepsina foi bem correlacionada com epitélio tonsilar danificado escamosas e TGF-β1 e expressão iNOS na secção de amígdalas. Além disso, a pepsina e TGF-β1-positivas as células foram co-localizada com as células CD68-positivas na cripta e em torno dos centros germinais. Em comparação da capacidade de resposta de macrófagos de pepsina, células mononucleares do sangue periférico (PBMNCs) eram visivelmente maior na presença de pepsina activado no grupo criança. Além disso, CD11c e CD163-células positivas foram significativamente aumentada pela pepsina activado. No entanto, isso não foi observado para a cultura de PBMNCs do grupo adulto.

Conclusões

Os linfócitos e monócitos estão em um estado altamente proliferativa na hipertrofia das amígdalas e associado com aumento da expressão de pro fatores-inflamatória, como resultado da exposição a pepsina refluxo do estômago

Citation:. Kim JH, Jeong HS, Kim KM, Lee YJ, Jung MH, Parque JJ, et al. (2016) Extra-esofágico pepsina a partir de estômago do refluxo Promovido hipertrofia de amígdalas. PLoS ONE 11 (4): e0152336. doi: 10.1371 /journal.pone.0152336

editor: Gernot Zissel, UNIVERSITÄTSKLINIKUM Freiburg, Alemanha |

Recebido: 05 de outubro de 2015; Aceito: 11 de março de 2016; Publicação: 08 de abril de 2016

Direitos de autor: © 2016 Kim et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo Programa de Pesquisa em Ciência básica, através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF), financiado pelo Ministério da Ciência, TIC, e Planejamento Futuro (2013R1A1A1012542). Este estudo foi ainda apoiada pela Research Foreign Programa de Recrutamento Instituto Leading, através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF), financiado pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia (MEST) (2012K1A4A3053142)). Este trabalho foi financiado pelo fundo de instituto de pesquisa biomedcal (GNUHBIF-2.014-0.009) do Hospital da Universidade Nacional de Gyeongsang. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a hipertrofia das tonsilas é atualmente a razão mais comum para amigdalectomia. O alargamento da amígdalas ocorre devido a um aumento absoluto no número total de linfócitos no tecido e que resulta em um aumento no volume de tecido. [1, 2] O mecanismo exacto pelo qual a estimulação de linfócitos e a proliferação ocorre ainda não foi determinada. Verificou-se inferir que a estimulação antigénica de linfócitos dos tecidos leva a um aumento no número e actividade linfocítica. Tentativas anteriores de identificar os mecanismos fisiopatológicos têm-se centrado sobre as alterações microbiológicas e imunológicas em amígdalas. Muitos estudos relataram um possível papel de organismos bacterianos na patogénese da hipertrofia de amígdalas. [3-5] No entanto, um aumento no número absoluto de linfócitos dentro das amígdalas sem uma infecção clínica foi anteriormente mostrado [2], e os antigénios específicos responsáveis para que estas alterações não foram identificados.

Uma pesquisa recente olhou para a relação entre a doença de refluxo extra-esofágico e distúrbios das vias aéreas superiores. sinusite crônica [6], otite média com efusão [7-9] e alterações laríngeas foram todos estudou com possíveis ligações etiológicos para extra-esofágicas de refluxo. [10, 11] refluído contém enzimas gástricas (pepsina e HCl), bem como duodeno-pancreático enzimas (tripsina e ácidos biliares). O papel de pepsina no suco gástrico, como parte do refluído e interação com sistemas de otorrinolaringologia e otorrinolaringológicas (ouvido, nariz e garganta) tem sido extensivamente estudadas. [1, 10, 11]

A pepsina é uma enzima convertido de pepsinogénio, que é produzida pelo chefe de células do estômago, e desempenha um papel importante na digestão. Normalmente, a pepsina só é encontrada no conteúdo do estômago. No entanto, se o refluxo extraesofágico ocorre, o conteúdo do estômago de refluxo pode chegar a laringofaringe, pepsina e como parte do refluxo do estômago pode ser detectado nas áreas laringofaríngeos. Este é certamente o caso de Johnston et ai. [12] relataram que a pepsina foi detectada na mucosa das vias aéreas superiores e induz um ciclo de citocina pró-inflamatória, resultando em danos inflamatória na mucosa da laringe. Estes dados sugerem um papel para a pepsina refluxo na quebra do mecanismo de defesa imunológica na mucosa ou revestimentos epiteliais e promoção dos agentes inflamatórios que causam. [12-15]

Da mesma forma para a tonsila, a hipótese de que gástrica pepsina dentro de refluxo tem um papel fundamental na sua reação imunológica das amígdalas e que a exposição pepsina induz a hipertrofia de amígdalas. Neste estudo, buscou-se encontrar a relação entre a pepsina gástrica e hipertrofia das amígdalas.

Materiais e Métodos

Ética declaração

Este estudo foi aprovado pelo Hospital da Universidade Nacional Gyeongsang Institutional Review Board (# GNUHIRB-2014-02-006). O consentimento informado escrito foi obtido dos todos os pacientes (ou pais) antes da sua inclusão no estudo.

Os sujeitos do estudo

Este estudo foi realizado em 84 pacientes com o diagnóstico clínico da hipertrofia tonsilar. Eles visitam nosso hospital para a retirada de amígdalas, porque eles sofrem de inflamação crônica na amígdalas ou ronco /apneia do sono devido ao alargamento das amígdalas. Todos os pacientes foram submetidos a exame físico para confirmar o diagnóstico de hipertrofia das amígdalas ou amigdalite crônica. O tamanho médio das amígdalas foi de grau 2.5 no grupo hipertrofia de amígdalas e grau 1.0 no grupo amigdalite crônica. (Tabela 1). Obtivemos os tecidos das amígdalas de 54 crianças antes do tratamento cirúrgico (41 meninos e 13 meninas; faixa etária 4-16 anos, com idade média de 8 anos) e de 30 adultos (17 homens e 13 mulheres; faixa etária de 17 e mais, significa idade 29 anos). Os pacientes com doenças sistêmicas e outros problemas clínicos não foram incluídos neste estudo. amigdalectomia todo foi realizada sob anestesia geral usando o método de dissecação e parte inferior das amígdalas foi selecionado para a amostragem de tecido. Nenhum teve qualquer complicação pós-operatória

preparação de proteína e análise de imunotransferência

extractos de tecido de amígdalas foram preparados como se segue:. Amígdalas foram removidos e homogeneizados em tampão de lise composta de PBS (pH 7,4), 1 % de Triton X-100, EDTA 1 mM contendo 10 uM de leupeptina e 200 uM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo. Os lisados ​​foram sonicadas várias vezes durante 3 a 5 min cada e centrifugado a 12000 rpm durante 20 min a 4 ° C. Os sobrenadantes foram recolhidos e a concentração de proteína de cada ligado foi determinado utilizando um ácido bicinconínico (BCA) Kit de ensaio de proteínas (Pierce, Rockford IL, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. albumina de soro bovino foi utilizada como padrão. Quantidades iguais de proteína (50 ug) foram carregadas num gel de poliacrilamida a 10% de sulfato de dodecilo de sódio (SDS). Após a electroforese, as proteínas no gel foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Schleicher & Schuell, Dassel, Alemanha). As membranas foram bloqueadas com 5% de leite magro em solução salina tamponada com Tris contendo 0,1% de Tween-20. As manchas foram sondadas com anticorpos primários para policlonais anti-pepsina A (SC-99081, Santa Cruz Biotechnology CA, EUA) a 4 ° C durante a noite. Como um controlo de carga, blots foram re-sondados com anticorpo anti-actina β (Sigma, St. Louis, MO, EUA). O anticorpo primário foi visualizada utilizando anticorpos secundários (IgG de rábano de cabra anti-coelho conjugado com peroxidase, 1: 10000; Pierce) com um kit ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway NJ, EUA)

A imuno-histoquímica
.

a imunocoloração foi realizada em 5 mm de secções coronais de espessura das secções fixadas em paraformaldeído e embebidas em parafina usando os kits de peroxidase-avidina-complexo biotinilado de rábano (ABC; Vector Laboratories, Burlingame CA, EUA). Seguindo desparafinização em xileno, as secções foram re-hidratadas com etanol. Após lavagem em PBS, as secções foram bloqueadas com soro de cabra normal a 1% e, em seguida, tratada com um anticorpo anti-pepsina A (SC-99081, Santa Cruz), iNOS, TGF-β1, e anticorpos CD68 adquirido da Santa Cruz Biotechnology a 4 ° durante a noite C numa câmara humidificada. Após lavagem em PBS, foram incubadas durante 90 min à temperatura ambiente com o anticorpo secundário (Santa Cruz Biotechnology, biotina-conjugado anti-coelho de imunoglobulina G, 1: 200). Finalmente, as secções foram incubadas com a ABC durante 60 minutos à temperatura ambiente, lavadas em PBS e, em seguida desenvolvidas com 0,027% tetracloridrato de 3,3'-diaminobenzidina (Sigma) com 0,003% de peróxido de hidrogénio. As secções foram contrastadas com hematoxilina (Sigma).

imunofluorescência dupla coloração

Para caracterizar pepsina células A-positivas, dupla imunofluorescência foi realizada nos tecidos das amígdalas. Desparafinização e recuperação antigênica foi realizada. A ligação de anticorpo não especifica foi bloqueada em PBS com 0,1% de soro de burro normal (Vector Laboratories) e 0,3% de Triton X-100 (Sigma) durante 45 min. As secções foram então incubadas com anti-pepsina A de anticorpo (1: 100; SC-99081, Santa Cruz) diluído em PBS contendo 0,1% de albumina de soro de bovino (Sigma) a 4 ° C durante a noite. Depois de enxaguar, burro conjugado com Cy3 anti-coelho de IgG de anticorpo secundário (1: 100; Merck Millipore, Billerica MA, EUA) foi aplicada durante 1 hora à temperatura ambiente. Para a marcação dupla, depois de bloquear em PBS contendo 10% de soro normal de cabra e 0,3% de Triton X-100, as secções foram incubadas com anti-CD68 (1: 100; Santa Cruz) a 4 ° C durante a noite. Alexa488 anticorpo conjugado com IgG anti-ratinho secundário (1: 100; Invitrogen, Carlsbad CA, EUA) foi aplicada em seguida durante 1 hora à temperatura ambiente. As secções foram montadas com uma solução anti-desvanecimento contendo 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (Vector Laboratories), e observados sob um microscópio de fluorescência (Carl Zeiss Microscopia GmbH, Jena, Alemanha). Para caracterizar as células CD68-positivas, duas vezes imunofluorescência foi realizada, como descrito acima. Para a marcação dupla, anti-TGF-β1 (1: 100; Santa Cruz) e anti-iNOS (1: 100; Santa Cruz) foram aplicados e, em seguida, burro Cy3-conjugado anti-coelho de anticorpo secundário IgG (1: 100; Merck ) em secções coradas com CD68.

Inverter reacção em cadeia de polimerase (RT-PCR)

o ARN total foi extraído a partir de tecidos das amígdalas usando o método TRIzol de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante ( GIBCO, Grand Island, NY). Quantidades iguais (5 ug) de ARN total livre de ADN a partir de cada amostra foram convertidos em ADNc, utilizando 200 U de Superscript II RT (GIBCO, Grand Island, NY) num volume de reacção de 20 uL. A transcrição reversa foi realizada a 22 ° C durante 10 min, a 42 ° C durante 45 min, e a 95 ° C durante 5 min. Os produtos da reacção (2,0 ul) foram sujeitos a amplificação por PCR (Promega, Madison, WI, EUA) num volume de reacção de 50 uL. Cada sequências iniciadoras foram as seguintes: IL-1β (189 pb), 5'-TCATTGCTCAAGTGTCTGAAGC-3 '(sentido) e 5'-TGGTCGGAGATTCGTAGC-3' (anti-sentido); IL-6 (628 pb), 5'-ATGAACTCCTTCTCCACAAGCGC-3 '(sentido) e 5'-GAAGAGCCCTCAGGCTGGACTG-3' (anti-sentido); TNF-β (443 pb), 5'-AGTGACAAGCCTGTAGCCC-3 '(sentido) e 5'-GCAATGATCCCAAAGTAGACC-3' (anti-sentido). O PCR foi realizado usando o termociclador BioRad de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante. Volumes iguais dos produtos de amplificação foram analisados ​​por electroforese em 1,5% de gel de agarose com 0,5 mg /ml de brometo de etídio.

análise de citometria de fluxo e In vitro
cultivo

todas as amostras de sangue foram processadas no prazo de 2 horas após tomar sangue. As células mononucleares do sangue periférico (PBMNCs) foram isoladas por centrifugação em gradiente de densidade ao longo de um gradiente de Ficoll (Sigma, St. Louis, MO, EUA) durante 25 min a 2300 rpm e foram lavadas três vezes em PBS. PBMNCs em 1 × 10 ^{5 células foram depois analisadas por citometria de fluxo. Se pepsina está envolvida na diferenciação de monócitos para macrófagos, as células restantes foram plaqueadas em placas de cultura na presença /ausência de pepsina ou activado (Thermo Scientific, Rockford IL, EUA) contendo condições de cultura de monócitos. Para identificar a nível da população de macrófagos, após 8 e 15 dias, as células foram colhidas e analisadas por citometria de fluxo utilizando anticorpo para CD11c e CD163. Todas as culturas de células foram mantidas a 37 ° C com 5% de CO _{2 numa atmosfera humidificada.}}

A viabilidade celular

RAW264.7 células, linha de células semelhantes a macrófagos do rato, foram cultivadas para investigar o efeito de pepsina sobre a proliferação de macrófagos. As células foram tratadas de várias concentrações de pepsina (0,01-5 ug /ml) e a viabilidade celular foi examinada por CCK-8 kit (Contagem celular Kit-8, Dojindo molecular Tech. Inc., Rockville, MD, EUA). A viabilidade celular em cada concentração foi representada como a mudança vezes. As alterações de dobragem são calculadas como a razão entre o valor final na presença de cada pepsina para o valor na ausência de pepsina (definido como "1"). Os valores são representados como a média ± SEM. * P Art < 0,05 vs. ausência correspondente de pepsina (0 ug /ml).

In vitro
migração ensaio

Um modelo ferida monocamada zero padrão foi usado para caracterizar a capacidade de resposta macrófagos a pepsina. RAW264.7 células foram semeadas em placas de 6 poços de cultura de tecidos, cultivadas até à confluência, e as monocamadas foram feridos por raspagem ao longo da superfície do plástico de cultura de tecidos com uma lâmina de barbear. A lâmina foi pressionado para baixo no meio do prato, cortando, assim, a camada de células e, concomitantemente, marcando o "limite de feridas" sobre o plástico subjacente. Em seguida, a lâmina foi suavemente deslizou unidireccionalmente para remover a metade da camada de células confluentes. O "monocamada ferida" foi lavado duas vezes com tampão fosfato salino pH 7,4 (PBS), re-alimentadas com meio com privação de soro contendo mitomicina 1 mM, e incubados sob condições padrão de cultura, durante 24 h.

Estatística análise

Todos os dados são apresentados como média ± SEM As comparações entre os grupos foram analisadas por bicaudal t
teste. Os valores de probabilidade ( P
) < 0,05 foram considerados significativos.

Resultados

pepsina foi expressa na amígdala

Os dados immunoblot mostrou que a proteína pepsina foi expressa como uma única banda a partir de extratos de ambas as amígdalas de pacientes com hipertrofia de amígdalas. Pepsina foi altamente expressa em várias bandas no controlo positivo de extratos de tecidos estômago. Praticamente nenhuma coloração pepsina foi observada em outros tecidos, incluindo tumor, linfonodo (LN), da tireóide (Tua), glândula parótida (parótida g.), Glândula salivar (SG) (Fig 1A). Todos os tecidos das amígdalas apresentaram um sinal positivo para pepsina (Fig 1B). No entanto, os níveis de detecção de pepsina na amígdala eram ligeiramente diferentes em cada paciente (Figura 1B). coloração imuno-histoquímica foi realizada para identificar as células de pepsina-positiva no tecido tonsilar. células pepsina positiva encontram-se selectivamente no epitélio de superfície abaixo, localizado principalmente na cripta (Fig 1C-a e b), em torno dos centros germinais mais negativos (Fig 1C-C e D), e também em torno do folículo linfóide com excessiva desenvolvimento de fibrose (figura 1C-e e F). secções de estômago utilizadas como um controlo positivo apresentou um padrão típico de coloração pepsina, predominantemente nas células glandulares (Figura 2D-A), mas não no nódulo linfático (Fig 1D-b) e da tiróide (Fig 1D-C).

as células pepsina-positivos foram detectados na amígdala danificado epitélio escamoso

para confirmar a relação com amígdalas danos epitélio escamoso e de refluxo, tentámos encontrar células pepsina positiva no epitélio tonsilar feridos ou intacta arquitetura. epitélio escamoso danificado, irregular ou quebrado, foram encontrados nos tecidos das amígdalas com hipertrofia tonsilar (Fig 2A e 2D, abaixo). células de pepsina-positivas foram detectadas nos locais lesionados (direita inserir na Fig 2A, 2D, 2E e 2F) em relação ao epitélio normal (inserção esquerda na Fig 2A e 2B). Em particular, os sinais foram fortemente encontrados em torno de fendas e danificado tonsila epitélio escamoso (linhas tracejadas na Fig 2C e 2E).
Células

TGF-p 1 e iNOS-positivas foram detectadas na amígdala de pacientes com hipertrofia de amígdalas

coloração imuno-histoquímica para TGF-β1 e iNOS foi realizada para investigar a relação entre coloração pepsina e inflamação. Ambos os sinais de TGF-p 1 e iNOS-positivos foram também detectados em regiões semelhantes a coloração pepsina, tal como no epitélio da cripta (Figura 3A e 3B), em torno dos centros germinais (Figura 3C e 3D), e em torno do folículo linfóide com excessiva desenvolvimento de fibrose (Fig 3E e 3F).

pepsina e TGF-β1 foram detectados em células CD68-positivas no tecido tonsilar hipertrofia

Conforme descrito na Introdução, a hipótese de que a coloração de pepsina na tonsila se origina a partir do estômago e pode estar relacionada com a inflamação amígdalas. coloração por imunofluorescência dupla para CD68 foi realizado para caracterizar as células de pepsina-positiva. CD68 é uma glicoproteína transmembranar de 110 kd e um marcador representativo de monócitos humanos e macrófagos de tecidos envolvidos na inflamação. As células CD68-positivas foram observados claramente na amígdala com hipertrofia de amígdalas (Fig 4). De nota, as células CD68-positivas fortemente colocalized com pepsina e células TGF-β1-positivos tanto na cripta (Fig 4A) e em torno centros germinativos (Fig 4b). Em contraste com a co-localização de pepsina e CD68, pepsina não co-localizam com linfócitos-B (CD20 positivo) nos centros foliculares e linfócitos T (CD45) nas regiões interfoliculares (Fig 4C). Estes dados, bem como o mostrado na figura 3 sugeriu que a coloração pepsina pode estar relacionada com as respostas inflamatórias na amígdala de pacientes com hipertrofia de amígdalas. E também, para revelar o principal mecanismo de lesão tonsila por mediadores inflamatórios mediados por leucócitos, incluindo macrófagos, e PBMNCs níveis para tonsilar IL-6, IL-1β e TNF-α ARNm foram analisados ​​por RT-PCR (Fig 4D). Curiosamente, todos estes foram expressos nos tecidos das amígdalas com hipertrofia tonsilar. Estes dados sugerem que o principal mecanismo de hipertrofia tonsilar pode ser causado por mediadores inflamatórios.

pepsina levou os monócitos pacientes derivadas de diferenciar a macrófagos

Para confirmar a relação da coloração pepsina e macrófagos, cultivámos células mononucleares do sangue periférico (PBMNCs) a partir de pacientes hipertróficas tonsilares em meio de cultura de macrófagos (na presença ou ausência de pepsina activada) durante 15 dias. Nós, além disso, determinados os níveis de população de monócitos, macrófagos e analisados ​​fenótipo por citometria de fluxo. macrófagos humanos são produzidos pela diferenciação de monócitos em tecidos. Eles desempenham um papel crítico na defesa não específico (imunidade inata), e também ajudar a iniciar mecanismos de defesa específicos (imunidade adaptativa) por recrutamento de outras células do sistema imunológico, tais como os linfócitos. Eles podem ser identificados usando citometria de fluxo por sua expressão específica de proteínas como marcadores de CD, incluindo CD11c e CD163. A população de monócitos inferidas a partir do lado de fluxo e dispersão para a frente (Fig 5A) foi significativamente aumentada em presença de pepsina activado (aPepsin), em comparação com nenhum aumento no dia 8, e sem aumento significativo no dia 15 (Fig 5B). Além disso, foi investigada a monócitos à diferenciação de macrófagos utilizando anticorpos CD11c e CD163. As células CD11c e CD163-positivos foram significativamente aumentados por aPepsin no dia 8 após o cultivo. Nenhum significado foi encontrado em outras condições (Fig 5C). No entanto, a população de monócitos não foi significativa e também níveis para CD11c e CD163 no grupo adulto, tanto no dia 8 e 15. Estes dados sugerem que a pepsina é potencialmente envolvida na diferenciação de macrófagos e crianças com aumento de refluxo do estômago pode ser mais expostos aos efeitos de uma ambiente pepsina do que os adultos.

pepsina induzida viabilidade de macrófagos e migração

Nós também investigou se pepsina foi envolvido em função dos macrófagos. RAW264.7 células foram cultivadas na presença ou ausência de pepsina activado durante 24 horas. Houve um aumento dependente da dose significativo na viabilidade celular RAW264.7 por pepsina (Fig 6A). A migração de células RAW264.7 também foi induzida por pepsina, tanto ferida zero e transpo� ensaios sistema de migração (Fig 6B e 6C).

Discussão

Este estudo mostrou pela primeira vez que a pepsina foi detectada no células tonsilares hipertrófica e pepsina-positivas foram localizadas no epitélio da cripta em torno do centro germinativo, e no folículo linfóide com aparência desenvolvimento fibrótico excessivo. Notavelmente, coloração pepsina foi correlacionada com a expressão de factores relacionados com a inflamação, e pepsina e CD68 colocalized, e pepsina activado levou a diferenciação de monócitos para macrófagos. [16] Esses achados apontam para potencialmente novos mecanismos fisiopatológicos hipertrofia tonsilar subjacente.

inflamação intensa é um fator de risco conhecido para a hipertrofia de amígdalas. [17] mediadores TGF-β1 e iNOS são conhecidos da inflamação. [18-20] em hipertrofia de amígdalas, o aumento na contagem de células T e B mostrou uma correlação positiva com bacteriana condes e tamanho das tonsilas. [21, 22] Em estudos epidemiológicos, tabagismo, alergias e infecções respiratórias recorrentes pode associar com transitória ou hipertrofia permanente do tecido linfóide. [22, 23] parâmetros imunológicos, predisposição genética e disfunção de linfócitos locais parecem desempenhar um papel na etiologia da amigdalite recorrente e hipertrofia das amígdalas. [22, 24] Alguns estudos demonstraram que a hipertrofia tonsilar foi associado com o aumento do tamanho linfóide folículo, mas não o número de folículos [25] e também foi relacionado ao aumento do peso das amígdalas, o aumento do folículo diâmetro, a área e número. [26]

estímulos recorrentes por agentes patogénicos, durante o processo inflamatório, levar à activação de monócitos e macrófagos. [27] os citocinas secretadas por macrófagos estimulam as células do sistema imunológico, e também causam a proliferação de células endoteliais e fibroblastos. [28] com o tempo, um tecido imunologicamente ativo é substituído por tecido fibrótico. [28] neste estudo, assumiu-se que o antígeno foi pepsina e apresentamos duas hipóteses para explicar a observação de hipertrofia tonsilar com refluxo gástrico (Fig 7). Um mecanismo poderia ser a estimulação direta dos linfócitos por pepsina de refluído que são reconhecidos como antigênica. Outro mecanismo possível envolve a lesão induzida por pepsina ao epitélio nas criptas tonsilares, o que resulta em criptite de bactérias residentes com estimulação antigénica em curso de enterócitos das criptas especializado. Estes levaria a um aumento no número de linfócitos e pode desempenhar um papel na hipertrofia tonsilar.

Inicialmente pepsina entra em contacto com o epitélio e é apresentada para os linfócitos intra-epiteliais, os linfócitos, os linfócitos subepiteliais interfoliculares e intrafoliculares , naquela ordem. Os linfócitos proliferam em resposta a agir como um antigénio pepsina, fazendo com que os folículos das amígdalas para ampliar e os tecidos das amígdalas se submeter a hipertrofia. Alternativamente, os macrófagos de tecidos tonsila reconhecer a pepsina mediada por refluxo na sua superfície celular como um corpo estranho e são activados. activação de macrófagos provoca a secreção de citoquinas pró-inflamatórias, e estas citoquinas induzem inflamação, bem como a activação do linfócito adicional, que resultam em hipertrofia tonsilar. Esta última hipótese parece ter mais apoio do que a anterior uma vez que, como mostrado na Figura 4, as células de pepsina e CD68-positivas foram co-localizada abaixo do epitélio superficial localizado na cripta (Figura 4A) e também em torno do folículo linfóide com fibrose consequente excessiva (Fig 4B). No entanto, pouca correlação com pepsina e CD20 e CD45, como marcadores de células B e T, respectivamente, foi observada no tecido tonsilar (Figura 4C).

também avaliada a expressão de CD163 de cultura PBMNCs com hipertrofia tonsilar . CD163 é expressa apenas pelos macrófagos maduros, mas ausente em monócitos. Nós PBMNCs cultivadas durante 8 e 15 dias na presença de 10% de FCS e 10 ng /ml de M-CSF, seguindo condições padrão para a cultura de macrófagos humanos. Resultados do in vitro
PBMNCs estudos de cultura mostrou que no grupo infantil, o número de células CD163-positivas foram significativamente maiores na presença de pepsina ativado como células CD11c-positivo também. Em comparação, não houve diferença na expressão de CD11c e CD163, a partir da cultura de PBMNCs de adultos (Fig S1). Estes dados sugerem que uma reacção de PBMNC com pepsina activado em crianças pode ser mais sensível do que em adultos. Embora nós não podemos explicar qual mecanismo induzida por pepsina está envolvida na diferenciação de macrófagos, não podemos descartar que a própria diferenciação de macrófagos poderia acelerar danos amígdalas mediada por refluxo.

De acordo com o estudo, o refluxo mediada por pepsina causar não só dano direto ao epitélio tonsilar, mas também estimularam os macrófagos tonsilar ou células epiteliais tonsilares a secretar quimiocinas /citocinas que atraíram e ativadas as células do sistema imunológico que mediaram alguns dos danos na mucosa das amígdalas. inflamação microscópica, caracterizado por TGF- β1 e expressão de iNOS no tecido tonsilar (enterócitos das criptas, em torno do centro germinativo, e a folículos linfóides com excessivo desenvolvimento aparência fibrótica), é observada em doentes com sintomas severos (dados não mostrados). Isto implica que a pepsina (ácido e) produção induzida de IL-8 e outros mediadores inflamatórios pelo refluído promover a migração e activação de leucócitos do sangue periférico. [14] Estes resultados corroboram a hipótese de que um mecanismo mediado por citoquinas é responsável pela lesão amígdalas em crianças com hipertrofia das amígdalas. A mucosa de pacientes com hipertrofia tonsilar produz significativamente grandes quantidades de várias citocinas. [29, 30] Estes mediadores inflamatórios activar o recrutamento de células imunitárias e a migração para os sítios de interacção do refluxo e pode estar envolvido na patofisiologia da hipertrofia de amígdalas.

com base nas conclusões da literatura e os nossos resultados obtidos neste estudo, propomos que a ativação local e sistêmica de vias inflamatórias irá promover a infiltração de linfócitos e proliferação (incluindo células T), juntamente com a diferenciação de macrófagos e proliferação resultando em hipertrofia tonsilar do aumento monocítica e os números de células linfocíticas. Se os dados actuais provar ser preciso, eles podem fornecer um alvo viável para o desenvolvimento de abordagens intervencionais para o tratamento ou prevenção de hipertrofia tonsilar em crianças. Apesar da evidência considerável para mediadores inflamatórios e proliferação de linfócitos na patogênese da hipertrofia de amígdalas, a interação entre hipersensibilidade ao refluxo pepsina e inflamação tonsilar permanece incerto neste estudo. Mais estudos são necessários para entender melhor as vias de sinalização envolvidos na gênese dos sintomas de refluxo e inflamação e para identificar, juntamente com o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas.

Conclusões

Foi estabelecido que os linfócitos e monócitos estão em um estado altamente proliferativo nas amígdalas com hipertrofia tonsilar e associada com a expressão aumentada dos factores pró-inflamatórias, como resultado de exposição a pepsina refluxo gástrico. Esses achados apontam para potencialmente novos mecanismos fisiopatológicos subjacentes hipertrofia tonsilar. De nossos in vitro
dados, estabelecemos que pode haver a possibilidade de caracterização objectiva dos mecanismos envolvidos, a fim de desenvolver tratamentos específicos para esta indicação doença. Nossos dados sugerem que os mecanismos subjacentes a proliferação do tecido linfóide na hipertrofia das amígdalas são distintas e podem permitir intervenções terapêuticas não-cirúrgicas futuras visando a pepsina que pode eliminar a necessidade de uma amigdalectomia, e levando a involução das amígdalas hipertróficas.

Informações de Apoio
S1 Fig. Citometria de fluxo e população de monócitos e diferenciação de monócitos de PBMNCs de adultos com amigdalite crônica.
Linfócitos e monócitos foram identificados com o lado e dispersão para a frente. Linfócitos e monócitos também foram confirmadas por coloração com CD4 e CD8 e anticorpos CD14. PBMNCs foram cultivadas em condições de cultura específica de macrófagos com ou sem pepsina activado durante 15 dias. população de monócitos foi identificado a partir do lado e perfis de dispersão para a frente em citometria de fluxo em cada condição. Cada nível foi comparado com o valor do dia 8 células na ausência de pepsina que foi dado um valor arbitrário de "1". Monócitos à diferenciação de macrófagos foi examinado por coloração com anticorpos CD11c e CD163
doi:. 10.1371 /journal.pone.0152336.s001
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