PLoS ONE: Extra-Esophageal Pepsin fra magen refluksatet Fremmes Mandel Hypertrofi

Abstract

Bakgrunn

gastroøsofageal refluks er assosiert med en rekke patologiske tilstander i øvre aerodigestive kanalen. Gastric pepsin innen reflux bidrar til immunologiske reaksjoner i mandel. I denne studien ønsket vi å finne sammenhengene mellom pepsin og tonsillar hypertrofi.

Metoder og finne

Vi har utforsket ideen om tonsill- hypertrofi skyldtes pepsin-mediert gastrisk refluks i mandel hypertrofi. Femti-fire barn med mandel hypertrofi og 30 voksne med betennelse i mandlene ble rekruttert før kirurgisk behandling. Blod og mandel vev fra hver pasient ble høstet for analyse av endringer i lymfocytter og makrotall kombinert med histologiske og biokjemiske analyser. Pepsin ble uttrykt ved forskjellige nivåer i mandel vev fra hver tonsill- hypertrofi. Pepsin-positive celler ble funnet i krypten epitel, rundt lymfoid hårsekken med å utvikle fibrose, og også rundt lymfoid hårsekken som møtte krypten. Og også, var pepsin farging godt korrelert med skadet tonsill- plateepitel og TGF-β1 og iNOS uttrykk i mandel delen. I tillegg, pepsin og TGF-β1-positive celler ble ko-lokalisert med CD68-positive celler i krypten og omkringliggende germinale sentre. Ved sammenligning av makrofag respons til pepsin, perifere mononukleære blodceller (PBMNCs) var merkbart større i nærvær av aktivert pepsin i barnets gruppe. Videre CD11c og CD163-positive celler ble signifikant økt med aktivert pepsin. Dette ble imidlertid ikke sett for kultur PBMNCs fra den voksne gruppen.

Konklusjoner

De lymfocytter og monocytter er i en svært proliferativ stat i tonsill- hypertrofi og forbundet med økt uttrykk av pro inflammatorisk faktorer som følge av eksponering for mage reflux pepsin

Citation:. Kim JH, Jeong HS, Kim KM, Lee YJ, Jung MH, Park JJ et al. (2016) Extra-Esophageal Pepsin fra magen refluksatet Forfremmet Mandel Hypertrofi. PLoS ONE 11 (4): e0152336. doi: 10,1371 /journal.pone.0152336

Redaktør: Gernot Zissel, Universitätsklinikum Freiburg, Tyskland

mottatt: 5 oktober 2015; Godkjent: 11 mars 2016; Publisert: 08.04.2016

Copyright: © 2016 Kim et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer

Finansiering:. Denne studien ble støttet av Basic Science Research Program, gjennom National Research Foundation of Korea (NRF), finansiert av departementet for vitenskap, IKT, og Future Planning (2013R1A1A1012542). Denne studien ble også støttet av de ledende utenriks Research Institute rekrutteringsprogram, gjennom National Research Foundation of Korea (NRF), finansiert av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi (MEST) (2012K1A4A3053142)). Dette arbeidet ble støttet av biomedcal forskningsinstitutt fondet (GNUHBIF-2014-0009) fra Gyeongsang National University Hospital. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

mandel hypertrofi er i dag den vanligste årsaken til mandlene. Utvidelse av mandlene oppstår på grunn av en absolutt økning i totalt antall lymfocytter i vev og resulterer i en økning i vev volum. [1, 2] Den nøyaktige mekanismen ved hvilken lymfocytt stimulering og proliferasjon oppstår har ennå ikke bestemt. Det har blitt antydet at antigene stimulering av vev lymfocytter fører til en økning i lymfatisk antall og aktivitet. Tidligere forsøk på å identifisere de patofysiologiske mekanismene har fokusert på mikrobiologiske og immunologiske endringer i forstørret mandlene. Mange studier har rapportert en mulig rolle av bakterielle organismer i patogenesen av mandel hypertrofi. [3-5] Det er imidlertid en økning i det absolutte antall lymfocytter i mandlene uten en klinisk infeksjon ble tidligere vist [2], og de spesifikke antigener ansvarlig for disse endringene har ikke blitt identifisert.

Nyere forskning har sett på forholdet mellom extraesophageal refluks og øvre luftveislidelser. Kronisk sinusitt [6], otitis media med effusjon [7-9] og laryngeale lidelser har alle blitt studert med mulige etiologiske linker til extraesophageal tilbakeløp. [10, 11] inneholder refluksatet mage-enzymer (pepsin og HCl) samt duodeno-pankreatisk enzymer (galle syrer og trypsin). Rollen til pepsin i magesyren som en del av refluksatet og samhandling med Otolaryngologisk systemer og i ØNH organer (øre, nese og hals) har blitt grundig studert. [1, 10, 11]

Pepsin er et enzym konvertert fra pepsinogen, som er produsert ved den øverste celle i magen, og spiller en viktig rolle i fordøyelsen. Normalt er pepsin bare funnet i mageinnholdet. Men hvis extraesophageal tilbakeløp skjer, mageinnholdet fra den tilbakeløps kan nå laryngopharynx, og pepsin som en del av magesekken tilbakeløps kan påvises i de laryngofaryngeal områdene. Dette er faktisk tilfelle i Johnston et al. [12] rapporterte at pepsin ble påvist i øvre luftveier slimhinnen og induserer et proinflammatorisk cytokin syklus, noe som resulterer i inflammatoriske skader på laryngeal mucosa. Disse dataene har foreslått en rolle for tilbakestrømmet pepsin i nedbryting av immunforsvarsmekanisme i slimhinnene eller epitelceller foringer og markedsføring av inflammatoriske forårsaker agenter. [12-15]

Tilsvarende for mandel, vi hypotese at mage pepsin innen reflux har en nøkkelrolle i sin immunologisk reaksjon av mandel og at pepsin eksponering induserer mandel hypertrofi. I denne studien ønsket vi å finne forholdet mellom mage pepsin og tonsillar hypertrofi.

Materialer og metoder

Etikk uttalelse

Denne studien ble godkjent av Gyeongsang National University Hospital Institutional Review Board (# GNUHIRB-2014-02-006). Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter (eller foreldre) før deres inkludering i studien.

forsøkspersonene

Denne studien ble utført på 84 pasienter med den kliniske diagnosen tonsillar hypertrofi. De besøker vårt sykehus for fjerning av mandel fordi de lider av kronisk betennelse i mandlene eller snorking /søvnapné grunn av mandel utvidelse. Alle pasientene gjennomgikk fysisk undersøkelse for å bekrefte diagnosen av tonsill- hypertrofi eller kronisk betennelse i mandlene. Den gjennomsnittlige størrelsen på mandel var karakteren 2,5 i mandel hypertrofi gruppe og klasse 1.0 i kronisk betennelse i mandlene gruppe. (Tabell 1). Vi fikk mandel vev fra 54 barn før sin kirurgisk behandling (41 gutter og 13 jenter, i alderen 4-16 år, gjennomsnittsalder 8 år) og fra 30 voksne (17 hanner og 13 hunner, aldersgruppe 17 og over, mener alder 29 år). Pasienter med systemiske lidelser og andre kliniske problemer ble ikke inkludert i denne studien. Hele mandlene ble utført under narkose ved hjelp av disseksjon metode og mindreverdig del av mandel ble valgt for vevsprøver. Ingen hadde noen postoperative komplikasjoner

Protein forberedelse og immunoblotanalyse

vevsekstrakter fra mandlene ble fremstilt som følger: a. Mandlene ble fjernet og homogenisert i lyseringsbuffer bestående av PBS (pH 7,4), 1 % Triton X-100, 1 mM EDTA inneholdende 10 uM leupeptin og 200 uM fenylmetylsulfonylfluorid. Lysatene ble ultralydbehandlet flere ganger i 3 til 5 minutter hver og sentrifugert ved 12000 rpm i 20 minutter ved 4 ° C. Supernatantene ble oppsamlet, og proteinkonsentrasjonen av hvert lysat ble bestemt ved anvendelse av en bicinchoninic syre (BCA) proteinanalysesett (Pierce, Rockford IL, USA) i henhold til produsentens protokoll. Bovint serumalbumin ble anvendt som en standard. Like mengder av protein (50 ug) ble lastet på en 10% natriumdodecylsulfat (SDS) polyakrylamid gel. Etter elektroforese ble proteinene i gelen overført på en nitrocellulosemembran (Schleicher &Schuell, Dassel, Tyskland). Membranene ble blokkert med 5% ikke-fettholdig melk i Tris-bufret saltvann inneholdende 0,1% Tween-20. Blottene ble probet med primære antistoffer til polyklonalt anti-Pepsin A (SC-99081, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) ved 4 ° C over natten. Som et laste kontroll, blottene ble gjen probet med anti-β-aktin-antistoff (Sigma, St. Louis MO, USA). Det primære antistoff ble visualisert ved hjelp av sekundære antistoffer (pepperrot peroksidase-konjugert geit anti-kanin IgG, 1: 10000, Pierce) med en ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)

Immunhistokjemi
.

Farging ble utført på 5 mm tykke koronale deler av paraformaldehydfiksert og parafin-embedded seksjoner ved hjelp av avidin-biotinylert-pepperrot peroksidase-kompleks kits (ABC, Vector Laboratories, Burlingame CA, USA). Etter deparaffinization i xylen ble snittene rehydrert med etanol. Etter vasking i PBS ble seksjonene blokkert med 1% normalt geiteserum og ble deretter behandlet med et anti-Pepsin A (SC-99081, Santa Cruz), iNOS, TGF-β1, og CD68-antistoffer som er kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology ved 4 ° C natten over i et fuktet kammer. Etter vasking i PBS, ble de inkubert i 90 minutter ved romtemperatur med sekundært antistoff (Santa Cruz Biotechnology, biotin-konjugert anti-kanin-immunoglobulin G, 1: 200). Til slutt ble seksjonene inkubert med ABC i 60 min ved romtemperatur, skylt i PBS, og deretter fremkalt med 0,027% 3,3'-diaminobenzidin tetrahydroklorid (Sigma) med 0,003% hydrogenperoksid. Seksjonene ble kontra med hematoxylin (Sigma).

Double immunfluorescens farging

For å karakter pepsin A-positive celler, ble dobbelt immunfluorescens utført på mandel vev. Deparaffinization og gjenfinning antigen ble utført. Ikke-spesifikk antistoff-binding ble blokkert i PBS med 0,1% normalt esel serum (Vector Laboratories) og 0,3% Triton X-100 (Sigma) i 45 min. Seksjonene ble deretter inkubert med anti-pepsin A-antistoff (1: 100; sc-99081, Santa Cruz) fortynnet i PBS inneholdende 0,1% bovint serumalbumin (Sigma) ved 4 ° C over natten. Etter skylling, esel Cy3-konjugert anti-kanin-IgG sekundært antistoff (1: 100; EMD Millipore, Billerica, MA, USA) ble påført i 1 time ved romtemperatur. For dobbel merking, etter blokkering i PBS inneholdende 10% normalt geiteserum og 0,3% Triton X-100 ble snittene inkubert med anti-CD68 (1: 100, Santa Cruz) ved 4 ° C over natten. Alexa488-konjugert anti-mus IgG sekundært antistoff (1: 100; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ble deretter påført i 1 time ved romtemperatur. Snittene ble montert med anti-fading oppløsning inneholdende 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (Vector Laboratories), og observert under et fluorescens mikroskop (Carl Zeiss Mikros GmbH, Jena, Tyskland). For å karakterisere CD68-positive celler, var dobbelt immunofluorescens utført, som beskrevet ovenfor. For dobbel merking, anti-TGF-β1 (1: 100, Santa Cruz) og anti-iNOS (1: 100, Santa Cruz) ble påført og deretter esel Cy3-konjugert anti-kanin-IgG sekundært antistoff (1: 100; EMD Millipore ) på CD68-fargede seksjoner.

Revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR)

Total RNA ble ekstrahert fra mandel vev ved hjelp av TRIzol fremgangsmåten i henhold til protokollen anbefalt av fabrikanten ( GIBCO, Grand Island, New York). Like mengder (5 ug) av DNA-fri total RNA fra hver prøve ble omdannet til cDNA ved anvendelse av 200 enheter av Superscript II RT (GIBCO, Grand Island, New York) i et 20 pl reaksjonsvolum. Revers transkripsjon ble utført ved 22 ° C i 10 min, ved 42 ° C i 45 minutter, og ved 95 ° C i 5 min. Reaksjonsproduktene (2,0 ul) ble underkastet PCR-amplifisering (Promega, Madison, WI, USA) i et 50 pl reaksjonsvolum. Hver primer-sekvenser var som følger: IL-1β (189 bp) 5'-TCATTGCTCAAGTGTCTGAAGC-3 '(sense) og 5'-TGGTCGGAGATTCGTAGC-3' (antisense); IL-6 (628 bp) 5'-ATGAACTCCTTCTCCACAAGCGC-3 '(sense) og 5'-GAAGAGCCCTCAGGCTGGACTG-3' (antisense); TNF-β (443 bp) 5'-AGTGACAAGCCTGTAGCCC-3 '(sense) og 5'-GCAATGATCCCAAAGTAGACC-3' (antisens). PCR ble utført ved hjelp av BioRad termosykleren i henhold til instruksjonene fra produsenten. Like volumer av amplifiseringsproduktene ble analysert ved 1,5% agarose-gelelektroforese med 0,5 mg /ml av ethidiumbromid farving.

Strømningscytometrisk analyse og in vitro dyrking

alle blodprøver ble behandlet innen 2 timer etter inntak av blod. Perifere mononukleære blodceller (PBMNCs) ble isolert ved tetthetsgradient sentrifugering over en Ficoll-gradient (Sigma, St. Louis MO, USA) i 25 minutter ved 2300 rpm og ble vasket tre ganger i PBS. PBMNCs ved 1 x 10 ^{5-celler ble deretter analysert ved hjelp av strømningscytometri. Enten pepsin er involvert i monocytt- til makrofag differensiering, ble de gjenværende cellene sådd ut på kulturskåler i nærvær /eller fravær av aktivert pepsin (Thermo vitenskapelig, Rockford IL, USA) inneholdende monocytt dyrkningsbetingelser. For å identifisere graden av makrofag befolkning, etter 8 og 15 dager, ble cellene høstet og analysert ved strømningscytometri ved å bruke antistoff for CD11c og CD163. Alle cellekulturer ble opprettholdt ved 37 ° C med 5% CO _{2 i en fuktig atmosfære.}}

Celleviabilitet

RAW264.7 celler, mus makrofag-lignende cellelinje, ble dyrket for å undersøke effekten av pepsin på makrofag-proliferasjon. Cellene ble behandlet i forskjellige konsentrasjoner av pepsin (0,01-5 ug /ml) og cellelevedyktigheten ble undersøkt ved hjelp av CCK-8 kit (Celletelling Kit-8, Dojindo Molecular Tech. Inc., Rockville, MD, USA). Celleviabilitet i hver konsentrasjon ble representert som ganger endring. Brette endringer er beregnet som forholdet av den endelige verdi i hver nærvær av pepsin til verdien i fravær av pepsin (angitt som «1»). Verdier er representert som gjennomsnitt ± SEM. * P
< 0,05 vs. tilsvarende fravær av pepsin (0 mikrogram /ml).

In vitro
migrasjon analysen

En standard mono scratch såret modellen ble brukt for å karakterisere responsen makrofager til pepsin. RAW264.7 celler ble sådd i 6-brønns vevskulturplater, dyrket til konfluens, og monolagene ble såret ved å skrape langs overflaten av vevskultur plast med et barberblad. Bladet ble presset ned i midten av tallerken, og dermed kutte cellelaget og samtidig markerer "viklet grense" på den underliggende plast. Da bladet ble forsiktig skjøvet i én retning for å fjerne halvparten av det sammenflytende cellelaget. Den "såret mono" ble vasket to ganger med fosfat-bufret saltvann pH 7,4 (PBS), på ny tilført 1 mM mitomycin-inneholdende serum-belastede medium, og inkubert under standard dyrkningsbetingelser i 24 timer.

Statistisk analyse

Alle data er presentert som gjennomsnitt ± SEM Sammenligninger mellom gruppene ble analysert ved to-tailed t
test. Sannsynlighets verdier ( P
) < 0,05 ble betraktet som signifikant.

Resultater

Pepsin ble uttrykt i mandel

Immunoblotanalyse data viste at pepsin protein ble uttrykt som en eneste band fra ekstrakter av både mandel av pasienter med mandel hypertrofi. Pepsin ble sterkt uttrykt som flere band i positiv kontroll over magen vev ekstrakter. Nesten ingen pepsin farging ble observert i andre vev, inkludert tumor, lymfeknute (LN), skjoldbruskkjertelen (Thy), parotidkjertelen (Parotid g.), Spyttkjertel (SG) (fig 1A). Alle av mandel vev viste et positivt signal for pepsin (figur 1B). Men deteksjonsnivå pepsin i mandel var litt annerledes i hver pasient (fig 1B). Immunhistokjemisk farging ble utført for å identifisere de pepsin-positive celler i mandel vev. Pepsin-positive celler er selektivt funnet i den under overflaten epitel, hovedsakelig lokalisert i krypten (figur 1C-a og b), som omgir de negative germinale sentre (figur 1C-c og d), og også omgir den lymfoide follikkel med overdreven utvikle fibrose (fig 1C-e og f). Mage seksjoner anvendt som en positiv kontroll viste et typisk mønster av pepsin flekker, hovedsakelig i kjertelceller (figur 2D-a), men ikke i lymfeknute (figur 1D-b) og skjoldbruskkjertelen (figur 1D-c).

de pepsin-positive celler ble oppdaget i den skadede mandel plateepiteldysplasi

for å bekrefte forholdet med mandel plateepiteldysplasi skader og reflux, vi prøvde å finne pepsin-positive celler i den skadde eller intakt tonsill- epithelial arkitektur. Skadet plateepitel, uregelmessig eller ødelagt, ble funnet i mandel vev med tonsill- hypertrofi (Fig 2A og 2D, nedenfor). Pepsin-positive celler ble detektert i de skadede områder (til høyre sett i figur 2A, 2D, 2E og 2F) sammenlignet med normal epitel (venstre innsatsen i figur 2A og 2B). Spesielt ble de signaler som sterkt funnet rundt kløfter og skadet tonsiller skjellepitel (stiplede linjer på figur 2C og 2E).

TGF-ß1 og iNOS-positive celler ble detektert i den mandel av pasienter med mandel hypertrofi

Immunohistokjemisk farging for TGF-β1 og iNOS ble utført for å undersøke forholdet mellom pepsin farging og betennelse. Både TGF-ß1 og iNOS-positive signaler ble også påvist i områdene som ligner på pepsin flekker, slik som i krypten epitelet (figur 3A og 3B), som omgir de germinale sentre (figur 3C og 3D), og omgir den lymfoide follikkel med overdreven utvikle fibrose (fig 3E og 3F).

pepsin og TGF-β1 ble påvist i CD68-positive celler i mandel hypertrofi vev

som beskrevet i innledningen, hypotese vi at pepsin flekker i mandel stammer fra magen, og kan være relatert til mandel betennelse. Dobbel immunfluorescens farging for CD68 ble utført for å karakterisere de pepsin-positive celler. CD68 er en 110-Kd trans glykoprotein og en representant markør av humane monocytter og vev makrofager involvert i betennelsen. CD68-positive celler ble klart observert i mandel med mandel hypertrofi (figur 4). Av notatet, CD68-positive celler sterkt colocalized med pepsin og TGF-β1-positive celler både i krypten (Fig 4A) og omliggende germinalsentre (fig 4B). I motsetning til colocalization av pepsin og CD68, pepsin ikke co-lokalisere med B-lymfocytter (CD20 positive) i follicular sentre og T-lymfocytter (CD45) i interfollicular regioner (figur 4C). Disse data, i tillegg til den som er vist i figur 3 antydet at pepsin flekker kan være relatert til de inflammatoriske responser i mandel av pasienter med mandel hypertrofi. Og også, for å vise den store mekanismen for mandel skade ved inflammatoriske mediatorer som medieres av hvite celler, inkludert PBMNCs og makrofager, nivåer for tonsill- IL-6, ble IL-1β og TNF-α mRNA undersøkt ved hjelp av RT-PCR (figur 4D). Interessant nok var alle av disse uttrykt i mandel vev med tonsill- hypertrofi. Disse dataene tyder på at de store mekanisme tonsill- hypertrofi kan være forårsaket av inflammatoriske mediatorer.

Pepsin kjørte pasientenes-avledet monocytter til å differensiere til makrofager

For å bekrefte forholdet mellom pepsin flekker og makrofager, vi dyrket perifere mononukleære blodceller (PBMNCs) fra tonsillare hypertrofiske pasienter i makrofag dyrkningsmedium (i nærvær eller fravær av aktivert pepsin) i 15 dager. Vi har videre fastslått nivåer av monocytt befolkning, og analysert makrofag-fenotype ved strømningscytometri. Humane makrofager er produsert av differensieringen av monocytter i vev. De spiller en avgjørende rolle i uspesifikke forsvar (medfødt immunitet), og også bidra til å iverksette spesifikke forsvarsmekanismer (adaptiv immunitet) ved å rekruttere andre immunceller som lymfocytter. De kan identifiseres ved hjelp av flowcytometri av deres spesifikke uttrykk av proteiner som CD markører inkludert CD11c og CD163. Populasjonen av monocytter utledet fra strømningssiden og fremover scatter (figur 5A) var signifikant økt i nærvær av aktivert pepsin (aPepsin), sammenlignet med ingen økning på dag 8, og ingen signifikant økning på dag 15 (figur 5B). I tillegg, undersøkte vi monocytt til makrofag-differensiering ved hjelp av CD11c og CD163 antistoff. De CD11c og CD163-positive celler ble signifikant økt med aPepsin på dag 8 etter dyrking. Uten betydning ble funnet i andre forhold (figur 5C). Men monocytt befolkningen var ikke signifikant, og også nivåer for CD11c og CD163 i voksen gruppe både på dag 8 og 15. Dette data tyder på at pepsin er potensielt involvert i makrofag differensiering og barn med økt mage reflux kan være mer utsatt for virkningene av en pepsin miljø enn voksne.

pepsin indusert makrofag levedyktighet og migrasjon

Vi undersøkte også om pepsin var involvert i makrofagfunksjon. RAW264.7 celler ble dyrket i nærvær eller fravær av aktivert pepsin i 24 timer. Det var en signifikant doseavhengig økning i RAW264.7 celleviabilitet av pepsin (figur 6A). Migrasjon av RAW264.7 celler ble også indusert av pepsin i både scratch såret og Transwell migrasjon systemanalyser (fig 6B og 6C).

Diskusjoner

Denne studien først viste at pepsin ble påvist i hypertrofisk mandel og pepsin-positive celler ble lokalisert i krypten epitel rundt germinal sentrum, og i lymfoid hårsekken med overdreven utvikling av fibrotisk utseende. Spesielt ble pepsin farging korrelert med uttrykk av betennelsesrelaterte faktorer, og pepsin og CD68 colocalized, og aktivert pepsin førte til differensiering av monocytter til makrofager. [16] Disse funnene peker mot potensielt nye patofysiologiske mekanismene bak tonsillar hypertrofi.

intens betennelse er en kjent risikofaktor for mandel hypertrofi. [17] TGF-β1 og iNOS er kjent mediatorer av inflammasjon. [18-20] i hypertrofisk mandlene, økningen i T- og B-celler viste en positiv korrelasjon med bakteriell teller og mandel størrelse. [21, 22] i epidemiologiske studier, røyking, allergier og tilbakevendende luftveisinfeksjoner kan assosiere med forbigående eller permanent hypertrofi av lymfatisk vev. [22, 23] Immunologiske parametre, genetisk predisposisjon og lokale lymfocytt dysfunksjon synes å spille en rolle i etiologien av tilbakevendende betennelse i mandlene og tonsillar hypertrofi. [22, 24] Noen studier har vist at tonsill- hypertrofi ble assosiert med økt lymfatisk follicle størrelse, men ikke antall follikler [25] og ble også knyttet til økt mandel vekt, økt hårsekken diameter, området og antall. [26]

vendende stimuli hos patogene agens, i løpet av den inflammatoriske prosessen, fører til aktivering av monocytter og makrofager. [27] cytokinene utskilt av makrofager stimulere immunceller, og også forårsake proliferasjon av endotelceller og fibroblaster. [28] med tiden, en immunologisk aktiv vev er erstattet av fibrotisk vev. [28] i denne studien, antok vi at antigenet ble pepsin, og vi fremsatt to hypoteser for å forklare observasjon av tonsillare hypertrofi med gastrisk refluks (figur 7). En mekanisme kan være direkte stimulering av lymfocytter ved pepsin av refluksatet som er anerkjent som antigen. En annen mulig mekanisme medfører pepsin-indusert skade på epitelet i tonsillar krypter, noe som resulterer i kryptitt fra hjemmehørende bakterier med pågående antigenisk stimulering av spesialisert krypten epitel. Dette ville føre til en økning i antallet lymfocytter, og kan spille en rolle i tonsill- hypertrofi.

å begynne med pepsin kommer i kontakt med epitelet og blir presentert for de intraepitelial lymfocytter, de subepiteliale lymfocytter, interfollicular og intrafollicular lymfocytter , i den rekkefølgen. Lymfocyttene deretter sprer svar på pepsin fungerer som et antigen, forårsaker tonsillar follikler å forstørre og mandel vev til å gjennomgå hypertrofi. Alternativt, tonsil-vevsmakrofager gjenkjenne tilbakeløps-mediert pepsin på deres celleoverflate som et fremmedlegeme og blir aktivert. Makrofagaktivering forårsaker sekresjon av proinflammatoriske cytokiner, og disse cytokiner induserer inflammasjon samt ytterligere lymfocyttaktivering, som resulterer i tonsillar hypertrofi. Denne sistnevnte hypotese synes å ha mer støtte enn den førstnevnte siden som vist i figur 4, pepsin og CD68-positive celler ble colocalized under overflaten epitelet som ligger i krypten (figur 4A), og også omgir den lymfoide follikkel med overdreven påfølgende fibrose (Fig 4B). Men svis liten sammenheng med pepsin og CD20 og CD45, som markører av B og T-celler, ble observert i mandel vev (fig 4C).

Vi har også vurdert uttrykk for CD163 fra PBMNCs kultur med tonsill- hypertrofi . CD163 uttrykkes bare av eldre makrofager, men fraværende på monocytter. Vi dyrket PBMNCs i 8 og 15 dager i nærvær av 10% FCS og 10 ng /ml M-CSF, ved å følge standard betingelser for kultur av humane makrofager. Resultater av in vitro
PBMNCs kulturstudier viste at i barnets gruppe, CD163-positive celleantall var signifikant høyere i nærvær av aktivert pepsin, samt CD11c-positive celler. Til sammenligning var det ingen forskjell i ekspresjonen av CD11c og CD163 fra kulturen av PBMNCs fra voksne (S1 Fig). Disse data antydet at en PBMNC reaksjon aktivert pepsin hos barn kan være mer følsomme enn hos voksne. Selv om vi ikke kan forklare som pepsin-indusert mekanisme er involvert i makrofag differensiering, kan vi ikke utelukke at makrofag differensiering selv kunne akselerere reflux-mediert mandel skade.

Ifølge studien, pepsin-mediert reflux forårsaker ikke bare direkte skade på tonsill- epitel, men også stimulert tonsillar makrofager eller tonsillære epitelceller å skille chemokiner /cytokiner som tiltrakk og aktiverte immuncellene som formidlet noe av skader på mandel slimhinnen. Mikroskopisk betennelse, preget av TGF-β1 og iNOS uttrykk i mandel vev (krypten epitel, rundt germinal sentrum, og lymfoid hårsekken med overdreven utvikling av fibrotisk utseende), er observert hos pasienter med alvorlige symptomer (data ikke vist). Dette innebærer at pepsin (og syre) -indusert produksjonen av IL-8 og andre inflammatoriske mediatorer av refluksatet fremme migrering og aktivering av perifere blodleukocytter. [14] Disse funn underbygger hypotesen om at en cytokin-mediert mekanisme er ansvarlig for mandel skade hos barn med tonsillar hypertrofi. Slimhinnene av pasienter med tonsill- hypertrofi produserer betydelig store mengder forskjellige cytokiner. [29, 30] Disse inflammatoriske mediatorer aktivere immunceller rekruttering og migrasjon til nettstedene til refluksatet samhandling og kan være involvert i patofysiologien av mandel hypertrofi.

Basert på funn fra litteraturen og våre resultater i denne studien foreslår at lokal og systemisk aktivering av inflammatoriske trasé vil fremme lymfocytt infiltrasjon og spredning (inkludert T-celler) sammen med makrofag differensiering og spredning som resulterer i tonsill- hypertrofi av økt monocytic og lymfatisk celle tall. Dersom de gjeldende resultatene viser seg å være nøyaktig, kan de tilveiebringe en levedyktig mål for utvikling av intervensjonsfremgangsmåter for behandling eller forebygging av tonsillare hypertrofi hos barn. Til tross for den betydelige bevis for inflammatoriske mediatorer og lymfocyttproliferasjon i patogenesen av mandel hypertrofi, samspillet mellom overfølsomhet for pepsin reflux og tonsill- betennelse fortsatt uklart i denne studien. Videre studier er garantert å bedre forstå de signalveier involvert i dannelsen av reflux symptomer og betennelse, og å identifisere sammen med utvikling av nye terapeutiske tilnærminger.

Konklusjoner

Vi etablerte at lymfocytter og monocytter er i et høyt proliferativ tilstand i mandlene med tonsill- hypertrofi og forbundet med økt ekspresjon av pro-inflammatoriske forhold som et resultat av eksponering for gastrisk refluks pepsin. Disse funnene peker på potensielt nye patofysiologiske mekanismene bak tonsillar hypertrofi. Fra våre in vitro
data, etablerer vi at det kan være mulighet for objektiv karakterisering av de involverte for å utvikle spesifikke behandlinger for denne sykdommen indikasjon mekanismer. Våre data antyder at mekanismene bak lymfoid vev proliferasjon i tonsill- hypertrofi er forskjellig og kan gi rom for fremtidig ikke-kirurgiske terapeutiske intervensjoner målretting pepsin som kan eliminere behovet for en mandlene, og som fører til involusjon av de hypertrofiske mandlene.

Hjelpemiddel Informasjon
S1 fig. Flowcytometrisk analyse av monocytt befolkning og monocytt differensiering fra PBMNCs av voksne med kronisk betennelse i mandlene.
Lymfocytter og monocytter ble identifisert med side og fremover scatter. Lymfocytter og monocytter ble også bekreftet ved farging med CD4 og CD8 og CD14-antistoffer. PBMNCs ble dyrket i makrofag-spesifikke dyrkningsforhold, med eller uten aktivert pepsin i 15 dager. Monocytter befolkningen ble identifisert fra siden og fremover scatter profiler i flowcytometri i hver tilstand. Hvert nivå ble sammenlignet med verdien på dag 8 celler i fravær av pepsin som ble gitt en tilfeldig verdi på "1". Monocyte å makrofag differensiering ble undersøkt ved farging med CD11c og CD163 antistoffer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0152336.s001 plakater (TIF)

• PLoS ONE: Geometriske blanding, Peristaltikk, og den geometriske fase av Stomach
• PLoS ONE: Tarm Stem Cell Markers i tarm Metaplasi av magen og Barretts øsofagus