PLoS ONE: Extra-esophageal Pepsin fra mave Refluxate Fremmes Tonsil Hypertrophy

Abstrakt

Baggrund

gastroøsofageal refluks er forbundet med en række patologiske tilstande i øvre aerodigestive tarmkanalen. Gastrisk pepsin inden tilbagesvaling bidrager til immunologiske reaktioner i tonsil. I denne undersøgelse, vi havde til formål at finde forholdet mellem pepsin og tonsillar hypertrofi.

Metoder og finde

Vi udforskede begrebet om tonsillar hypertrofi skyldtes pepsin-medieret gastrisk reflux hos tonsil hypertrofi. Fifty-fire børn med tonsil hypertrofi og 30 voksne med halsbetændelse blev ansat før kirurgisk behandling. Blod og tonsil væv fra hver patient blev høstet til analyse af ændringer i lymfocyt og makrofag numre kombineret med histologisk og biokemisk analyse. Pepsin blev udtrykt på forskellige niveauer i tonsil væv fra hvert tonsillar hypertrofi. Pepsin-positive celler blev fundet i krypten epitel, der omgiver den lymfoide follikel med udviklingslande fibrose og også omkring den lymfoide follikel, der står krypten. Og også blev pepsin farvning godt korreleret med beskadiget tonsillær pladeepithel og TGF-β1 og iNOS-ekspression i tonsil sektion. Desuden pepsin og TGF-β1-positive celler blev co-lokaliseret med CD68-positive celler i krypten og omkringliggende kimcentre. I sammenligning af makrofag respons over for pepsin, perifere mononukleære blodceller (PBMNCs) var mærkbart større i nærværelse af aktiveret pepsin i barnets gruppen. Endvidere blev CD11c og CD163-positive celler steg betydeligt med aktiveret pepsin. Dette blev dog ikke set til dyrkning af PBMNCs fra den voksne gruppe.

Konklusioner

De lymfocytter og monocytter er i en meget proliferativ tilstand i tonsillar hypertrofi og associeret med forøget ekspression af pro -inflammatory faktorer som følge af udsættelse for maven reflux pepsin

Henvisning:. Kim JH, Jeong HS, Kim KM, Lee YJ, Jung MH, Park JJ, et al. (2016) Extra-esophageal Pepsin fra mave Refluxate Fremmes Tonsil Hypertrofi. PLoS ONE 11 (4): e0152336. doi: 10,1371 /journal.pone.0152336

Redaktør: Gernot Zissel, Universitätsklinikum Freiburg, Tyskland

Modtaget: 5. oktober, 2015; Accepteret: 11. marts 2016 Udgivet: April 8, 2016

Copyright: © 2016 Kim et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Basic Science Research Program, gennem National Research Foundation Korea (NRF), finansieret af Ministeriet for Videnskab, IKT, og fremtidig planlægning (2013R1A1A1012542). Denne undersøgelse blev yderligere understøttet af den førende Foreign Research Institute Rekruttering Program, gennem National Research Foundation Korea (NRF), finansieret af Undervisningsministeriet, Science and Technology (MEST) (2012K1A4A3053142)). Dette arbejde blev støttet af biomedcal forskningsinstitut fond (GNUHBIF-2014-0009) fra Gyeongsang National University Hospital. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tonsil hypertrofi er i øjeblikket den mest almindelige årsag til tonsillektomi. Udvidelse af mandlerne opstår på grund af en absolut stigning i det samlede antal lymfocytter i væv og resulterer i en stigning i væv volumen. [1, 2] Den præcise mekanisme, hvorved lymfocytstimulering og proliferation forekommer har endnu ikke fastlagt. Det er blevet udledt, at antigen stimulering af væv lymfocytter fører til en stigning i lymfocytisk antal og aktivitet. Tidligere forsøg på at identificere de patofysiologiske mekanismer har fokuseret på mikrobiologiske og immunologiske ændringer i forstørrede mandler. Mange undersøgelser har rapporteret en mulig rolle af bakterielle organismer i patogenesen af ​​tonsil hypertrofi. [3-5] imidlertid en stigning i det absolutte antal af lymfocytter inden mandlerne uden en klinisk infektion blev tidligere vist [2], og de specifikke antigener ansvarlige for er ikke blevet identificeret disse ændringer.

den seneste forskning har set på sammenhængen mellem extraesophageal reflukssygdom og øvre luftvejslidelser. Kronisk bihulebetændelse [6], otitis media med effusion [7-9] og larynx lidelser er alle blevet undersøgt med mulige ætiologiske linkene til extraesophageal tilbagesvaling. [10, 11] Refluxate indeholder gastriske enzymer (pepsin og HCl) samt duodeno-pancreas enzymer (galdesyrer og trypsin). Rolle pepsin i mavesaft som en del af refluxate og interaktion med otolaryngologi systemer og i ENT organer (øre, næse og hals) er blevet grundigt undersøgt. [1, 10, 11]

Pepsin er et enzym konverteret fra pepsinogen, som er produceret af den ledende celle i maven, og spiller en vigtig rolle i fordøjelsen. Normalt pepsin kun fundet i maveindholdet. Men hvis extraesophageal reflux sker, maveindholdet fra refluks kan nå laryngopharynx, og kan påvises pepsin som del af maven tilbagesvaling i laryngopharyngeal områder. Dette er faktisk tilfældet Johnston et al. [12] rapporterede, at pepsin blev detekteret i de øvre luftveje mucosa og inducerer et proinflammatorisk cytokin cyklus, hvilket resulterer i inflammatorisk skade på larynx slimhinde. Disse data har foreslået en rolle for tilbagesvaling pepsin i fordelingen af ​​immunforsvaret mekanisme i slimhinde eller epitel foringer og fremme af inflammatoriske forårsager agenter. [12-15]

På samme måde for tonsil, vi hypotese, at gastrisk pepsin inden reflux har en central rolle i sin immunologisk reaktion tonsil og at pepsin eksponering inducerer tonsil hypertrofi. I denne undersøgelse, vi havde til formål at finde forholdet mellem gastrisk pepsin og tonsillar hypertrofi.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Denne undersøgelse blev godkendt af Gyeongsang National University Hospital Institutional Review Board (# GNUHIRB-2014-02-006). Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter (eller forældre) før deres optagelse i undersøgelsen.

Undersøgelse emner

Denne undersøgelse blev udført på 84 patienter med klinisk diagnose af tonsillar hypertrofi. De besøger vores hospital til fjernelse af tonsil, fordi de lider af kronisk betændelse på tonsil eller snorken /søvnapnø på grund af tonsil udvidelsen. Alle patienter undergik fysisk undersøgelse for at bekræfte diagnosen tonsillar hypertrofi eller kronisk tonsillitis. Den gennemsnitlige størrelse af tonsil var klasse 2.5 i tonsil hypertrofi og lønklasse 1.0 i kronisk halsbetændelse gruppe. (Tabel 1). Vi opnåede de tonsil væv fra 54 børn før deres kirurgiske behandling (41 drenge og 13 piger, alder range 4-16 år, gennemsnitsalder 8 år) og fra 30 voksne (17 mænd og 13 kvinder, aldersgruppe 17 og igen, betyder alder 29 år). Patienter med systemiske sygdomme og andre kliniske problemer blev ikke medtaget i denne undersøgelse. Hele tonsillektomi blev udført under generel anæstesi ved hjælp dissektion metode og ringere del af tonsil blev udvalgt til væv prøveudtagning. Ingen havde nogen postoperativ komplikation

Protein forberedelse og immunoblotanalyse

Vævsekstrakter fra tonsiller blev fremstillet som følger:. Tonsiller blev fjernet og homogeniseret i lyseringspuffer bestående af PBS (pH 7,4), 1 % Triton X-100, 1 mM EDTA indeholdende 10 uM leupeptin og 200 uM phenylmethylsulfonylfluorid. Lysaterne blev sonikeret flere gange i 3 til 5 minutter hver og centrifugeret ved 12.000 rpm i 20 minutter ved 4 ° C. Supernatanterne blev opsamlet, og proteinkoncentrationen af ​​hver lysat blev bestemt under anvendelse af en bicinchoninsyre (BCA) proteinassaykit (Pierce, Rockford IL, USA) ifølge producentens protokol. Bovint serumalbumin blev anvendt som standard. Lige store mængder protein (50 ug) blev lastet på en 10% natriumdodecylsulfat (SDS) polyacrylamidgel. Efter elektroforese blev proteinerne i gelen overført til en nitrocellulosemembran (Schleicher &Schuell, Dassel, Tyskland). Membraner blev blokeret med 5% fedtfri mælk i Tris-bufret saltvand indeholdende 0,1% Tween-20. Blots blev probet med primære antistoffer til polyklonale anti-Pepsin A (sc-99.081, Santa Cruz Biotechnology CA, USA) ved 4 ° C natten over. Som loading kontrol blev blots igen undersøgt med anti-β-actin-antistof (Sigma, St. Louis MO, USA). Det primære antistof blev visualiseret under anvendelse af sekundære antistoffer (peberrodsperoxidase-konjugeret gede-anti-kanin IgG, 1: 10,000; Pierce) med en ECL kit (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway NJ, USA)

Immunhistokemi
.

Immunfarvning blev udført på 5 mm tykke koronale sektioner paraformaldehyd-fikserede og paraffin-indlejrede sektioner ved hjælp af avidin-biotinyleret peberrodsperoxidase-kompleks kits (ABC, Vector Laboratories, Burlingame CA, USA). Efter afparaffinering i xylen blev snit hydreret med ethanol. Efter vask i PBS blev snittene blokeret med 1% normalt gedeserum og derefter behandlet med et anti-Pepsin A (sc-99.081, Santa Cruz), iNOS, TGF-β1, og CD68-antistoffer indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology ved 4 ° C natten over i et fugtigt kammer. Efter vask i PBS blev de inkuberet i 90 minutter ved stuetemperatur med sekundært antistof (Santa Cruz Biotechnology, biotin-konjugeret anti-kanin-immunoglobulin G, 1: 200). Endelig blev sektionerne inkuberet med ABC i 60 minutter ved stuetemperatur, skyllet i PBS, og derefter fremkaldt med 0,027% 3,3'-diaminobenzidintetrahydrochlorid (Sigma) med 0,003% hydrogenperoxid. Sektionerne blev modfarvet med hæmatoxylin (Sigma).

Dobbelt immunfluorescensfarvning

At karakterisere pepsin A-positive celler, blev dobbelt immunofluorescens udført på tonsil væv. Afparaffinering og antigen-genvinding blev udført. Ikke-specifik antistofbinding blev blokeret i PBS med 0,1% normalt æsel serum (Vector Laboratories) og 0,3% Triton X-100 (Sigma) i 45 min. Snit blev derefter inkuberet med anti-Pepsin A antistof (1: 100; sc-99.081, Santa Cruz) fortyndet i PBS indeholdende 0,1% bovint serumalbumin (Sigma) ved 4 ° C natten over. Efter skylning æsel Cy3-konjugeret anti-kanin IgG sekundært antistof (1: 100; EMD Millipore, Billerica MA, USA) blev anvendt i 1 time ved stuetemperatur. For dobbelt mærkning, efter blokering i PBS indeholdende 10% normalt gedeserum og 0,3% Triton X-100 blev snit inkuberet med anti-CD68 (1: 100; Santa Cruz) ved 4 ° C natten over. Alexa488-konjugeret anti-muse-IgG sekundært antistof (1: 100; Invitrogen, Carlsbad CA, USA) blev derefter påført i 1 time ved stuetemperatur. Snit blev monteret med anti-fading opløsning indeholdende 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) (Vector Laboratories), og observeret under et fluorescensmikroskop (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Tyskland). Til karakterisering CD68-positive celler, var dobbelt immunofluorescens udført, som beskrevet ovenfor. For dobbelt mærkning, anti-TGF-β1 (1: 100; Santa Cruz) og anti-iNOS (1: 100; Santa Cruz) blev påført og derpå æsel Cy3-konjugeret anti-kanin IgG sekundært antistof (1: 100; EMD Millipore ) på CD68-farvede snit.

revers transkription-polymerase-kædereaktion (RT-PCR)

Totalt RNA blev ekstraheret fra tonsil væv under anvendelse af TRIzol fremgangsmåden ifølge protokollen anbefalet af producenten ( GIBCO, Grand Island, NY). Lige store mængder (5 ug) af DNA-fri totalt RNA fra hver prøve blev omdannet til cDNA under anvendelse af 200 U af SuperScript II RT (GIBCO, Grand Island, NY) i en 20 pi reaktionsvolumen. Revers transkription blev udført ved 22 ° C i 10 min, ved 42 ° C i 45 minutter, og ved 95 ° C i 5 min. Reaktionsprodukterne (2,0 pi) blev udsat for PCR-amplifikation (Promega, Madison, WI, USA) i et 50 pi reaktionsvolumen. Hver primer sekvenser var som følger: IL-1β (189 bp), 5'-TCATTGCTCAAGTGTCTGAAGC-3 '(sense) og 5'-TGGTCGGAGATTCGTAGC-3' (antisense); IL-6 (628 bp), 5'-ATGAACTCCTTCTCCACAAGCGC-3 '(sense) og 5'-GAAGAGCCCTCAGGCTGGACTG-3' (antisense); TNF-β (443 bp), 5'-AGTGACAAGCCTGTAGCCC-3 '(sense) og 5'-GCAATGATCCCAAAGTAGACC-3' (antisense). PCR blev udført under anvendelse af BioRad thermal cycler ifølge instruktionerne fra fabrikanten. Lige volumener af amplifikationsprodukterne blev analyseret ved 1,5% agarose gelelektroforese med 0,5 mg /ml ethidiumbromid-farvning.

Flowcytometrisk analyse og in vitro
dyrkning

alle blodprøver blev forarbejdet inden for 2 timer efter indtagelse blod. Perifere mononukleære blodceller (PBMNCs) blev isoleret ved densitetsgradientcentrifugering over en Ficoll-gradient (Sigma, St. Louis MO, USA) i 25 minutter ved 2.300 rpm og blev vasket tre gange i PBS. PBMNCs på 1 × 10 ^{5-celler blev derefter analyseret ved flowcytometri. Hvorvidt pepsin er involveret i monocyt til makrofag differentiering, blev de resterende celler udpladet på dyrkningsskåle i nærvær /eller fravær af aktiveret pepsin (Thermo Scientific, Rockford IL, USA) indeholdende monocyt dyrkningsbetingelser. At identificere niveauet af makrofag befolkning, efter 8 og 15 dage blev celler høstet og analyseret ved flowcytometri under anvendelse af antistof til CD11 c og CD163. Alle cellekulturer blev holdt ved 37 ° C med 5% CO _{2 i en fugtig atmosfære.}}

Cellelevedygtighed

RAW264.7 celler, muse makrofag-lignende cellelinje, blev dyrket at undersøge effekten af ​​pepsin på makrofag proliferation. Cellerne blev behandlet i forskellige koncentration af pepsin (0,01-5 ug /ml) og cellelevedygtighed blev undersøgt ved CCK-8 kit (Cell Counting Kit-8, Dojindo Molecular Tech. Inc., Rockville, MD, USA). Cellelevedygtighed i hver koncentration blev repræsenteret som gange ændring. De fold ændringer er beregnet som forholdet mellem den endelige værdi i hvert tilstedeværelse af pepsin til værdien i fravær af pepsin (indstillet som "1"). Værdier er repræsenteret som middelværdi ± SEM. * P
< 0,05 vs. den tilsvarende fravær af pepsin (0 ug /m).

In vitro
migration assay

En standard monolag ridse sår model blev brugt til at karakterisere reaktionsevne makrofager til pepsin. RAW264.7-celler blev podet i 6-brønds vævskulturplader, dyrket til konfluens, og monolagene blev såret ved at skrabe langs overfladen af ​​vævskultur plast med et barberblad. Bladet blev presset ned i midten af ​​skålen, således at skære cellelaget og samtidig markerer "sår grænse" på den underliggende plast. Derefter bladet blev forsigtigt gled ensrettet at fjerne halvdelen af ​​sammenflydende cellelag. Den "såret monolag" blev vasket to gange med phosphatbufret saltvand, pH 7,4 (PBS), fodret igen med 1 mM mitomycin-indeholdende serum-berøvet medium og inkuberet under standard dyrkningsbetingelser i 24 timer.

Statistiske analyse

Alle data er præsenteret som gennemsnit ± SEM Sammenligninger mellem grupper blev analyseret af tosidede t
test. Sandsynlighed værdier ( P
) < 0,05 blev betragtet som signifikante.

Resultater

Pepsin blev udtrykt i tonsil

Immunoblot data viste, at pepsin protein blev udtrykt som et enkelt band fra ekstrakter af både tonsil af patienter med tonsil hypertrofi. Pepsin blev stærkt udtrykt som flere bands i den positive kontrol af mave væv ekstrakter. Stort set ingen pepsin farvning blev observeret i andre væv, herunder tumor, lymfeknude (LN), thyreoidea (Thy), ørespytkirtlen (Parotideale g.), Spytkirtel (SG) (Fig 1A). Alle tonsil væv udviste et positivt signal for pepsin (Fig 1B). Imidlertid afsløring niveauer af pepsin i tonsil var lidt forskellige i hver patient (fig 1B). Immunhistokemisk farvning blev udført for at identificere de pepsin-positive celler i tonsil væv. Pepsin-positive celler selektivt findes i nedenstående overflade epitel, hovedsageligt placeret i krypten (Fig 1C-a og b), der omgiver de mere negative germinale centre (Fig 1C-C og D), og også omkring den lymfoide follikel med overdreven udvikle fibrose (fig 1C-e og f). Mave sektioner anvendes som en positiv kontrol viste et typisk mønster af pepsin-farvning, overvejende glandulær celler (Fig 2D-a), men ikke i lymfeknuden (Fig 1D-b) og skjoldbruskkirtlen (Fig 1D-c).

pepsin-positive celler blev påvist i den beskadigede tonsil pladeepitel

for at bekræfte forholdet med tonsil pladeepitel skader og reflux, forsøgte vi at finde pepsin-positive celler i såret eller intakte tonsillær epitelial arkitektur. Beskadiget pladeepitel, uregelmæssig eller brudt, blev fundet i tonsil væv med tonsillær hypertrofi (fig 2A og 2D, nedenfor). Pepsin-positive celler blev påvist i de beskadigede steder (højre indsætte i fig 2A, 2D, 2E og 2F) sammenlignet med normalt epitel (venstre insert i fig 2A og 2B). Især blev de signaler stærkt findes omkring kløfter og beskadiget tonsil pladeepitel (punkterede linier i fig 2C og 2E).

TGF-p1 og iNOS-positive celler blev påvist i tonsil af patienter med tonsil hypertrofi

Immunohistokemisk farvning for TGF-β1 og iNOS blev udført for at undersøge forholdet mellem pepsin-farvning og inflammation. Både TGF-p1 og iNOS-positive signaler blev også påvist i andre regioner lig pepsin farvning, såsom i krypten epitel (fig 3A og 3B), der omgiver de germinale centre (Fig 3C og 3D), og omgivende den lymfoide follikel med overdreven udvikle fibrose (fig 3E og 3F).

pepsin og TGF-β1 blev detekteret i CD68-positive celler i tonsil hypertrofi væv

som beskrevet i indledningen, vi hypotese, at pepsin farvning i tonsil stammer fra maven og kunne relateres til tonsil inflammation. Dobbelt immunfluorescensfarvning for CD68 blev udført for at karakterisere de pepsin-positive celler. CD68 er et 110-Kd transmembran-glycoprotein og en repræsentant markør for humane monocytter og vævsmakrofager involveret i inflammation. CD68-positive celler blev klart observeret i tonsil med tonsil hypertrofi (fig 4). Notatet CD68-positive celler stærkt colocalized med pepsin og TGF β1-positive celler både i krypten (Fig 4A) og de omkringliggende germinale centre (Fig 4B). I modsætning til co-lokalisering af pepsin og CD68, pepsin ikke co-lokalisere med B-lymfocytter (CD20 positiv) i de follikulære centre og T-lymfocytter (CD45) i interfollicular regioner (Fig 4C). Disse data samt det i fig 3 antydede, at pepsin farvning kan være relateret til de inflammatoriske reaktioner i tonsil af patienter med tonsil hypertrofi. Og også, at afsløre den store mekanisme tonsil skade ved inflammatoriske mediatorer der medieres af hvide blodlegemer, herunder PBMNCs og makrofager, niveauer for tonsillær IL-6, blev IL-1β og TNF-α-mRNA undersøgt ved RT-PCR (figur 4D). Interessant nok blev alle disse udtryk i tonsil væv med tonsillar hypertrofi. Disse data tyder på, at den vigtigste mekanisme tonsillær hypertrofi kan være forårsaget af inflammatoriske mediatorer.

Pepsin kørte patienternes-afledte monocytter til at differentiere til makrofager

For at bekræfte forholdet pepsin farvning og makrofager, vi dyrkede perifere mononukleære blodceller (PBMNCs) fra tonsillar hypertrofiske patienter i makrofag dyrkningsmedium (i nærvær eller fravær af aktiveret pepsin) i 15 dage. Vi desuden bestemmes niveauer af monocyt befolkning, og analyseret makrofag fænotype ved strømningscytometri. Humane makrofager fremstilles ved differentieringen af ​​monocytter i væv. De spiller en afgørende rolle i ikke-specifikke forsvar (medfødt immunitet), og også hjælpe iværksætte specifikke forsvarsmekanismer (adaptive immunitet) ved at rekruttere andre immunceller såsom lymfocytter. De kan identificeres ved hjælp af flowcytometri ved deres specifikt udtryk for proteiner som CD-markører, herunder CD11c og CD163. Populationen af ​​monocytter udledes flow side og forward scatter (Fig 5A) var signifikant forøget i nærvær af aktiveret pepsin (aPepsin), sammenlignet med ingen stigning på dag 8, og ingen signifikant stigning på dag 15 (figur 5B). Derudover undersøgte vi monocyt til makrofag differentiering ved hjælp CD11c og CD163-antistoffer. De CD11c og CD163-positive celler blev forøget markant med aPepsin på dag 8 efter dyrkning. Ingen betydning blev fundet i andre tilstande (Fig 5C). Imidlertid monocyt populationen var ikke signifikant, og også niveauer for CD11 c og CD163 i voksne gruppe både på dag 8 og 15. Disse data antyder, at pepsin potentielt er involveret i makrofag differentiering og børn med forøget mave refluks kan være mere udsat for virkningerne af en pepsin miljøet end voksne.

pepsin induceret makrofag levedygtighed og migration

Vi undersøgte også, om pepsin var involveret i makrofag-funktion. RAW264.7-celler blev dyrket i nærvær eller fravær af aktiveret pepsin i 24 timer. Der var en signifikant dosisafhængig forøgelse i RAW264.7 cellelevedygtighed ved pepsin (Fig 6A). Migration af RAW264.7-celler blev også induceret af pepsin i både bunden såret og transwell migrationssystem assays (Fig 6B og 6C).

Diskussion

Denne undersøgelse viste først at pepsin blev påvist i hypertrofisk tonsil og pepsin-positive celler blev lokaliseret i krypten epitel omkring germinale center, og i det lymfoide follikel med overdreven udvikle fibrotisk udseende. Især blev pepsin farvning korrelerede med ekspression af inflammationsrelaterede faktorer, og pepsin og CD68 colocalized, og aktiveret pepsin førte til differentiering af monocytter til makrofager. [16] Disse resultater peger på potentielt hidtil ukendte patofysiologiske mekanismer, der ligger tonsillar hypertrofi.

Intense inflammation er en kendt risikofaktor for tonsil hypertrofi. [17] TGF-β1 og iNOS er kendte mediatorer af inflammation. [18-20] i hypertrofiske tonsiller, stigningen i T- og B-celletal viste en positiv korrelation med bakteriel tæller og tonsil størrelse. [21, 22] i epidemiologiske undersøgelser, rygning, allergi og tilbagevendende luftvejsinfektioner måske forbinder med forbigående eller permanent hypertrofi af lymfevæv. [22, 23] Immunologiske parametre, genetisk disposition og lokal lymfocyt dysfunktion synes at spille en rolle i ætiologien af ​​tilbagevendende tonsillitis og tonsillar hypertrofi. [22, 24] Nogle undersøgelser viste, at tonsillar hypertrofi var forbundet med øget lymfoid follicle størrelse, men ikke antallet af follikler [25] og blev også relateret til øget tonsil vægt, øget follikel diameter, areal og antal. [26]

Tilbagevendende stimuli af patogene agenser, under den inflammatoriske proces, føre til aktivering af monocytter og makrofager. [27] de cytokiner, der udskilles af makrofager stimulerer immunceller, og også forårsage proliferation af endotelceller og fibroblaster. [28] med tiden et immunologisk aktivt væv erstattes med fibrøst væv. [28] i denne undersøgelse har vi antaget, at antigenet var pepsin, og vi fremførte to hypoteser til at forklare observationen af ​​tonsillar hypertrofi med gastrisk tilbagesvaling (figur 7). En mekanisme kunne være direkte stimulering af lymfocytterne ved pepsin af refluxate der er anerkendt som antigen. En anden mulig mekanisme involverer pepsin-induceret skade på epitelet i tonsillar krypter, hvilket resulterer i kryptitis fra residente bakterier med løbende antigenstimulering af det specialiserede krypt-epitel. Disse ville føre til en stigning i antallet af lymfocytter og kan spille en rolle i tonsillar hypertrofi.

I første omgang pepsin kommer i kontakt med epitel og præsenteres for intraepitel lymfocytter, de subepiteliale lymfocytter, interfollicular og intrafollicular lymfocytter , i den rækkefølge. Lymfocytterne derefter prolifererer som respons på pepsin fungerer som et antigen, der forårsager tonsillar follikler at forstørre og de tonsil væv til at undergå hypertrofi. Alternativt tonsil-vævsmakrofager genkender tilbagesvaling-medieret pepsin på deres celleoverflade som et fremmedlegeme og aktiveres. Makrofagaktivering forårsager sekretion af proinflammatoriske cytokiner, og disse cytokiner inducerer inflammation samt yderligere lymfocytaktivering, der resulterer i tonsillar hypertrofi. Sidstnævnte hypotese synes at have mere støtte end førstnævnte siden som vist i figur 4, blev pepsin og CD68-positive celler colocalized under overfladen epitel placeret i krypten (Fig 4A) og også omkring den lymfoide follikel med overdreven efterfølgende fibrose (Fig 4B). Men lidt korrelation med pepsin og CD20 og CD45, som markører af B og T-celler henholdsvis blev observeret, i tonsil væv (Fig 4C).

Vi vurderede også udtryk for CD163 fra PBMNCs kultur med tonsillar hypertrofi . CD163 kun udtrykkes af modne makrofager, men fraværende på monocytter. Dyrkede vi PBMNCs til 8 og 15 dage i nærvær af 10% FCS og 10 ng /ml M-CSF, efter standardbetingelser for dyrkning af humane makrofager. Resultater af in vitro Salg PBMNCs kultur undersøgelser viste, at i barnets gruppen, CD163-positive celletal var signifikant højere i nærvær af aktiveret pepsin samt CD11c-positive celler. Til sammenligning var der ingen forskel i ekspressionen af ​​CD11c og CD163 fra kulturen af ​​PBMNCs fra voksne (S1 Fig). Disse data tydede på, at en PBMNC reaktion på aktiveret pepsin hos børn kan være mere følsomme end hos voksne. Selvom vi ikke kan forklare, hvilke pepsin-induceret mekanisme er involveret i makrofag differentiering, kan vi ikke udelukke, at makrofag differentiering selv kunne accelerere reflux-medieret tonsil skader.

Ifølge den aktuelle undersøgelse, pepsin-medierede reflux forårsager ikke alene direkte skade på tonsillar epitel, men også stimulerede tonsillar makrofager eller tonsillare epitelceller til at secernere kemokiner /cytokiner, der tiltrak og aktiverede immunceller, der er medieret nogle af de skader på tonsil mucosa. Mikroskopisk inflammation, kendetegnet ved TGF β1 og iNOS-ekspression i tonsil væv (krypt-epitel, der omgiver germinale center, og den lymfoide follikel med overdreven udvikle fibrotiske udseende), observeres hos patienter med alvorlige symptomer (data ikke vist). Dette indebærer, at pepsin (og syre) -induceret produktion af IL-8 og andre inflammatoriske mediatorer, som refluxate fremme migration og aktivering af perifere blodleukocytter. [14] Disse resultater bekræfter den hypotese, at en cytokin-medieret mekanisme er ansvarlig for tonsil skade hos børn med tonsillar hypertrofi. Slimhinden af ​​patienter med tonsillær hypertrofi producerer betydeligt store mængder af forskellige cytokiner. [29, 30] Disse inflammatoriske mediatorer aktiverer immun celle rekruttering og migration til de steder refluxate interaktion og kan være involveret i patofysiologien af ​​tonsil hypertrofi.

Baseret på resultaterne fra litteraturen og vores resultater i denne undersøgelse, foreslår vi, at lokal og systemisk aktivering af inflammatoriske pathways vil fremme lymfocytinfiltration og proliferation (herunder T-celler) sammen med makrofag differentiering og proliferation resulterer i tonsillar hypertrofi af den øgede monocytisk og lymfocytiske celle numre. Hvis de nyeste resultater viser sig at være korrekte, kan de give et levedygtigt mål for udvikling af interventionelle metoder til behandling eller forebyggelse af tonsillær hypertrofi hos børn. På trods af den betydelige beviser for inflammatoriske mediatorer og lymfocyt proliferation i patogenesen af ​​tonsil hypertrofi, samspillet mellem overfølsomhed over for pepsin reflux og tonsillar betændelse fortsat uklart i denne undersøgelse. Yderligere undersøgelser er berettiget til bedre at forstå de signalveje, der er involveret i tilblivelsen af ​​reflux symptomer og inflammation og identificere sammen med at udvikle nye behandlingsmetoder.

Konklusioner

Vi har etableret, at lymfocytter og monocytter er i en yderst proliferativ tilstand i mandlerne med tonsillær hypertrofi og associeret med forøget ekspression af pro-inflammatoriske faktorer som følge af udsættelse for gastrisk reflux pepsin. Disse resultater peger på potentielt hidtil ukendte patofysiologiske mekanismer bag tonsillar hypertrofi. Fra vores in vitro
data vi fastslå, at der kan være mulighed for objektiv karakterisering af de involverede for at udvikle specifikke behandlinger for denne sygdom indikation mekanismer. Vore data antydede, at mekanismerne bag lymfevæv proliferation i tonsillar hypertrofi er forskellige og kan give mulighed for fremtidige ikke-kirurgiske terapeutiske interventioner målrettet pepsin, som kan fjerne behovet for en tonsillektomi, og fører til involution af de hypertrofiske tonsiller.

Støtte oplysninger
S1 fig. Flow cytometri af monocyt befolkning og monocyt differentiering fra PBMNCs af voksne med kronisk halsbetændelse.
Lymfocytter og monocytter blev identificeret med side og forward scatter. Lymfocytter og monocytter blev også bekræftet ved farvning med CD4 og CD8 og CD14-antistoffer. PBMNCs blev dyrket i makrofag-specifikke dyrkningsbetingelser med eller uden aktiveret pepsin i 15 dage. Monocytter population blev identificeret fra side og forward scatter-profiler i flowcytometri i hver tilstand. Hvert niveau blev sammenlignet med værdien af ​​dagen 8 celler i fravær af pepsin, der blev givet en arbitrær værdi på "1". Monocyt til makrofag differentiering blev undersøgt ved farvning med CD11c og CD163-antistoffer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0152336.s001
(TIF)

• PLoS ONE: Geometrisk Mixing, peristaltikken, og den geometriske fase af maven
• PLoS ONE: Intestinal stamcelle Markers i Intestinal Metaplasi af mave og Barretts øsofagus