PLoS ONE: Extra-Ruokatorven Pepsin välillä Vatsa Refluxate mainosvideosuositukset Nielurisa Hypertrophy

tiivistelmä

Background

Refluksitaudin liittyy lukuisia patologisia tiloja ylemmän aerodigestive ärsytystä. Mahalaukun pepsiini sisällä refluksi vaikuttaa immunologisia reaktioita nielurisojen. Tässä tutkimuksessa pyrittiin löytämään suhteita pepsiiniä ja nielurisojen liikakasvu.

menetelmät ja löytää

Selvitimme käsite onko tonsillar hypertrofia johtui pepsiini välittämää refluksitaudin sisään nielurisojen liikakasvu. Viisikymmentäneljä lasten nielurisojen liikakasvu ja 30 aikuisten tonsilliitti rekrytoitiin ennen leikkaushoitoa. Veri ja nielurisojen kudokset kunkin potilaan kerättiin muutosten analysointi lymfosyyttien ja makrofaagien numerot yhdistettynä histologisia ja biokemiallisia analyysi. Pepsiini ilmentyi eri tasoilla nielurisojen kudoksissa kustakin nielurisojen liikakasvu. Pepsiini-positiivisten solujen havaittiin kryptassa epiteelin, ympäröivä lymfaattisen follikkelin kehitysmaiden fibroosia, ja myös ympäröivä lymfaattisen follikkelin että edessä kryptassa. Ja myös, pepsiini värjäytyminen hyvin korreloi vaurioitunut Nielurisoista levyepiteeliin ja TGF-β1 ja iNOS ilmaisun nielurisojen osiossa. Lisäksi, pepsiini ja TGF-β1-positiiviset solut samanaikaisesti paikallistaa CD68-positiivisten solujen crypt ja ympäröivän itukeskuksissa. Verrattuna makrofagien vastata pepsiini, perifeerisen veren mononukleaariset solut (PBMNCs) oli huomattavasti suurempi, kun läsnä on aktivoitua pepsiiniä lapsen ryhmässä. Lisäksi CD11c ja CD163-positiiviset solut lisääntyivät huomattavasti aktivoitu pepsiini. Kuitenkin, tämä ei nähty kulttuurin PBMNCs aikuisen ryhmä.

Johtopäätökset

lymfosyytit ja monosyytit ovat erittäin proliferatiivisen tilassa tonsillar liikakasvua ja liittyy lisääntynyt ilmentyminen pro -inflammatory tekijät seurauksena altistumisesta mahan palautusjäähdyttäen pepsiini.

Citation: Kim JH, Jeong HS, Kim KM, Lee YJ, Jung MH, Park JJ, et ai. (2016) Extra-Ruokatorven Pepsin välillä Vatsa Refluxate Promoted Nielurisa liikakasvu. PLoS ONE 11 (4): e0152336. doi: 10,1371 /journal.pone.0152336

Editor: Gernot Zissel, Universitätsklinikum Freiburg, SAKSA

vastaanotettu: 05 lokakuu 2015; Hyväksytty: 11 maaliskuu 2016; Julkaistu: 08 huhtikuu 2016

Copyright: © 2016 Kim et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukee Basic Science Research Program, kautta National Research Foundation of Korea (NRF), rahoittama tiede, ICT, ja Future Planning (2013R1A1A1012542). Tämä tutkimus tuki lisäksi johtava ulkomainen tutkimuslaitos rekrytointiohjelma, kautta National Research Foundation of Korea (NRF), rahoittama opetus-, Science and Technology (MEST) (2012K1A4A3053142)). Tätä työtä tukivat biomedcal tutkimuslaitoksen rahasto (GNUHBIF-2014-0009) päässä Gyeongsang National University Hospital. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Nielurisa liikakasvu on tällä hetkellä yleisin syy nielurisojen poisto. Laajentuminen risat esiintyy johtuu absoluuttinen lisääntyminen kokonaismäärän lymfosyyttien kudoksessa ja mikä nostaa kudoksen määrän. [1, 2] Tarkkaa mekanismia, jolla lymfosyyttistimulaation ja lisääntyminen todetaan on vielä määrittelemättä. On päätelty, että antigeeninen stimulaatio kudoksen lymfosyyttien johtaa kasvuun lymfosyyttien määrä ja aktiivisuus. Aikaisemmat yritykset yksilöimään patofysiologisia mekanismeja ovat keskittyneet mikrobiologisia ja immunologisia muutoksia laajentuneessa risat. Useissa tutkimuksissa on raportoitu mahdollinen rooli bakteerieliöiden patogeneesissä nielurisojen liikakasvu. [3-5] Kuitenkin lisäämistä absoluuttinen määrä lymfosyyttien sisällä nielurisat ilman kliinisen infektion aiemmin osoitettu [2], ja antigeenit vastuussa näiden muutosten ei ole tunnistettu.

Viimeaikainen tutkimus on tarkastellut suhdetta extraesophageal refluksitauti ja ylähengitysteiden sairaudet. Krooninen sinuiitti [6], välikorvatulehdus kanssa nestekertymä [7-9] ja kurkunpään sairauksien kaikilla on tutkittu mahdollisia etiologic linkkejä extraesophageal refluksi. [10, 11] Refluxate sisältää mahalaukun entsyymejä (pepsiini ja HCl) sekä duodeno-haiman entsyymit (sappihapot ja trypsiini). Rooli pepsiiniä mahanesteessä osana refluxate ja vuorovaikutus Otolaryngology järjestelmien ja ENT elinten (korva, nenä, ja kurkku) on tutkittu laajasti. [1, 10, 11]

Pepsiini on entsyymi muuntaa pepsinogeeni, joka on valmistettu pääsolun mahan, ja sillä on tärkeä rooli ruuansulatuksessa. Normaalisti pepsiiniä löytyy vain mahalaukun sisällön. Kuitenkin, jos extraesophageal refluksi tapahtuu, mahan sisältö palautusjäähdytyslämpötilan pääsee laryngopharynx, ja pepsiinin osana mahalaukun refluksoidaan voidaan havaita alanielun alueilla. Tämä todellakin on niin Johnston et al. [12] kertoi, että pepsiiniä havaittiin ylähengitysteiden limakalvon ja indusoi proinflammatoristen sytokiinien sykli, jolloin tulehduksellinen vaurioittaa kurkunpään limakalvolle. Nämä tiedot ovat ehdottaneet rooli refluksoitiin pepsiiniä jakautuminen immuunipuolustuksen mekanismin limakalvon tai epiteelin vuoria ja edistäminen tulehduksellisten aiheuttavia aineita. [12-15]

Vastaavasti nielurisojen, me arveltu, että mahalaukun pepsiini sisällä refluksi on keskeinen rooli sen immunologista reaktiota nielurisojen ja että pepsiiniä altistuminen aiheuttaa nielurisojen liikakasvu. Tässä tutkimuksessa pyrittiin löytämään suhde mahan pepsiiniä ja nielurisojen liikakasvu.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Tutkimus hyväksyttiin Gyeongsang National University Hospital Institutional Review Board (# GNUHIRB-2014-02-006). Kirjallinen suostumus saatiin kaikista potilaista (tai vanhemmat) ennen niiden sisällyttämistä tutkimukseen.

Tutkittavat

Tämä tutkimus tehtiin 84 potilaalla, joilla kliininen diagnoosi tonsillaaristen liikakasvua. Ne käymään sairaalassa poistoon nielurisojen koska he kärsivät kroonisesta tulehdus nielurisojen tai kuorsausta /uniapnea takia nielurisojen laajentumisesta. Kaikki potilaat kävivät lääkärintarkastus diagnoosin varmistamiseksi tonsillaaristen liikakasvu tai krooninen nielurisatulehdus. Keskimääräinen koko nielurisojen oli luokan 2.5 nielurisojen liikakasvu ja palkkaluokka 1,0 kroonisessa nielurisatulehdus ryhmässä. (Pöytä 1). Saimme nielurisojen kudokset 54 lasta ennen niiden leikkaushoitoa (41 poikaa ja 13 tyttöä, ikäryhmä 4-16 vuotta, keski-ikä 8 vuotta) ja 30 aikuista (17 miestä ja 13 naarasta, ikäryhmä 17 ja yli, tarkoita ikä 29 vuotta). Potilaat, joilla on systeemisiä sairauksia ja muita kliinisiä ongelmia ei ollut mukana tässä tutkimuksessa. Koko nielurisojen poisto suoritettiin yleisanestesiassa käyttäen dissektiomenetelmän ja huonompi osa nielurisojen valittiin kudoksen näytteenottoa. Millään ei ollut postoperatiivinen komplikaatio.

Protein valmistelu ja immunoblot-analyysi

Tissue otteita nielurisat valmistettiin seuraavasti: nielurisat poistettiin ja homogenoitiin lyysipuskurissa koostuu PBS: ää (pH 7,4), 1 % Triton X-100, 1 mM EDTA: ta, joka sisälsi 10 pM leupeptiiniä ja 200 uM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia. Lysaatit sonikoitiin useita kertoja 3-5 min kukin ja sentrifugoitiin 12000 rpm 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantit kerättiin ja proteiinipitoisuus kunkin lysaattia määritettiin käyttämällä bikinkoniini- happoa (BCA) proteiinimäärityksellä (Pierce, Rockford IL, USA) valmistajan protokollan. Naudan seerumialbumiinia käytettiin standardina. Yhtä suuret määrät proteiinia (50 ug) ladattiin 10%: natriumdodekyylisulfaattia (SDS) polyakryyliamidigeelillä. Elektroforeesin jälkeen, proteiinit geeli siirrettiin nitroselluloosakalvolle (Schleicher &Schuell, Dassel, Saksa). Membraanit blokattiin 5% rasvatonta maitoa Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa, joka sisälsi 0,1% Tween-20. Blotit primaaristen vasta-aineiden polyklonaalista anti-Pepsiini A (sc-99081, Santa Cruz Biotechnology CA, USA) 4 ° C: ssa yön yli. Latauskontrollina, blotit uudelleen tutkittiin anti-β-aktiini-vasta-ainetta (Sigma, St. Louis, MO, USA). Ensisijainen vasta-aine visualisoitiin käyttäen sekundaarisia vasta-aineita (piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua vuohen anti-kani-IgG: tä, 1: 10000, Pierce) ja ECL-kitillä (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway NJ, USA).

Immunohistokemia

immunovärjäys suoritettiin 5 mm: n paksuinen koronaalisia leikkeitä paraformaldehydiä-kiinnitetyille ja parafiiniin upotettujen leikkeiden käyttäen avidiini-biotinyloitu-piparjuuriperoksidaasi-kompleksin sarjat (ABC, Vector Laboratories, Burlingame CA, USA). Sen jälkeen deparaffinization ksyleenissä, leikkeet nesteytyksestä on etanolia. Pesun jälkeen PBS: llä, leikkeet blokattiin 1% normaalia vuohen seerumia ja sitten käsiteltiin anti-Pepsiini A (sc-99081, Santa Cruz), iNOS: n, TGF-β1, ja CD68 vasta-aineet hankittiin Santa Cruz Biotechnology 4 ° C yön yli kostutetussa kammiossa. Pesun jälkeen PBS: ssä, niitä inkuboitiin 90 min ajan huoneenlämpötilassa sekundaarisen vasta-aineen (Santa Cruz Biotechnology, biotiini-konjugoitu anti-kani-immunoglobuliini G, 1: 200). Lopuksi leikkeitä inkuboitiin ABC 60 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, huuhdeltiin PBS: ssä, ja kehitettiin sitten 0,027% 3,3'-diaminobentsidiiniä tetrahydrochloride (Sigma), jossa 0,003% vetyperoksidia. Leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä (Sigma).

Double immunofluoresenssivärjäyksen

Luonnehtia Pepsin A-positiivisten solujen, kaksinkertainen immunofluoresenssilla tehtiin nielurisojen kudoksiin. Deparaffinization ja antigeeni haku tehtiin. Ei-spesifinen vasta-aineen sitoutuminen estettiin PBS: ssä, jossa oli 0,1% normaalia aasi seerumin (Vector Laboratories) ja 0,3% Triton X-100 (Sigma) 45 min. Leikkeitä inkuboitiin sitten anti-Pepsiini vasta-aineen (1: 100, sc-99081, Santa Cruz) laimennettuna PBS: ään, joka sisälsi 0,1% naudan seerumin albumiinia (Sigma) 4 ° C: ssa yön yli. Huuhtelun jälkeen, aasi Cy3-konjugoitu anti-kani-IgG sekundääristä vasta-ainetta (1: 100, EMD Millipore, Billerica, MA, USA) levitettiin 1 tunniksi huoneen lämpötilassa. Kaksinkertainen merkinnät, kun esto PBS: ssä, joka sisälsi 10% normaalia vuohen seerumia ja 0,3% Triton X-100, leikkeitä inkuboitiin anti-CD68 (1: 100, Santa Cruz), 4 ° C: ssa yön yli. Alexa488-konjugoitua anti-hiiri-IgG sekundääristä vasta-ainetta (1: 100; Invitrogen, Carlsbad CA, USA) lisättiin sitten 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Leikkeet kiinnitettiin anti-häipyminen, joka sisälsi 4 ', 6-diamino-2-fenyyli (DAPI) (Vector Laboratories), ja niitä tarkkailtiin fluoresenssimikroskoopilla (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Saksa). Luonnehtia CD68-positiivisten solujen, kaksinkertainen immunofluoresenssilla tehtiin, kuten edellä on kuvattu. Saat kaksinkertainen merkintä, anti-TGF-β1 (1: 100; Santa Cruz) ja anti-iNOS (1: 100; Santa Cruz) on sovellettu ja sitten aasi Cy3-konjugoitu anti-kani-IgG sekundääristä vasta-ainetta (1: 100; EMD Millipore ) on CD68-värjätyt leikkeet.

Käänteinen transkriptio-polymeraasiketjureaktion (RT-PCR) B

Yhteensä RNA uutettiin nielurisojen kudoksista käyttäen TRIzol menetelmää protokollan mukaisesti valmistajan suositteleman ( GIBCO, Grand Island, NY). Yhtä suuret määrät (5 ug) DNA-free-kokonais-RNA: ta kustakin näytteestä muunnettiin cDNA käyttäen 200 U SuperScript II RT (GIBCO, Grand Island, NY), 20 ul: n reaktiotilavuudessa. Käänteistranskriptio suoritettiin 22 ° C: ssa 10 min, 42 ° C: ssa 45 min, ja 95 ° C: ssa 5 min. Reaktion tuotteet (2,0 ui) suoritettiin PCR-monistus (Promega, Madison, WI, USA) 50 ul: n reaktiotilavuudessa. Jokainen alukesekvenssit olivat seuraavat: IL-1β (189 bp), 5'-TCATTGCTCAAGTGTCTGAAGC-3 '(sense) ja 5'-TGGTCGGAGATTCGTAGC-3' (antisense); IL-6 (628 bp), 5'-ATGAACTCCTTCTCCACAAGCGC-3 '(sense) ja 5'-GAAGAGCCCTCAGGCTGGACTG-3' (antisense); TNF-β (443 bp), 5'-AGTGACAAGCCTGTAGCCC-3 '(sense) ja 5'-GCAATGATCCCAAAGTAGACC-3' (antisense). PCR suoritettiin käyttäen BioRad lämpösyklilaite ohjeiden mukaisesti valmistajan antamia. Yhtä suuret tilavuudet monistuksen tuotteet analysoitiin 1,5% agaroosigeelielektroforeesilla 0,5 mg /ml etidiumbromidivärjäyksellä.

virtaussytometrinen analyysi ja in vitro
viljely

kaikki verinäytteet käsiteltiin 2 tunnin kuluttua ottaen verta. Perifeerisen veren mononukleaariset solut (PBMNCs) eristettiin tiheysgradienttisentrifugaatiolla Ficoll-gradientilla (Sigma, St. Louis, MO, USA) 25 minuutin ajan 2300 rpm: llä ja pestiin kolme kertaa PBS: ssä. PBMNCs 1 x 10 ^{5-solut analysoitiin sitten virtaussytometrialla. Olipa pepsiiniä on mukana monosyytistä makrofagien erilaistumista, loput solut maljattiin kulttuurin ruokia läsnäolo /tai ilman aktivoitua pepsiiniä (Thermo tieteellinen, Rockford IL, USA), joka sisältää monosyyttien viljelyolosuhteet. Tunnistaa tason rofagipopulaatio, kun 8 ja 15 päivää, solut kerättiin ja analysoitiin virtaussytometrialla käyttämällä vasta-ainetta CD11 c ja CD163. Kaikki soluviljelmät pidettiin 37 ° C: ssa, 5% CO _{2: ssa kosteutetussa ilmakehässä.}}

Solujen elinkelpoisuus

RAW264.7-solut, hiiren makrofagin kaltainen solulinja, viljeltiin vaikutuksen tutkimiseksi pepsiiniä makrofagien lisääntymistä. Soluja käsiteltiin eri pitoisuutena pepsiiniä (0,01-5 ug /ml), ja solujen elinkyky tutkittiin CCK-8 kit (Cell Counting Kit-8, Dojindo Molecular Tech. Inc., Rockville, MD, USA). Solujen elävyys kullakin pitoisuus oli edustettuna kertainen muutos. Kansi muutokset lasketaan suhde viimeinen arvo kunkin läsnä pepsiinin arvo ilman pepsiiniä (asetettu "1"). Arvot esitetään keskiarvona ± SEM. * P
< 0,05 vs. vastaava puuttuminen pepsiiniä (0 ug /ml).

In vitro
migraatiokokeessa

Tavallinen yksikerroksista naarmu haava mallia käytettiin luonnehtimaan reagointikykyä makrofageja pepsiiniä. RAW264.7-solut ympättiin 6-kuoppaisille kudosviljelylevyille, viljeltiin konfluenssiin, ja yksisolukerrokset haavoittuneen raaputtamalla pitkin pintaa kudosviljelymuoviin partaterällä. Terä oli alhaalla keskellä lautasen, mikä vähentää solujen kerros ja samanaikaisesti merkintä "haavan rajan" on taustalla muovi. Sitten terä varovasti liukui yksisuuntaisesti poistamaan puolet yhtenäinen so- kerros. "Haavoittunut yksikerroksinen" pestiin kahdesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella, pH 7,4 (PBS), ruokittiin taas 1 mM mitomysiini-seerumia sisältävää vailla väliaineessa, ja inkuboitiin standardeissa viljelyolosuhteissa 24 tunnin ajan.

Statistical analyysi

Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± SEM Vertailut ryhmien välillä analysoitiin kaksisuuntaisella t
testiä. Todennäköisyys arvot ( P
) < 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

Pepsiiniä ilmaistu nielurisojen

immunoblot-tulokset osoittivat, että pepsiini ekspressoitiin yksittäisenä vyöhykkeenä uutteista sekä nielurisojen potilaiden kanssa nielurisojen liikakasvu. Pepsiini oli erittäin ilmaistiin useita bändejä positiivisessa kontrollissa vatsan kudosta otteita. Käytännössä yksikään pepsiini värjäytymistä ei havaittu muissa kudoksissa, kuten kasvain, imusolmuke (LN), kilpirauhasen (Thy), korvasylkirauhasessa (Nieluntakaiset g.), Sylkirauhasten (SG) (kuvio 1A). Kaikki nielurisojen kudokset ollut positiivinen signaali pepsiiniä (kuvio 1 B). Kuitenkin tunnistustasoa pepsiiniä nielurisojen olivat hieman erilaiset kullekin potilaalle (kuvio 1 B). Immunohistokemiallinen värjäys suoritettiin tunnistaa pepsiini-positiivisten solujen nielurisojen kudosta. Pepsiini-positiivisia soluja selektiivisesti löytyy alla pintaepiteelissä, sijaitsevat pääasiassa kryptassa (Kuva 1C-a ja b), joka ympäröi negatiivisempi Itukeskusten (Kuva 1C-c ja d), ja myös ympäröivä lymfaattisen follikkelia liiallisella kehittämällä fibroosia (kuvio 1C-e ja f). Vatsa osia käytettiin positiivisena kontrollina oli tyypillinen kuvio pepsiini värjäystä, pääasiassa rauhasten soluissa (kuvio 2D-a), mutta ei imusolmukkeen (kuvio 1D-b) ja kilpirauhasen (kuvio 1D-c).

pepsiinin-positiiviset solut havaittiin vaurioitunut nielurisojen levyepiteeli

vahvista suhteessa nielurisojen levyepiteeliin vaurioita ja refluksi, yritimme löytää pepsiini-positiivisten solujen loukkaantunut tai ehjä nielurisojen epiteelin arkkitehtuuri. Vaurioituneet levyepiteeli, epäsäännöllinen tai rikki, löydettiin nielurisojen kudoksiin nielurisojen hypertrofia (kuvio 2A ja 2D, alla). Pepsiini-positiivisia soluja havaittiin loukkaantunut sivustoja (oikea laita kuviossa 2A, 2D, 2E ja 2F) verrattuna normaaliin epiteelin (vasen insert kuviossa 2A ja 2B). Erityisesti, signaalit voimakkaasti löytyy ympäri välien ja vaurioituneet nielurisojen levyepiteelillä (katkoviivat kuviossa 2C ja 2E).

TGF-β1: n ja iNOS-positiivisia soluja havaittiin nielurisojen potilailla, joilla on nielurisojen liikakasvu

immunohistokemiallinen värjäys TGF-β1 ja iNOS suoritettiin tutkimaan suhdetta pepsiiniä värjäystä ja tulehdusta. Sekä TGF-β1: n ja iNOS-positiivisia signaaleja havaittiin myös alueille samanlainen pepsiini värjäystä, kuten crypt epiteelissä (kuvio 3A ja 3B), joka ympäröi itukeskusten (kuvio 3C ja 3D), ja ympäröivän lymfaattisen follikkelin liiallisen kehittämällä fibroosia (kuvio 3E ja 3F).

pepsiini ja TGF-β1 havaittiin CD68-positiivisten solujen nielurisojen liikakasvu kudos

Kuten johdanto, olemme arveltu, että pepsiiniä värjäytymistä nielurisojen peräisin mahassa ja voi liittyä nielurisaan tulehdus. Double immunofluoresenssivärjäystä CD68 suoritettiin luonnehtia pepsiini-positiivisia soluja. CD68 on 110-Kd läpäisevä glykoproteiini ja edustava merkki ihmisen monosyyttien ja kudosmakrofagien mukana tulehdus. CD68-positiiviset solut selvästi havaittavissa nielurisojen kanssa nielurisojen hypertrofia (kuvio 4). Huomattavaa on, että CD68-positiivisten solujen vahvasti colocalized pepsiinillä ja TGF- β1-positiivisten solujen sekä crypt (kuvio 4A) ja ympäröivä Itukeskusten (kuvio 4B). Toisin kuin rinnakkaispaikantumisen pepsiiniä ja CD68, pepsiini ei kolokalisoituvat B-lymfosyytit (CD20 positiivinen) munarakkulan keskuksissa ja T-lymfosyytit (CD45) on interfollicular alueilla (kuvio 4C). Nämä tiedot, samoin kuin kuviossa 3 esitetty, että pepsiiniä värjäystä voisi liittyä tulehdusvasteita nielurisojen potilailla, joilla on nielurisojen liikakasvua. Ja myös paljastaa suuria mekanismi nielurisojen vahinkoa tulehdusmediaattori välittämän valkosolujen, mukaan lukien PBMNCs ja makrofagit, tasot nielurisojen IL-6, IL-1β: n ja TNF-α-mRNA tutkittiin RT-PCR: llä (kuvio 4D). Mielenkiintoista, kaikki nämä ilmaistiin nielurisojen kudoksiin nielurisojen liikakasvu. Nämä tiedot viittaavat siihen, että suuret mekanismi tonsillaaristen liikakasvu saattaa johtua tulehduksen välittäjäaineiden.

Pepsin ajoi potilaiden monosyyteissä erilaistua makrofageihin

Vahvista suhde pepsiiniä värjäystä ja makrofagit, me viljellään perifeerisen veren mononukleaariset solut (PBMNCs) nielurisasta hypertrofinen potilaiden makrofagin elatusaineessa (in läsnä ollessa tai ilman aktivoitua pepsiiniä) ja 15 päivää. Olemme lisäksi määritetty tasoilla monosyyttien väestöstä, ja analysoitiin makrofagien fenotyypin virtaussytometrialla. Ihmisen makrofagien tuotetaan erilaistumista monosyyttien kudoksissa. Niillä on ratkaiseva merkitys epäspesifistä puolustus (luontaisen immuniteetin), ja myös auttaa käynnistämään erityisiä suojamekanismit (immuniteetin) värväämällä muita immuunijärjestelmän soluja, kuten lymfosyyttejä. Ne voidaan tunnistaa virtaussytometrialla niiden erityinen ilmaus proteiinien CD markkereita myös CD11 c ja CD163. Väestön monosyyttien päätellä virtauspuolen ja sirontamittari (kuvio 5A) lisääntyi merkitsevästi läsnäollessa aktivoitua pepsiiniä (aPepsin), verrattuna ei lisäystä 8. päivänä, eikä merkittävää kasvua päivänä 15 (kuvio 5B). Lisäksi olemme tutkineet monosyytistä makrofagien erilaistumista käyttämällä CD11 c ja CD163-vasta-aineita. CD11 c ja CD163-positiiviset solut lisääntyivät huomattavasti aPepsin 8. päivänä viljelyn jälkeen. Ei merkitystä todettiin muissa olosuhteissa (kuvio 5C). Kuitenkin monosyytti väestö ei ollut merkittävä ja tasot CD11 c ja CD163 aikuisten ryhmässä sekä päivänä 8 ja 15. Tämä data viittaa siihen, että pepsiiniä mahdollisesti osallisena makrofagien erilaistumista ja lasten lisääntynyt mahalaukun refluksi voi olla alttiimpia vaikutuksia pepsiini ympäristölle kuin aikuisilla.

Pepsin aiheuttama makrofagien elinkelpoisuutta ja muuttoliike

tutki myös pepsiiniä oli mukana makrofagin toiminto. RAW264.7-soluja viljeltiin, kun läsnä tai poissa ollessa aktivoitu pepsiiniä 24 tunnin ajan. Oli merkittävä annoksesta riippuva lisäys RAW264.7 solujen elinkelpoisuuden pepsiinillä (kuvio 6A). Migraatio RAW264.7 solujen indusoitui myös pepsiinin sekä tyhjästä haava ja siirtokuoppaan muuttoliikejärjestelmää määrityksissä (kuvio 6B ja 6C).

Keskustelu

Tämä tutkimus ensimmäinen osoitti, että pepsiiniä havaittiin hypertrofinen nielurisojen ja pepsiini-positiiviset solut lokalisoitu kryptassa epiteelin ympäröivä germinaalikeskuksen, ja lymfaattisen follikkelin liiallisella kehittämiseen fibrotic ulkonäkö. Erityisesti pepsiini värjäys korreloi ilmaus tulehdukseen liittyviä tekijöitä, ja pepsiiniä ja CD68 colocalized, ja aktivoida pepsiiniä johti erilaistumisen monosyyttien makrofagien. [16] Nämä havainnot viittaavat siihen mahdollisesti uusia pathophysiological mekanismit nielurisojen liikakasvu.

Intense tulehdus on tunnettu riskitekijä nielurisojen liikakasvu. [17] TGF-β1 ja iNOS tunnetaan tulehduksen välittäjiä. [18-20] vuonna hypertrofiaa risat, kasvu T- ja B-solujen määrä oli positiivinen korrelaatio bakteeri- laskee ja nielurisojen koko. [21, 22] epidemiologisissa tutkimuksissa, tupakointi, allergiat ja toistuvia hengitystieinfektioita mahdollisesti yhdistää ohimeneviä tai pysyviä liikakasvu imukudoksen. [22, 23] Immunologiset parametrit, geneettinen alttius ja paikallisten lymfosyyttien toimintahäiriöitä näyttävät olevan etiologinen toistuvat tonsilliitti ja nielurisojen liikakasvu. [22, 24] Eräät tutkimukset osoittivat, että nielurisojen liikakasvu oli yhteydessä lisääntyneeseen lymfaattisen follikkelin koko, mutta ei määrää munarakkuloita [25] ja liittyi myös lisääntynyt nielurisojen painonnousu, lisääntynyt follikkelia halkaisija-alue ja määrä. [26]

Toistuva ärsykkeille taudinaiheuttajien, tulehdusprosessien aikana, johtaa aktivoitumiseen monosyytit ja makrofagit. [27] sytokiinejä, joita makrofagit stimuloivat immuunijärjestelmän soluja, ja myös aiheuttaa proliferaatiota endoteelisolujen ja fibroblastien. [28] ajan, immunologisesti aktiivisen kudoksen korvataan sidekudoksen. [28] tässä tutkimuksessa on oletettu, että antigeeni pepsiini ja esitämme kahden hypoteesin selittää havainnon tonsillaaristen liikakasvu kanssa refluksitaudin (kuvio 7). Yksi mekanismi voisi olla suora stimulaatio lymfosyyttien pepsiinin on refluxate että tunnustetaan antigeeninen. Toinen mahdollinen mekanismi käsittää pepsiini aiheuttama vahinkoa epiteelin tonsillar crypts, mikä johtaa cryptitis kotimaisilta bakteerien meneillään antigeenistimulaatiota erikoistunut kryptassa epiteelin. Nämä johtaisi kasvuun lymfosyyttien lukumäärässä ja voi olla rooli nielurisojen liikakasvu.

Aluksi pepsiini koskettaa epiteelin ja esitellään intraepiteliaalisten lymfosyyttejä, The epiteelinalaisella lymfosyytit, interfollicular ja intrafollicular lymfosyyttien , tässä järjestyksessä. Lymfosyytit sitten lisääntyvän vasteena pepsiiniä toimii antigeeninä, jolloin tonsillar munarakkuloiden suuremmaksi ja nielurisojen kudosten läpi liikakasvua. Vaihtoehtoisesti nielurisojen-kudosmakrofagien tunnistaa refluksi välittämä pepsiini niiden solujen pinnalla roskan ja aktivoituvat. Makrofagiaktivaatio aiheuttaa eritystä proinflammatoristen sytokiinien, ja nämä sytokiinit indusoivat tulehdusta sekä muita lymfosyyttien aktivaation, joka johtaa nielurisojen liikakasvu. Tämä jälkimmäinen mahdollisuus näyttää olevan enemmän tukea kuin edellinen, koska, kuten on esitetty kuviossa 4, pepsiini ja CD68-positiiviset solut colocalized pinnan alla epiteelin sijaitsee crypt (kuvio 4A) ja ympäröivän lymfaattisen follikkelin liiallista seurannut fibroosia (kuvio 4B). Kuitenkin vähän korrelaatiota pepsiinillä ja CD20 ja CD45, merkkeinä B- ja T-soluissa, havaittiin nielurisojen kudoksen (kuvio 4C).

arvioinut myös ilmaus CD163 peräisin PBMNCs kulttuurin nielurisojen liikakasvu . CD163 ilmentyy vain kypsä makrofagit, mutta poissa monosyyteissä. Me viljeltiin PBMNCs 8 ja 15 päivää, kun läsnä oli 10% FCS ja 10 ng /ml M-CSF, seuraavan standardin edellytykset kulttuurin ihmisen makrofageissa. Tulokset in vitro
PBMNCs kulttuuri tutkimukset osoittivat, että lapsen ryhmässä, CD163-positiivinen solu luvut olivat merkittävästi korkeammat läsnäollessa aktivoitua pepsiinin sekä CD11 c-positiivisten solujen. Vertailun vuoksi ei ollut eroa ilmaus CD 11 c ja CD163 viljelmästä PBMNCs aikuisten (S1 Kuva). Nämä tiedot ehdotti, että PBMNC reaktio aktivoidaan pepsiiniä lapsilla saattaa olla herkempi kuin aikuisilla. Vaikka emme pysty selittämään mikä pepsiini aiheuttama mekanismi osallistuu makrofagin erilaistumiseen, emme voi sulkea pois, että makrofagien erilaistuminen itse voisivat nopeuttaa refluksi välittämän nielurisojen vaurioita.

Tämän hetken tutkimuksen, pepsiini välittämä refluksi aiheuttaa paitsi suoranaista vahinkoa tonsillar epiteelin, mutta myös edistänyt tonsillar makrofagien tai nielurisojen epiteelisolujen erittämään kemokiinien /sytokiineja, joka veti ja aktivoida immuunijärjestelmän soluja, jotka välittämää joitakin vaurioita nielurisojen limakalvolle. Mikroskooppinen tulehdus, jolle on ominaista TGF β1 ja iNOS ilmaisun nielurisojen kudoksen (krypta epiteelin, ympäröivä germinaalikeskuksen ja lymfaattisen follikkelin liiallinen kehitysmaiden fibrotic ulkonäkö), havaitaan potilailla, joilla on vakavia oireita (tuloksia ei ole esitetty). Tämä merkitsee sitä, että pepsiiniä (ja happo) indusoidun IL-8 ja muiden inflammatoristen välittäjien, jotka refluxate edistää muuttoliikkeen ja aktivoitumisen ääreisverivalkosolut. [14] Nämä tulokset vahvistavat hypoteesin, että sytokiini-välitteinen mekanismi on vastuussa nielurisojen vamma lapsilla nielurisojen liikakasvu. Limakalvon sairastavien potilaiden tonsillar liikakasvua tuottaa huomattavasti suuria määriä erilaisia ​​sytokiineja. [29, 30] Nämä tulehdusvälittäjiä aktivoida immuunijärjestelmän solujen rekrytointi ja siirtymistä sivustoja refluxate vuorovaikutuksen ja voi olla mukana patofysiologiassa nielurisojen liikakasvu.

tulosten perusteella kirjallisuudesta ja tuloksemme tässä tutkimuksessa, ehdotamme, että paikallinen ja systeeminen aktivaatio tulehdus- väyliä edistää lymfosyyttien infiltraatio ja lisääntymistä (mukaan lukien T-solut) sekä makrofagien erilaistumista ja lisääntymistä johtaen tonsillaaristen liikakasvu lisääntyneestä monosyyttisiä ja lymfaattisen solujen määrä. Jos nykyinen tulokset osoittavat olevan tarkkoja, ne voivat tarjota käyttökelpoisen kehityskohde interventioon lähestymistapoja hoitoon tai ehkäisyyn tonsillar liikakasvua lapsilla. Huolimatta huomattavasta näyttöä tulehdusvälittäjiä ja imusoluproliferaatiota patogeneesissä nielurisojen liikakasvu, vuorovaikutus yliherkkyyttä pepsiini refluksi ja nielurisojen tulehdus epäselvää tässä tutkimuksessa. Lisätutkimukset ovat perusteltuja ymmärtää paremmin signalointireittejä mukana synnyssä refluksioireiden ja tulehdus sekä tunnistaa yhdessä kehittää uusia hoitomenetelmiä.

Johtopäätökset

Olemme perustettu että lymfosyytit ja monosyytit ovat erittäin proliferatiivisen tilassa risat tonsillar liikakasvua ja liittyy lisääntynyt ilmentyminen proinflammatoristen tekijöiden seurauksena altistumisesta refluksitaudin pepsiiniä. Nämä havainnot viittaavat siihen mahdollisesti uusia pathophysiological mekanismeista nielurisojen liikakasvu. Meidän in vitro
data asetamme että voi olla mahdollista tavoite luonnehdinta mekanismeja, jotta voidaan kehittää erityisiä hoitoja tähän tautiin osoitus. Meidän tiedot osoittivat, että mekanismeista imukudokseen leviämisen tonsillaaristen liikakasvu ovat erillisiä ja voi mahdollistaa tulevan ei-kirurgiset hoitomuotojen kohdistaminen pepsiiniä, joka voi poistaa tarvetta nielurisojen poisto, ja johtaa involution on hypertrofinen risat.

tukeminen Information
S1 Kuva. Virtaussytometrianalyysin monosyytti väestön ja monosyyttien erilaistumista PBMNCs aikuisten kroonisessa nielurisatulehdus.
Lymfosyytit ja monosyytit tunnistettiin laidat ja sirontamittari. Lymfosyyttien ja monosyyttien vahvistettiin myös värjäämällä CD4- ja CD8- ja CD14-vasta-aineita. PBMNCs viljeltiin makrofagin erityisiä viljelyolosuhteita tai ilman aktivoitua pepsiinillä 15 päivää. Monosyytit populaatio tunnistettiin sivulta ja sirontamittari profiilit virtaussytometriassa jokaisessa kunnossa. Jokainen taso verrattiin arvoon päivänä 8-soluilla ilman pepsiiniä, joka annettiin mielivaltainen arvo "1". Monosyytistä makrofagien erilaistumista tutkittiin värjäämällä CD11 c ja CD163-vasta-aineita.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0152336.s001
(TIF) B

• PLoS ONE: Geometric sekoittamista, peristaltiikan ja geometrinen vaiheen Vatsa
• PLoS ONE: Suoliston Stem Cell tussit suoliston Metaplasia vatsakirurgian ja Barrettin ruokatorvi