PLoS ONE: Extra-Speiseröhren Pepsin von Magen refluxate Promoted Tonsillenhypertrophie

Abstrakt

Hintergrund

gastroösophagealen Reflux ist mit zahlreichen pathologischen Zuständen des oberen Luft- und Speisewege verbunden. Magen-Pepsin innerhalb Reflux trägt zur immunologischen Reaktionen in der Tonsillen. In dieser Studie wollten wir die Beziehungen zwischen Pepsin und Tonsillenhypertrophie zu finden.

Methoden und die Suche nach

Wir erkundeten die Vorstellung, ob Tonsillenhypertrophie zu Pepsin-vermittelten Magen-Reflux bei Tonsillenhypertrophie zurückzuführen war. Fifty-vier Kinder mit Tonsillenhypertrophie und 30 Erwachsene mit Tonsillitis wurden vor der chirurgischen Behandlung rekrutiert. Blut und Tonsillen Gewebe von jedem Patienten wurden für die Analyse von Veränderungen der Lymphozyten und Makrophagen-Zahlen in Verbindung mit histologischen und biochemischen Analyse geerntet. Pepsin wurde auf verschiedenen Ebenen in Tonsillen Gewebe von jeder Tonsillenhypertrophie ausgedrückt. Pepsin-positive Zellen wurden in Kryptenepithel, rund um die lymphatischen Follikel mit der Entwicklung Fibrose, und auch rund um den lymphatischen Follikel, die die Krypta konfrontiert gefunden. Und auch, Pepsin-Färbung wurde gut mit beschädigten tonsillar Plattenepithel und TGF-β1 und iNOS-Expression im Tonsillenschnitt korreliert. Darüber hinaus Pepsin und TGF-β1-positive Zellen wurden mit CD68-positiven Zellen in der Krypta und die umliegenden Keimzentren zusammen lokalisiert. Im Vergleich der Makrophagen Ansprechbarkeit auf Pepsin, wurden periphere mononukleäre Blutzellen (PBMNC) deutlich größer in Gegenwart von Aktiv Pepsin in der untergeordneten Gruppe. Weiterhin wurden CD11c und CD163-positive Zellen durch aktivierte Pepsin signifikant erhöht. Dies wurde jedoch nicht für die Kultur von PBMNCs aus der Erwachsenengruppe gesehen.

Schlussfolgerungen

Die Lymphozyten und Monozyten sind in einem hoch proliferativen Zustand in der Tonsillenhypertrophie und mit einer erhöhten Expression von pro -inflammatory Faktoren als Folge der Exposition gegenüber Magen Reflux Pepsin

Citation:. Kim JH Jeong HS, Kim KM, Lee YJ, Jung MH, Park JJ, et al. (2016) Extra-Speiseröhren Pepsin von Magen refluxate Promoted Tonsillenhypertrophie. PLoS ONE 11 (4): e0152336. doi: 10.1371 /journal.pone.0152336

Editor: Gernot Sissel, Universitätsklinikum Freiburg, DEUTSCHLAND

Empfangen: 5. Oktober 2015; Akzeptiert: 11. März 2016; Veröffentlicht: 8. April 2016

Copyright: © 2016 Kim et al. Dies ist ein offener Zugang Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Datenverfügbarkeit. Alle relevanten Daten sind innerhalb des Papiers und seiner Hintergrundinformationen Dateien

Finanzierung:. Diese Studie wurde von der Basic Science Research Program, durch das National Research Foundation of Korea (NRF), finanziert durch das Ministerium für Wissenschaft, IKT unterstützt wurde, und Zukunftsplanung (2013R1A1A1012542). Diese Studie wurde durch die führenden ausländischen Forschungsinstitut Recruitment-Programm, unterstützt durch die National Research Foundation of Korea (NRF), gefördert durch das Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Technologie (MEST) (2012K1A4A3053142)). Diese Arbeit wurde von biomedcal Forschungsinstitut Fonds (GNUHBIF-2014-0009) von der Gyeongsang National University Hospital unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Tonsillenhypertrophie ist derzeit der häufigste Grund für eine Tonsillektomie. Erweiterung der Tonsillen tritt aufgrund einer absoluten Zunahme der Gesamtzahl der Lymphozyten in das Gewebe und was zu einer Zunahme des Gewebevolumens. [1, 2] Der genaue Mechanismus, durch den noch bestimmt werden hat Stimulation und Proliferation Lymphozyten auftritt. Es wurde gefolgert, dass antigene Stimulation der Gewebe Lymphozyten führt zu einer Erhöhung in lymphozytäre Anzahl und Aktivität. Vorherige Versuche, die pathophysiologischen Mechanismen identifiziert wurden auf mikrobiologische und immunologische Veränderungen in der vergrößerten Mandeln fokussiert. Viele Studien haben eine mögliche Rolle von bakteriellen Organismen in der Pathogenese der Tonsillenhypertrophie berichtet. [3-5] Eine Erhöhung der absoluten Zahl der Lymphozyten in den Tonsillen ohne klinische Infektion wurde zuvor gezeigt, [2], und die spezifischen Antigene verantwortlich für diese Veränderungen nicht identifiziert worden sind.

Neuere Forschungen haben die Beziehung zwischen extraesophageal Refluxkrankheit und oberen Atemwegserkrankungen angesehen. Chronische Sinusitis [6], Otitis media mit Erguss [7-9] und Larynx-Erkrankungen haben alle mit möglichen ursächlichen Verbindungen untersucht worden, um Extraesophageal Reflux. [10, 11] refluxate enthält Magen-Enzyme (Pepsin und HCl) sowie duodeno-Bauchspeicheldrüsen Enzyme (Gallensäuren und Trypsin). Die Rolle von Pepsin im Magensaft als Teil der refluxate und Interaktion mit Otolaryngology-Systemen und in der HNO-Organe (Ohr, Nase und Rachen) intensiv untersucht wurde. [1, 10, 11]

Pepsin ist ein Enzym umgewandelt von Pepsinogen, die durch die Hauptzelle des Magen produziert wird, und spielt eine wichtige Rolle bei der Verdauung. Normalerweise wird, Pepsin fand nur in dem Mageninhalt. Wenn jedoch extraesophageal Reflux auftritt, kann der Mageninhalt aus dem Rückfluss erreichen die Laryngopharynx und Pepsin als Teil des Magens Reflux in den laryngopharyngeal Bereichen detektiert werden. Dies ist tatsächlich der Fall, wie Johnston et al. [12] berichteten, daß Pepsin in der oberen Atemschleimhaut detektiert wurde, und induziert eine proinflammatorische Zytokin Zyklus in Entzündungs ​​Beschädigung der Larynxschleimhaut führt. Diese Daten haben eine Rolle für am Rückfluß gehalten Pepsin in dem Zusammenbruch der Immunabwehrmechanismus in der Schleimhaut oder epithelialen Auskleidungen und Förderung von Entzündungserregern vorgeschlagen. [12-15]

Ebenso für die Tonsillen, wir nahmen an, dass Magen Pepsin innerhalb Reflux hat eine Schlüsselrolle in seiner immunologische Reaktion von Tonsillen und Pepsin Exposition induziert Tonsillenhypertrophie. In dieser Studie wollten wir die Beziehung zwischen Magen-Pepsin und Tonsillenhypertrophie zu finden.

Materialien und Methoden

Ethik-Anweisung

Diese Studie wurde von der Gyeongsang National University Hospital genehmigt wurde Institutional Review Board (# GNUHIRB-2014-02-006). Eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von den Patienten (oder Eltern) vor ihrer Aufnahme in die Studie erhalten.

Studienfächer

Diese Studie an 84 Patienten mit der klinischen Diagnose von Tonsillenhypertrophie durchgeführt wurde. Sie besuchen unser Krankenhaus für die Entfernung von Tonsillen, weil sie an einer chronischen Entzündung an Tonsillen leiden oder Schnarchen /Schlafapnoe aufgrund Tonsillen Erweiterung. Bei allen Patienten wurde eine körperliche Untersuchung, die Diagnose von Tonsillenhypertrophie oder chronischen Tonsillitis zu bestätigen. Die mittlere Größe der Tonsillen war Klasse 2.5 in Tonsillenhypertrophie und Besoldungsgruppe 1.0 in der chronischen Tonsillitis Gruppe. (Tabelle 1). Wir erhielten die Tonsillen Gewebe von 54 Kindern vor ihrer chirurgischen Behandlung (41 Jungen und 13 Mädchen, Altersgruppe 4-16 Jahre, mittleres Alter 8 Jahre) und 30 Erwachsene (17 Männer und 13 Frauen, Altersgruppe 17 und älter, bedeuten Alter 29 Jahre). Patienten mit systemischen Erkrankungen und andere klinische Probleme wurden nicht in die Studie einbezogen. Ganze Tonsillektomie wurde unter Vollnarkose mit Dissektion Verfahren und unteren Teil der Tonsillen wurde für Gewebeentnahmen ausgewählt wurden. Keiner von ihnen hatte jede postoperative Komplikation

Proteinpräparat und Immunoblot-Analyse

Gewebeextrakten aus Mandeln hergestellt wurden, wie folgt:. Mandeln wurden entfernt und homogenisiert in Lysepuffer aus PBS (pH 7,4) hergestellt, 1 % Triton X-100, 1 mM EDTA 10 uM Leupeptin und 200 uM Phenylmethylsulfonylfluorid enthielt. Die Lysate wurden mehrmals für 3 bis 5 min jeweils und zentrifugiert bei 12000 Upm für 20 min bei 4 ° C beschallt. Die Überstände wurden gesammelt und die Proteinkonzentration jedes Lysats wurde unter Verwendung eines Bicinchoninsäure (BCA) -Protein-Assay-Kits (Pierce, Rockford IL, USA) bestimmt nach dem Protokoll des Herstellers. Rinderserumalbumin wurde als Standard verwendet. Gleiche Mengen von Protein (50 ug) wurden zu einer 10% Natriumdodecylsulfat (SDS) Polyacrylamid-Gel geladen auf. Nach der Elektrophorese Proteine ​​in dem Gel wurden auf eine Nitrocellulosemembran übertragen (Schleicher & Schuell, Dassel, Deutschland). Die Membranen wurden mit 5% fettfreier Milch in Tris-gepufferter Salzlösung, enthaltend 0,1% Tween-20 blockiert. Blots wurden mit primären Antikörpern sondiert anti-Pepsin A polyklonale (SC-99081, Santa Cruz Biotechnology CA, USA) bei 4 ° C über Nacht. Als Ladekontrolle wurden die Blots mit anti-β-Actin-Antikörper (Sigma, St. Louis MO, USA) erneut sondiert. mit einem ECL-Kit (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway NJ, USA)

Immunohistochemistry
.;: Der primäre Antikörper wurde unter Verwendung von sekundären Antikörpern (Pierce 10000 Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem Ziegen-IgG-anti-Kaninchen, 1) sichtbar gemacht

Immunostaining wurde auf 5 mm dicke koronale Abschnitte Paraformaldehyd-fixierten und in Paraffin eingebetteten Schnitten durchgeführt, um die Avidin-biotinylierten Meerrettich-Peroxidase-Komplex-Kits (ABC, Vector Laboratories, Burlingame CA, USA) verwendet. Folgende Entparaffinierung in Xylol wurden die Schnitte mit Ethanol rehydriert. Nach dem Waschen in PBS wurden die Schnitte mit 1% normalem Ziegenserum blockiert und dann mit einem Anti-Pepsin A (SC-99081, Santa Cruz), iNOS, TGF-β1 und CD68 Antikörper erworben von Santa Cruz Biotechnology bei 4 ° behandelt C über Nacht in einer befeuchteten Kammer. Nach dem Waschen in PBS wurden sie für 90 min bei Raumtemperatur mit sekundärem Antikörper (200 Santa Cruz Biotechnology, Biotin-konjugiertem Anti-Kaninchen-Immunglobulin G, 1) inkubiert. Schließlich wurden die Schnitte für 60 min bei Raumtemperatur mit ABC inkubiert, in PBS gespült und dann mit 0,027% 3,3'-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid (Sigma) mit 0,003% Wasserstoffperoxid entwickelt. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt (Sigma).

Doppel Immunfluoreszenzanfärbung

Pepsin A-positive Zellen zu charakterisieren, Doppel-Immunfluoreszenz wurde auf den Tonsillen Gewebe durchgeführt. Entparaffinierung und Antigen-Retrieval wurden durchgeführt. Die nicht-spezifische Antikörperbindung wurde mit 0,1% normalem Eselserum (Vector Laboratories) und 0,3% Triton X-100 (Sigma) für 45 min in PBS blockiert. über Nacht verdünnt in PBS, enthaltend 0,1% Rinderserumalbumin (Sigma) bei 4 ° C;: Schnitte wurden dann mit Anti-Pepsin A-Antikörper (sc-99081, Santa Cruz 100 1) inkubiert. Nach dem Spülen Esel Cy3-konjugiertem anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper (1: 100, EMD Millipore, Billerica MA, USA) wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur aufgebracht. Für Doppelmarkierung nach in PBS blockiert 10% normalem Ziegenserum und 0,3% Triton X-100 enthalten, wurden die Schnitte mit Anti-CD68 inkubiert (1: 100; Santa Cruz) bei 4 ° C über Nacht. Alexa488-konjugiertem Anti-Maus-IgG-Sekundärantikörper (1: 100; Invitrogen, Carlsbad CA, USA) wurde dann 1 Stunde bei Raumtemperatur aufgebracht. Schnitte wurden montiert mit Anti-Fading-Lösung, die 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) (Vector Laboratories) und unter einem Fluoreszenzmikroskop (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Deutschland) beobachtet. Auf CD68-positive Zellen, Doppelimmunfluoreszenz wurde durchgeführt, wie oben beschrieben, zu charakterisieren. Für Doppelmarkierung, anti-TGF-β1 (1: 100; Santa Cruz) und anti-iNOS (1: 100; Santa Cruz) wurde aufgetragen und dann Esel Cy3-konjugiertes anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper (1: 100, EMD Millipore ) auf CD68-gefärbten Schnitten.

Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)

Gesamt-RNA wurde aus Tonsillen Gewebe unter Verwendung des TRIzol Verfahren gemäß dem Protokoll vom Hersteller empfohlenen extrahiert ( GIBCO, Grand Island, NY). Gleiche Mengen (5 ug) von DNA-freie Gesamt-RNA aus jeder Probe wurden in cDNA umgewandelt unter Verwendung von 200 U Superscript II RT (GIBCO, Grand Island, NY) in einem 20 ul Reaktionsvolumen. Reverse Transkription wurde für 10 min, 45 min bei 42 ° C bei 22 ° C durchgeführt und bei 95 ° C für 5 min. Die Reaktionsprodukte (2,0 ul) wurden einer PCR-Amplifikation (Promega, Madison, WI, USA) in einem Volumen 50 &mgr; l-Reaktion unterzogen. Jeder Primer-Sequenzen waren wie folgt: IL-1β (189 bp), 5'-TCATTGCTCAAGTGTCTGAAGC-3 '(sense) und 5'-TGGTCGGAGATTCGTAGC-3' (antisense); IL-6 (628 bp), 5'-ATGAACTCCTTCTCCACAAGCGC-3 '(sense) und 5'-GAAGAGCCCTCAGGCTGGACTG-3' (antisense); TNF-β (443 bp), 5'-AGTGACAAGCCTGTAGCCC-3 '(sense) und 5'-GCAATGATCCCAAAGTAGACC-3' (Antisense). PCR wurde unter Verwendung des BioRad-Thermocycler durchgeführt gemäß den vom Hersteller bereitgestellten Anweisungen. Gleiche Volumina der Amplifikationsprodukte um 1,5% Agarose-Gel-Elektrophorese mit 0,5 mg /ml Ethidiumbromidfärbung analysiert.

Die durchflusszytometrische Analyse und In-vitro-Kultivierung

Alle Blutproben wurden nach der Einnahme von Blut innerhalb von 2 Stunden verarbeitet werden. Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMNC) wurden durch Dichtegradientenzentrifugation über einen Ficoll-Gradienten (Sigma, St. Louis MO, USA) für 25 min bei 2.300 rpm isoliert und wurden dreimal in PBS gewaschen. PBMNC bei 1 × 10 ^{5 Zellen wurden dann mittels Durchflusszytometrie analysiert. Ob Pepsin in Monozyten zu Makrophagen-Differenzierung beteiligt ist, wurden die verbleibenden Zellen auf Kulturschalen in Gegenwart /oder Abwesenheit von aktivierten Pepsin beschichtet (Thermo Scientific, Rockford IL, USA), die Monozyten-Kulturbedingungen. Um das Niveau der Makrophagenpopulation zu identifizieren, nach 8 und 15 Tagen wurden die Zellen geerntet und untersucht durch Durchflußzytometrie Antikörper für CD11c und CD163 verwenden. Alle Zellkulturen wurden bei 37 ° C gehalten und mit 5% CO _{2 in einer befeuchteten Atmosphäre.}}

Die Lebensfähigkeit der Zellen

RAW264.7-Zellen, Maus-Makrophagen-Zelllinie, wurden kultiviert die Wirkung von Pepsin auf Makrophagen-Proliferation zu untersuchen. Die Zellen wurden in verschiedenen Konzentrationen von Pepsin (0,01-5 ug /ml) und die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch CCK-8-Kit (Cell Counting Kit-8, Dojindo Molecular Tech. Inc., Rockville, MD, USA) untersucht, behandelt. Die Lebensfähigkeit der Zellen in jeder Konzentration wurde als fache Änderung dargestellt. Die Falte ändert sich das Verhältnis der Endwert in der jeweiligen Gegenwart von Pepsin auf den Wert in Abwesenheit von Pepsin berechnet (gesetzt als "1"). Werte sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. * P
< 0,05 gegenüber dem entsprechenden Abwesenheit von Pepsin (0 ug /ml).

In-vitro-
Migrationstest

Ein Standard-Wundmodell einschichtigen Kratzer wurde verwendet, um die Reaktionsfähigkeit zu charakterisieren Makrophagen Pepsin. RAW264.7-Zellen wurden in 6-Well-Gewebekulturplatten bis zur Konfluenz ausgesät, und die Monoschichten wurden durch Kratzen an der Oberfläche der Gewebekultur-Plastik mit einer Rasierklinge verletzt. Die Klinge wurde in der Mitte der Schale nach unten gedrückt, so dass die Zellschicht Schneiden und gleichzeitig Kennzeichnung der "Wund boundary" auf der darunterliegenden Kunststoff. Dann wurde die Klinge gleiten sanft unidirektional Hälfte der konfluente Zellschicht zu entfernen. Die "verwundete einschichtigen" wurde zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung pH 7,4 (PBS), erneut zugeführt und mit 1 mM Mitomycin-haltige serum entzogen Medium gewaschen und für 24 Stunden unter Standardkulturbedingungen inkubiert.

Statistical Analyse

Alle Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt Vergleiche zwischen den Gruppen wurden durch zweiseitige analysiert t
Test. Wahrscheinlichkeitswerte ( P
) < 0,05 als signifikant erachtet wurden.

Ergebnisse

• PLoS ONE: Geometrische Mischen, Peristaltik und die geometrische Phase des Stomach
• PLoS ONE: Intestinale Stammzell-Marker in der intestinale Metaplasie des Magens und des Barrett-Ösophagus