PLOS ONE: pepsine extra-oesophagien de l'estomac reflué Promu Tonsil Hypertrophie

Résumé

Contexte

reflux gastro-oesophagien est associée à de nombreuses conditions pathologiques des voies aérodigestives supérieures. pepsine gastrique au sein de reflux contribue à des réactions immunitaires dans l'amygdale. Dans cette étude, nous avons cherché à trouver les relations entre la pepsine et de l'hypertrophie des amygdales.

Méthodes et trouver

Nous avons exploré la notion de savoir si l'hypertrophie des amygdales était due à un reflux gastrique pepsine médiée par l'amygdale hypertrophie. Cinquante-quatre enfants avec les amygdales et l'hypertrophie 30 adultes souffrant d'une amygdalite ont été recrutés avant le traitement chirurgical. Le sang et les tissus amygdales de chaque patient ont été récoltés pour l'analyse des changements dans le nombre de lymphocytes et de macrophages associés à l'analyse histologique et biochimique. Pepsine a été exprimé à différents niveaux dans les tissus d'amygdales de chaque hypertrophie des amygdales. cellules pepsine-positives ont été trouvées dans l'épithélium de la crypte, entourant le follicule lymphoïde avec le développement de la fibrose, et entourant également le follicule lymphoïde qui fait face à la crypte. Et aussi, la pepsine coloration était bien corrélée avec l'épithélium endommagé amygdales épidermoïde et le TGF-β1 et l'expression de iNOS dans la section des amygdales. En outre, la pepsine et le TGF-β1-positifs cellules ont été co-localisés avec des cellules CD68-positives dans la crypte et autour des centres germinaux. En comparaison de la réactivité de macrophages à la pepsine, les cellules mononucléées du sang périphériques (PBMNCs) sont sensiblement plus grandes, en présence de pepsine activés dans le groupe des enfants. En outre, CD11c et les cellules CD163 positives ont été significativement augmentés par la pepsine activée. Cependant, cela n'a pas été vu pour la culture de PBMNCs du groupe des adultes.

Conclusions

Les lymphocytes et monocytes sont dans un état très proliférante dans l'hypertrophie des amygdales et associés à une expression accrue de pro facteurs-inflammatoires en raison de l'exposition au reflux de l'estomac pepsine

Citation:. Kim JH, Jeong HS, Kim KM, Lee YJ, Jung MH, Parc JJ, et al. (2016) extra-oesophagien pepsine de l'estomac reflué Promu Tonsil Hypertrophie. PLoS ONE 11 (4): e0152336. doi: 10.1371 /journal.pone.0152336

Editeur: Gernot Zissel, Universitätsklinikum Freiburg, ALLEMAGNE

reçues: 5 Octobre 2015; Accepté 11 Mars 2016; Publié: 8 Avril 2016

Droit d'auteur: © 2016 Kim et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données:. Tous pertinents les données sont dans le ses fichiers de renseignements à l'appui du papier et

financement:. Cette étude a été soutenue par le Programme de recherche en sciences de base, à travers la Fondation pour la recherche nationale de Corée (NRF), financé par le ministère de la science, les TIC, et la planification future (2013R1A1A1012542). Cette étude a également été soutenu par le Programme de recrutement Institut de recherche étrangère de premier plan, par la National Research Foundation de Corée (NRF), financé par le Ministère de l'éducation, des sciences et de la Technologie (MEST) (2012K1A4A3053142)). Ce travail a été soutenu par biomedcal fonds d'institut de recherche (GNUHBIF-2014-0009) de l'hôpital de l'Université nationale de Gyeongsang. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

Tonsil hypertrophie est actuellement la raison la plus courante pour amygdalectomie. L'élargissement des amygdales se produit en raison d'une augmentation absolue du nombre total de lymphocytes dans le tissu et qui entraîne une augmentation du volume des tissus. [1, 2] Le mécanisme précis par lequel la stimulation des lymphocytes et la prolifération se produit n'a pas encore été déterminée. Il a été déduit que la stimulation antigénique des lymphocytes des tissus conduit à une augmentation du nombre et de l'activité lymphocytaire. Les précédentes tentatives d'identifier les mécanismes physiopathologiques ont mis l'accent sur les changements microbiologiques et immunologiques dans une hypertrophie des amygdales. De nombreuses études ont fait état d'un rôle possible des organismes bactériens dans la pathogenèse de l'hypertrophie des amygdales. [3-5] Toutefois, une augmentation du nombre absolu de lymphocytes dans les amygdales sans une infection clinique a été montré précédemment [2], et les antigènes spécifiques responsables ces changements ne sont pas identifiés.

des recherches récentes ont examiné la relation entre la maladie de reflux extraesophageal et les troubles des voies respiratoires supérieures. Sinusite chronique [6], otite moyenne avec épanchement [7-9] et les troubles laryngés ont tous été étudiés avec des liens possibles étiologiques à extraesophageal reflux. [10, 11] reflué contient des enzymes gastriques (pepsine et HCl), ainsi que duodéno-pancréatique des enzymes (des acides biliaires et de la trypsine). Le rôle de la pepsine dans le suc gastrique dans le cadre du reflué et de l'interaction avec les systèmes d'otorhinolaryngologie et dans les organes ORL (oreille, nez et gorge) a été largement étudiée. [1, 10, 11]

pepsine est un enzyme converti de pepsinogène, qui est produite par la cellule principale de l'estomac, et joue un rôle important dans la digestion. Normalement, la pepsine se trouve uniquement dans le contenu de l'estomac. Cependant, si le reflux extraesophageal se produit, le contenu de l'estomac du reflux peuvent atteindre le laryngopharynx, et la pepsine dans le cadre du reflux gastrique peut être détectée dans les zones de laryngopharyngée. Tel est bien le cas, comme Johnston et al. [12] ont rapporté que la pepsine a été détectée dans la muqueuse des voies respiratoires supérieures et induit un cycle de cytokines pro-inflammatoires, ce qui entraîne des lésions inflammatoires de la muqueuse laryngée. Ces données ont suggéré un rôle pour la pepsine reflux dans la panne du mécanisme de défense immunitaire dans la muqueuse ou des garnitures épithéliales et la promotion des agents causant inflammatoires. [12-15]

De même pour l'amygdale, nous avons supposé que gastrique pepsine au sein de reflux a un rôle clé dans sa réaction immunologique de l'amygdale et que l'exposition de la pepsine induit une hypertrophie des amygdales. Dans cette étude, nous avons cherché à trouver la relation entre la pepsine gastrique et hypertrophie des amygdales.

Matériel et méthodes

Éthique déclaration

Cette étude a été approuvée par l'hôpital universitaire national Gyeongsang Institutional Review Board (# de GNUHIRB-2014-02-006). Le consentement éclairé écrit a été obtenu à partir des tous les patients (ou les parents) avant leur inclusion dans l'étude.

Sujets de l'étude

Cette étude a été réalisée sur 84 patients avec le diagnostic clinique de l'hypertrophie des amygdales. Ils visitent notre hôpital pour l'élimination des amygdales parce qu'ils souffrent d'une inflammation chronique à l'amygdale ou le ronflement /apnée du sommeil en raison de l'élargissement de l'amygdale. Tous les patients ont subi un examen physique pour confirmer le diagnostic de l'hypertrophie des amygdales ou amygdalite chronique. La taille moyenne de l'amygdale était de grade 2,5 dans le groupe amygdale hypertrophie et le grade 1.0 dans le groupe de l'amygdalite chronique. (Tableau 1). Nous avons obtenu les tissus d'amygdales de 54 enfants avant leur traitement chirurgical (41 garçons et 13 filles; tranche d'âge 4-16 ans, âge moyen de 8 ans) et de 30 adultes (17 hommes et 13 femmes, tranche d'âge 17 ans et plus, dire l'âge de 29 ans). Les patients souffrant de troubles systémiques et d'autres problèmes cliniques ne sont pas inclus dans cette étude. Whole amygdalectomie a été réalisée sous anesthésie générale en utilisant la méthode de dissection et une partie inférieure de l'amygdale a été sélectionné pour le prélèvement de tissus. Aucun ne présentait aucune complication post-opératoire

Préparation des protéines et analyse par immunotransfert

extraits de tissus provenant des amygdales ont été préparées comme suit:. Amygdales ont été prélevés et homogénéisés dans un tampon de lyse composé de PBS (pH 7,4), 1 % de Triton X-100, 1 mM d'EDTA, contenant 10 pM de leupeptine et 200 uM de fluorure de phénylméthylsulfonyle. Les lysats ont été soumis à une sonication à plusieurs reprises pendant 3 à 5 min à chaque fois et on centrifuge à 12 000 tpm pendant 20 min à 4 ° C. Les surnageants ont été recueillis et la concentration en protéines de chaque lysat a été déterminée en utilisant un acide bicinchoninique (BCA), kit de dosage des protéines (Pierce, Rockford IL, USA) selon le protocole du fabricant. albumine de sérum bovin a été utilisée comme étalon. Des quantités égales de protéine (50 ug) ont été chargés sur un gel de Polyacrylamide à 10% de dodécylsulfate de sodium (SDS). Après électrophorèse, les protéines dans le gel ont été transférées sur une membrane de nitrocellulose (Schleicher &Schuell, Dassel, Allemagne). Les membranes ont été bloquées avec 5% de lait écrémé dans une solution saline tamponnée au Tris contenant 0,1% de Tween-20. Les transferts ont été sondés avec des anticorps primaires polyclonaux anti-pepsine A (sc-99081, Santa Cruz Biotechnology CA, USA) à 4 ° C pendant la nuit. En tant que témoin de chargement, buvards ont été re-sondé avec un anticorps anti-β-actine (Sigma, St. Louis MO, USA). L'anticorps primaire a été visualisé en utilisant des anticorps secondaires (la peroxydase de raifort de chèvre conjugué anti-lapin IgG, 1: 10.000; Pierce) avec un kit ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway NJ, USA):

immunohistochimie
.

immunocoloration a été réalisée sur 5 mm d'épaisseur des coupes coronales de sections de paraformaldehyde fixe et paraffine en utilisant les kits de peroxydase complexe avidine-biotinylé-raifort (ABC, Vector Laboratories, Burlingame CA, USA). À la suite de déparaffinage dans le xylène, les coupes ont été réhydratées avec de l'éthanol. Après lavage dans du PBS, les sections ont été bloquées avec 1% de sérum de chèvre normal et ensuite traitées avec un anticorps anti-pepsine A (sc-99081, Santa Cruz), l'iNOS, le TGF-β1, et des anticorps CD68 acheté auprès de Santa Cruz Biotechnology à 4 ° C C pendant une nuit dans une chambre humidifiée. Après lavage dans du PBS, elles sont incubées pendant 90 min à température ambiante avec l'anticorps secondaire (Santa Cruz Biotechnology, conjugué à la biotine anti- immunoglobuline G de lapin, 1: 200). Enfin, les coupes ont été incubées avec ABC pendant 60 min à température ambiante, rincés dans du PBS, puis développées avec 0,027% de 3,3'-diaminobenzidine (Sigma) avec 0,003% de peroxyde d'hydrogène. Les sections ont été colorées avec de l'hématoxyline (Sigma).

Double immunofluorescence

Pour caractériser les cellules A-positives pepsine, double immunofluorescence a été réalisée sur les tissus d'amygdales. Déparaffinage et la récupération de l'antigène ont été effectuées. Anticorps liaison non spécifique a été bloquée dans du PBS avec 0,1% de sérum d'âne normal (Vector Laboratories) et 0,3% de Triton X-100 (Sigma) pendant 45 min. Les coupes ont été ensuite mises en incubation avec un anticorps anti-pepsine Un anticorps (1: 100, SC-99081, Santa Cruz) dilué dans du PBS contenant 0,1% de sérum albumine bovine (Sigma) à 4 ° C pendant une nuit. Après rinçage, l'âne conjugué à Cy3 anti-IgG de lapin secondaire (1: 100; EMD Millipore, Billerica MA, USA) a été appliquée pendant 1 heure à température ambiante. Pour un double marquage, après le blocage dans du PBS contenant 10% de sérum normal de chèvre et 0,3% de Triton X-100, les sections ont été incubées avec un anticorps anti-CD68 (1: 100; Santa Cruz) à 4 ° C pendant une nuit. anticorps Alexa488 conjugué IgG anti-souris secondaire (1: 100; Invitrogen, Carlsbad CA, USA) a ensuite été appliqué pendant 1 heure à température ambiante. Les coupes ont été montées avec une solution anti-décoloration contenant de 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (Vector Laboratories) et observées au microscope à fluorescence (Carl Zeiss Microscopie GmbH, Jena, Allemagne). Pour caractériser les cellules CD68-positives, double immunofluorescence a été réalisée, comme décrit ci-dessus. Pour un double marquage, anti-TGF-β1 (1: 100; Santa Cruz) et anti-iNOS (1: 100; Santa Cruz) ont été appliqués et ensuite âne conjugué à Cy3 anti-lapin de l'anticorps secondaire IgG (1: 100; Millipore ) sur des coupes colorées CD68.

Reverse réaction en chaîne par polymérase-transcription (RT-PCR)

ARN total a été extrait des tissus de l'amygdale en utilisant la méthode Trizol selon le protocole recommandé par le fabricant ( GIBCO, grand Island, NY). des quantités égales (5 ug) de l'ARN total sans ADN de chaque échantillon ont été converties en ADNc en utilisant 200 U de SuperScript II RT (GIBCO, Grand Island, NY) dans un volume de réaction de 20 ul. Une transcription inverse a été réalisée à 22 ° C pendant 10 min, à 42 ° C pendant 45 min et à 95 ° C pendant 5 min. Les produits de réaction (2,0 ul) ont été soumis à une amplification par PCR (Promega, Madison, WI, États-Unis) dans un volume réactionnel de 50 ul. Chacune des séquences d'amorces sont les suivantes: IL-1β (189 pb), 5'-TCATTGCTCAAGTGTCTGAAGC-3 '(sens) et 5'-TGGTCGGAGATTCGTAGC-3' (antisens); IL-6 (628 pb), 5'-ATGAACTCCTTCTCCACAAGCGC-3 '(sens) et 5'-GAAGAGCCCTCAGGCTGGACTG-3' (antisens); Le TNF-β (443 pb), 5'-AGTGACAAGCCTGTAGCCC-3 '(sens) et 5'-GCAATGATCCCAAAGTAGACC-3' (anti-sens). La PCR a été réalisée en utilisant le thermocycleur Biorad selon les instructions fournies par le fabricant. Des volumes égaux des produits d'amplification ont été analysés par 1,5% de l'électrophorèse sur gel d'agarose avec 0,5 mg /ml de bromure d'éthidium.

Débit d'analyse cytométrique et in vitro
culture

tous les échantillons de sang ont été traités dans les 2 heures après la prise de sang. Les cellules mononucléées du sang périphériques (PBMNCs) ont été isolées par centrifugation en gradient de densité sur un gradient de Ficoll (Sigma, St. Louis MO, USA) pendant 25 min à 2300 tpm et on a lavé trois fois dans du PBS. PBMNCs à 1 × 10 ^{5 cellules ont ensuite été analysées par cytométrie de flux. Que la pepsine est impliqué dans des monocytes à la différenciation des macrophages, les cellules restantes ont été étalées sur des boîtes de culture en présence /ou l'absence de pepsine activé (Thermo Scientific, Rockford IL, USA) contenant des conditions de culture de monocytes. Pour identifier le niveau de la population de macrophage, après 8 et 15 jours, les cellules ont été récoltées et analysées par cytométrie en flux en utilisant un anticorps pour CD11c et CD163. Toutes les cultures cellulaires ont été maintenues à 37 ° C avec 5% de CO _{2 dans une atmosphère humidifiée.}}

La viabilité cellulaire
cellules

RAW264.7, lignée cellulaire de type macrophage souris, ont été cultivées pour étudier l'effet de la pepsine sur la prolifération des macrophages. Les cellules ont été traitées dans diverses concentrations de pepsine (0,01-5 pg /ml) et la viabilité des cellules a été examinée par CCK-8 kit (Cell Counting Kit-8, Dojindo moléculaire Tech. Inc., Rockville, MD, USA). La viabilité des cellules dans chaque concentration a été représentée comme facteur de changement. Les modifications de pliage sont calculées en tant que rapport de la valeur finale de la chaque présence de pepsine à la valeur en l'absence de pepsine (définis comme "1"). Les valeurs sont représentées sous forme de moyenne ± SEM. * P
< 0,05 par rapport à l'absence correspondante de pepsine (0 pg /ml).

In vitro
migration test

Un modèle standard de la plaie monocouche zéro a été utilisée pour caractériser la réactivité les macrophages à la pepsine. les cellules RAW264.7 ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits de culture de tissu, en culture jusqu'à la confluence, et les monocouches ont été blessés en grattant le long de la surface de la culture tissulaire en matière plastique avec une lame de rasoir. La lame a été enfoncée dans le milieu de l'assiette, coupant ainsi la couche de cellules et le marquage en même temps que la «limite de la plaie" sur le plastique sous-jacente. Ensuite, la lame a été doucement glissé unidirectionnelle pour éliminer la moitié de la couche de cellules confluentes. Le «monocouche blessé» a été lavée deux fois avec du tampon phosphate salin à pH 7,4 (PBS), ré-alimenté avec un milieu de sérum dépourvu contenant mitomycine 1 mM, et on fait incuber dans des conditions standard de culture pendant 24 heures.

statistique analyse

Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM Les comparaisons entre les groupes ont été analysés par deux tailed t
test. Les valeurs de probabilité ( P
) < 0,05 ont été considérées comme significatives.
de

Résultats pepsine a été exprimée dans l'amygdale

Données immunotransfert ont montré que la protéine de la pepsine a été exprimée en une seule bande à partir d'extraits des deux amygdales de patients avec une hypertrophie des amygdales. Pepsine a été fortement exprimée sous forme de plusieurs bandes dans le contrôle positif des extraits de tissus de l'estomac. Pratiquement aucune coloration à la pepsine a été observée dans d'autres tissus, y compris la tumeur, les ganglions lymphatiques (LN), de la thyroïde (Ta), de la glande parotide (parotide g.), Les glandes salivaires (SG) (figure 1A). Tous les tissus d'amygdales présentaient un signal positif pour la pepsine (figure 1B). Cependant, les niveaux de pepsine dans l'amygdale de détection étaient légèrement différentes chez chaque patient (figure 1B). La coloration immunohistochimique a été réalisée pour identifier les cellules positives à la pepsine dans le tissu d'amygdale. cellules pepsine positif se trouvent sélectivement dans l'épithélium de surface ci-dessous, principalement situé dans la crypte (figure 1C-a et b), entourant les centres germinaux plus négatifs (figure 1C-c et d), et entourant également le follicule lymphoïde avec excessive le développement de la fibrose (figure 1C-e et f). les sections de l'estomac utilisés comme témoin positif a montré une forme typique de la pepsine coloration, principalement dans les cellules glandulaires (figure 2D-a), mais pas dans les ganglions lymphatiques (figure 1D-b) et de la thyroïde (figure 1D-c).

les cellules pepsine-positives ont été détectées dans l'amygdale endommagé épithélium

pour confirmer la relation avec les amygdales épidermoïde dommages de l'épithélium et le reflux, nous avons essayé de trouver des cellules de pepsine-positif dans le épithéliale amygdales blessés ou intacts architecture. épithélium endommagé, irrégulier ou cassé, ont été trouvés dans les tissus d'amygdales avec hypertrophie des amygdales (figure 2A et 2D, ci-dessous). cellules pepsine-positives ont été détectées dans les sites blessés (droit d'insérer dans la figure 2A, 2D, 2E et 2F) par rapport à l'épithélium normal (insert gauche sur la figure 2A et 2B). En particulier, les signaux ont été fortement trouvés autour Fentes et endommagé amygdale épithélium squameux (lignes en pointillés sur la figure 2C et 2E).
Cellules

TGF-ß1 et iNOS positifs ont été détectés dans l'amygdale des patients présentant une hypertrophie des amygdales

la coloration immunohistochimique pour le TGF-β1 et iNOS a été réalisée pour étudier la relation entre la pepsine coloration et de l'inflammation. Les deux signaux de TGF-ß1 et iNOS positifs ont également été détectés dans des régions similaires à la pepsine de coloration, par exemple dans l'épithélium de la crypte (figure 3A et 3B), qui entoure les centres germinaux (figure 3C et 3D), et entourant les follicules lymphoïdes avec excessive fibrose développement (figure 3E et 3F).

pepsine et TGF-β1 ont été détectés dans les cellules CD68-positives dans le tissu amygdales hypertrophie

Comme décrit dans l'introduction, nous avons supposé que la pepsine coloration dans la amygdales provient de l'estomac et pourrait être liée à une inflammation des amygdales. Double coloration par immunofluorescence pour CD68 a été effectuée pour caractériser les cellules pepsine positive. CD68 est une glycoprotéine transmembranaire de 110-kd et un marqueur représentatif des monocytes humains et des macrophages tissulaires impliqués dans l'inflammation. cellules CD68-positives ont été clairement observés dans l'amygdale avec amygdales hypertrophie (figure 4). À noter, les cellules CD68-positives fortement colocalisés avec de la pepsine et les cellules TGF β1-positives les deux dans la crypte (figure 4A) et autour des centres germinaux (figure 4B). Contrairement à colocalisation de pepsine et CD68, la pepsine n'a pas co-localiser avec des lymphocytes B (CD20 positif) dans les centres folliculaires et les lymphocytes T (CD45) dans les régions interfolliculaires (figure 4C). Ces données, ainsi que celui représenté sur la figure 3 ont suggéré que la pepsine coloration pourrait être liée à des réponses inflammatoires dans l'amygdale des patients souffrant d'une hypertrophie des amygdales. Et aussi, de mettre en évidence le mécanisme majeur de lésion amygdale par des médiateurs inflammatoires à médiation par les globules blancs, y compris PBMNCs et les macrophages, les niveaux pour amygdalien de l'IL-6, IL-1β et TNF-α ARNm ont été examinés par RT-PCR (figure 4D). Fait intéressant, tous ces ont été exprimés dans les tissus d'amygdales avec hypertrophie des amygdales. Ces données suggèrent que le principal mécanisme de l'hypertrophie des amygdales peut être causée par des médiateurs inflammatoires.

pepsine a conduit les patients dérivées des monocytes pour différencier les macrophages

Pour confirmer la relation de pepsine coloration et les macrophages, nous avons cultivé des cellules mononucléaires de sang périphériques (PBMNCs) provenant de patients hypertrophiques amygdaliennes dans un milieu de culture macrophage (en présence ou en l'absence de pepsine activé) pendant 15 jours. Nous en outre déterminé les niveaux de population de monocytes, et analysé macrophage phénotype par cytométrie en flux. les macrophages humains sont produits par la différenciation des monocytes dans les tissus. Ils jouent un rôle essentiel dans la défense non spécifique (immunité innée), et aident également initier des mécanismes de défense spécifiques (immunité adaptative) par le recrutement d'autres cellules immunitaires telles que les lymphocytes. Ils peuvent être identifiés en utilisant la cytométrie de flux par leur expression spécifique des protéines en tant que marqueurs CD comprenant CD11c et CD163. La population de monocytes inférées d'un côté d'écoulement et diffusion vers l'avant (figure 5A) a été significativement augmentée en présence de pepsine activé (aPepsin), par comparaison à aucune augmentation au jour 8, et pas d'augmentation significative au jour 15 (figure 5B). En outre, nous avons étudié la différenciation de monocytes en macrophages en utilisant des anticorps CD11c et CD163. Les cellules CD11c et CD163-positifs ont été significativement augmentés par aPepsin le jour 8 après la culture. Aucune importance n'a été trouvée dans d'autres conditions (figure 5C). Cependant, la population de monocytes n'a pas été significative et aussi des niveaux de CD11c et CD163 dans le groupe des adultes à la fois le jour 8 et 15. Ces données suggèrent que la pepsine est potentiellement impliquée dans la différenciation des macrophages et les enfants ayant augmenté reflux gastrique peut être plus exposée aux effets d'une environnement pepsine que les adultes.

pepsine induite macrophage la viabilité et de la migration

Nous avons également cherché à savoir si la pepsine a été impliqué dans la fonction macrophage. les cellules RAW264.7 ont été cultivées en présence ou en l'absence de pepsine activé durant 24 heures. Il y avait une augmentation significative de la dose-dépendante de la viabilité des cellules RAW264.7 par la pepsine (figure 6A). La migration des cellules RAW264.7 a également été induite par la pepsine dans les deux plaies de zéro et Transwell essais du système de migration (figure 6B et 6C).

Discussion

Cette première étude a montré que la pepsine a été détectée dans le cellules amygdales hypertrophiques et pepsine-positifs ont été localisés dans l'épithélium crypt entourant le centre germinatif, et dans le follicule lymphoïde avec excessive apparence fibrotique développement. Notamment, la pepsine coloration a été corrélée avec l'expression de facteurs liés à l'inflammation, et la pepsine et CD68 colocalisés, et la pepsine activé conduit à la différenciation des monocytes à macrophages. [16] Ces résultats soulignent potentiellement de nouveaux mécanismes physiopathologiques de l'hypertrophie des amygdales sous-jacente.

inflammation intense est un facteur de risque connu pour amygdales hypertrophie. [17] médiateurs TGF-β1 et iNOS sont connus de l'inflammation. [18-20] dans les amygdales hypertrophiques, l'augmentation du nombre de cellules T et B ont montré une corrélation positive avec bactérienne compte et la taille des amygdales. [21, 22] Dans les études épidémiologiques, le tabagisme, les allergies et les infections respiratoires récurrentes pourrait associer à transitoire ou une hypertrophie permanente du tissu lymphoïde. [22, 23] paramètres immunologiques, la prédisposition génétique et le dysfonctionnement des lymphocytes locaux semblent jouer un rôle dans l'étiologie de l'amygdalite récurrente et une hypertrophie des amygdales. [22, 24] Certaines études ont démontré que l'hypertrophie amygdalienne était associée à une augmentation de la taille lymphoïde des follicules, mais pas le nombre de follicules [25] et est également liée à l'augmentation du poids de l'amygdale, l'augmentation de follicules diamètre, la surface et le nombre. [26]

stimuli récurrents par des agents pathogènes, au cours du processus inflammatoire, conduisent à l'activation des monocytes et des macrophages. [27] les cytokines sécrétées par les macrophages stimulent les cellules immunitaires, et aussi causer la prolifération des cellules endothéliales et les fibroblastes. [28] avec le temps, un tissu immunologiquement actif est remplacé par du tissu fibrotique. [28] Dans cette étude, nous avons supposé que l'antigène a été pepsine et nous a proposé deux hypothèses pour expliquer l'observation de l'hypertrophie des amygdales avec reflux gastrique (figure 7). Un mécanisme pourrait être la stimulation directe des lymphocytes par la pepsine de reflué qui sont reconnus comme antigénique. Un autre mécanisme possible impliquant des lésions induites par la pepsine à l'épithélium dans les cryptes amygdales, ce qui se traduit par des bactéries résidentes cryptes avec une stimulation antigénique continue de la crypte épithélium spécialisé. Ceux-ci conduirait à une augmentation du nombre de lymphocytes et peuvent jouer un rôle dans l'hypertrophie des amygdales.

Initialement pepsine entre en contact avec l'épithélium et est présenté aux lymphocytes intraépithéliaux, les lymphocytes, les lymphocytes subépithéliaux interfolliculaires et intrafolliculaires , dans cet ordre. Les lymphocytes prolifèrent alors en réponse à la pepsine agissant comme un antigène, ce qui provoque les follicules des amygdales pour agrandir et les tissus d'amygdales de subir une hypertrophie. En variante, les macrophages tissulaires amygdale reconnaissent la pepsine de reflux à médiation sur leur surface cellulaire comme un corps étranger et sont activés. l'activation des macrophages entraîne la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires, et ces cytokines induisent l'inflammation ainsi que l'activation des lymphocytes supplémentaires, qui donnent lieu à une hypertrophie des amygdales. Cette dernière hypothèse semble avoir un plus grand soutien que le premier puisque, comme le montre la figure 4, les cellules de la pepsine et CD68-positives ont été colocalisés au-dessous de l'épithélium de surface située dans la crypte (figure 4A) et entourant également les follicules lymphoïdes avec excès de la fibrose qui suit (fig 4B). Cependant, peu de corrélation avec la pepsine et CD20 et CD45, comme marqueurs de cellules B et T, respectivement, a été observée dans le tissu de l'amygdale (figure 4C).

Nous avons également évalué l'expression de CD163 de culture PBMNCs avec hypertrophie des amygdales . CD163 est exprimé uniquement par les macrophages matures, mais absent sur les monocytes. On a cultivé PBMNCs pendant 8 à 15 jours en présence de 10% de FCS et 10 ng /ml de M-CSF, en suivant les conditions classiques de la culture de macrophages humains. Résultats de in vitro
PBMNCs études en culture ont montré que dans le groupe des enfants, le nombre de cellules CD163 positives étaient significativement plus élevés en présence de pepsine activé en tant que cellules CD11c positif ainsi. A titre de comparaison, il n'y avait pas de différence dans l'expression de CD11c et CD163 à partir de la culture de PBMNCs des adultes (S1) Fig. Ces données suggèrent qu'une réaction PBMNC à la pepsine activée chez l'enfant peut être plus sensibles que les adultes. Bien que nous ne pouvons pas expliquer quel mécanisme induit par la pepsine est impliquée dans la différenciation des macrophages, nous ne pouvons pas exclure que la différenciation des macrophages se pourrait accélérer les dommages des amygdales reflux médiée.

Selon l'étude actuelle, le reflux de la pepsine médiée provoquent non seulement des dommages directs à l'épithélium des amygdales, mais aussi stimulé les macrophages des amygdales ou des cellules épithéliales des amygdales à sécréter des chimiokines /cytokines qui ont attiré et activés les cellules immunitaires qui médiées certains des dommages à la muqueuse des amygdales. l'inflammation microscopique, caractérisé par le TGF-β1 et l'expression de iNOS dans le tissu d'amygdale (crypte épithélium, qui entoure le centre germinatif et les follicules lymphoïdes avec le développement excessif apparition fibrotique), on observe chez les patients présentant des symptômes graves (données non présentées). Ceci implique que la pepsine (et de l'acide) de production induite par l'IL-8 et d'autres médiateurs inflammatoires par les reflué favorisent la migration et l'activation des leucocytes du sang périphérique [14]. Ces résultats corroborent l'hypothèse selon laquelle un mécanisme de cytokine est responsable de la blessures amygdales chez les enfants présentant une hypertrophie des amygdales. La muqueuse des patients atteints d'hypertrophie des amygdales produit beaucoup de grandes quantités de diverses cytokines. [29, 30] Ces médiateurs inflammatoires activent le recrutement des cellules immunitaires et la migration vers les sites d'interaction reflué et peuvent être impliqués dans la physiopathologie de l'amygdale hypertrophie.

sur la base des résultats de la littérature et de nos résultats dans cette étude, nous proposons que l'activation locale et systémique des voies inflammatoires favorisera l'infiltration des lymphocytes et la prolifération (y compris les cellules T) ainsi que la différenciation des macrophages et la prolifération entraîne une hypertrophie des amygdales de l'augmentation du monocytes et le nombre de cellules lymphocytaires. Si les résultats actuels révéleront exacts, ils peuvent constituer une cible viable pour le développement d'approches d'intervention pour le traitement ou la prévention de l'hypertrophie des amygdales chez les enfants. En dépit des preuves considérables pour les médiateurs inflammatoires et la prolifération des lymphocytes dans la pathogenèse de l'amygdale hypertrophie, l'interaction entre l'hypersensibilité à la pepsine reflux et l'inflammation des amygdales reste incertaine dans cette étude. D'autres études sont nécessaires pour mieux comprendre les voies de signalisation impliquées dans la genèse des symptômes de reflux et de l'inflammation et d'identifier ainsi que le développement de nouvelles approches thérapeutiques.

Conclusions

Nous avons établi que les lymphocytes et les monocytes sont en un état hautement proliférante dans les amygdales avec une hypertrophie amygdalienne et associée à une expression accrue de facteurs pro-inflammatoires en raison de l'exposition au reflux gastrique pepsine. Ces résultats mettent en évidence les mécanismes physiopathologiques potentiellement nouveaux sous-jacents des amygdales hypertrophie. De nos in vitro
données, nous établissons qu'il peut y avoir la possibilité de caractérisation objective des mécanismes impliqués dans le but de développer des traitements spécifiques pour cette indication de la maladie. Nos données suggèrent que les mécanismes sous-jacents prolifération du tissu lymphoïde dans l'hypertrophie des amygdales sont distincts et peuvent permettre des interventions thérapeutiques non chirurgicales futures ciblant la pepsine qui peuvent éviter la nécessité d'une amygdalectomie, et conduisant à l'involution des amygdales hypertrophiques.

Informations complémentaires
S1 Fig. L'analyse par cytométrie de la population de monocytes et la différenciation des monocytes de PBMNCs des adultes souffrant d'une amygdalite chronique.
Lymphocytes et monocytes ont été identifiés avec le côté et diffusion vers l'avant. Lymphocytes et les monocytes ont également été confirmées par coloration avec du CD4 et CD8 et CD14. PBMNCs ont été cultivées dans des conditions de culture spécifiques aux macrophages avec ou sans pepsine activé pendant 15 jours. population de monocytes a été identifié d'un côté et les profils de diffusion vers l'avant en cytométrie de flux dans chaque condition. Chaque niveau est comparée à la valeur du jour 8, les cellules en l'absence de pepsine qui ont reçu une valeur arbitraire de «1». Monocytes à la différenciation des macrophages a été examinée par coloration avec des anticorps CD11c et CD163
doi:. 10.1371 /journal.pone.0152336.s001
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