PLOS ONE: Extra-esofágica pepsina del estómago el reflujo Promovido amígdalas Hypertrophy

Extracto

Antecedentes

El reflujo gastroesofágico se asocia con numerosas condiciones patológicas del tracto digestivo superior. pepsina gástrica dentro de reflujo contribuye a las reacciones inmunológicas en la amígdala. En este estudio, que tuvo como objetivo encontrar las relaciones entre la pepsina y la hipertrofia amigdalina.

Métodos y encontrar

Hemos explorado la noción de si hipertrofia amigdalar fue debido al reflujo gástrico pepsina mediada por la hipertrofia de las amígdalas en. Cincuenta y cuatro niños con hipertrofia de las amígdalas y 30 adultos con amigdalitis fueron reclutados antes del tratamiento quirúrgico. sangre y los tejidos de la amígdala de cada paciente se recogieron para el análisis de los cambios en el número de linfocitos y macrófagos, junto con el análisis histológico y bioquímico. La pepsina se expresó en diferentes niveles en los tejidos de las amígdalas de cada una hipertrofia amigdalar. No se encontraron células pepsina positiva en el epitelio de las criptas, que rodea el folículo linfoide con el desarrollo de la fibrosis, y también rodea el folículo linfoide que daba a la cripta. Y también, la tinción de la pepsina fue bien correlacionada con el epitelio dañado amigdalar escamosas y el TGF-β1 y la expresión de iNOS en la sección de amígdalas. Además, la pepsina y el TGF-β1-positivas las células fueron co-localizada con células CD68-positivas en la cripta y centros germinales de los alrededores. En la comparación de la capacidad de respuesta de macrófagos a la pepsina, las células mononucleares de sangre periférica (PBMNCs) eran notablemente más grande en presencia de pepsina activado en el grupo de niños. Por otra parte, CD11c y las células CD163 positivas se incrementaron significativamente por la pepsina activa. Sin embargo, esto no fue visto por la cultura de PBMNCs del grupo de adultos.

Conclusiones

Los linfocitos y monocitos están en un estado altamente proliferativa en la hipertrofia amigdalar y se asocian a una mayor expresión de pro factores-inflamatorio como resultado de la exposición a la pepsina del estómago reflujo

Visto: Kim JH., Jeong SA, Kim KM, Lee YJ, Jung MH, Parque JJ, et al. (2016) extra-esofágica pepsina del estómago el reflujo Promovido amígdalas hipertrofia. PLoS ONE 11 (4): e0152336. doi: 10.1371 /journal.pone.0152336

Editor: Gernot Zissel, UNIVERSITÄTSKLINIKUM Freiburg, Alemania |

Recibido: 5 de Octubre, 2015; Aceptado: 11 de marzo de 2016; Publicado: 8 Abril 2016

Derechos de Autor © 2016 Kim et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y

Financiación:. Este estudio fue apoyado por el Programa de Investigación básica Ciencia, a través de la Fundación de Investigación Nacional de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Ciencia, TIC, y planificación de futuro (2013R1A1A1012542). Este estudio fue apoyado además por el Programa de Reclutamiento Instituto de Investigación exterior Principales, a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología (MEST) (2012K1A4A3053142)). Este trabajo fue apoyado por el fondo de instituto de investigación biomedcal (GNUHBIF-2.014-0009) del Hospital Universitario Nacional de Gyeongsang. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

amígdalas hipertrofia es actualmente la causa más frecuente de la amigdalectomía. La ampliación de las amígdalas se produce debido a un aumento absoluto en el número total de linfocitos en el tejido y que resulta en un aumento de volumen de tejido. [1, 2] El mecanismo exacto por el cual la estimulación y la proliferación de linfocitos se produce aún no se ha determinado. Se ha deducido que la estimulación antigénica de los linfocitos de tejido conduce a un aumento en el número y la actividad linfocítica. Los intentos anteriores de la identificación de los mecanismos fisiopatológicos han centrado en los cambios microbiológicos e inmunológicos en las amígdalas. Muchos estudios han informado de un posible papel de organismos bacterianos en la patogénesis de la hipertrofia de las amígdalas. [3-5] Sin embargo, un aumento en el número absoluto de linfocitos en las amígdalas sin una infección clínica se demostró anteriormente [2], y los antígenos específicos responsables para que estos cambios no han sido identificados.

la investigación reciente ha analizado la relación entre la enfermedad de reflujo extraesofágico y los trastornos de las vías respiratorias superiores. La sinusitis crónica [6], otitis media con efusión [7-9] y los trastornos de la laringe han sido estudiados con posibles vínculos a etiológicos extraesofágicas reflujo. [10, 11] el reflujo gástrico contiene enzimas (pepsina y HCl), así como duodeno-pancreático enzimas (ácidos biliares y tripsina). El papel de la pepsina en el jugo gástrico como parte de del reflujo y la interacción con los sistemas de otorrinolaringología y en los órganos otorrinolaringológicos (oído, nariz y garganta) se ha estudiado ampliamente. [1, 10, 11]

La pepsina es una enzima convierte de pepsinógeno, que se produce por el jefe de células del estómago, y juega un papel importante en la digestión. Normalmente, la pepsina se encuentra solamente en el contenido del estómago. Sin embargo, si se produce reflujo extraesofágico, el contenido del estómago a partir de la de reflujo puede llegar a la laringofaringe, y la pepsina como parte del reflujo estómago se puede detectar en las zonas laringofaríngeos. Este es de hecho el caso como Johnston et al. [12] informaron de que la pepsina se detectó en la mucosa de las vías respiratorias superior e induce un ciclo de citoquinas proinflamatorias, lo que resulta en el daño inflamatorio en la mucosa de la laringe. Estos datos han sugerido un papel para la pepsina se sometió a reflujo en la ruptura de los mecanismos de defensa inmune en la mucosa o revestimientos epiteliales y promoción de los agentes que causan la inflamación. [12-15]

Del mismo modo para la amígdala, la hipótesis de que los gástrica pepsina dentro de reflujo tiene un papel clave en su reacción inmunológica de las amígdalas y de la pepsina que la exposición induce la hipertrofia de las amígdalas. En este estudio, que tuvo como objetivo encontrar la relación entre la pepsina gástrica e hipertrofia amigdalina.

Materiales y Métodos

Ética declaración

Este estudio fue aprobado por el Hospital de la Universidad Nacional de Gyeongsang Junta de Revisión institucional (# GNUHIRB-2014-02-006). El consentimiento informado por escrito se obtuvo de los todos los pacientes (o padres) antes de su inclusión en el estudio.

Los sujetos del estudio

Este estudio se realizó en 84 pacientes con el diagnóstico clínico de la hipertrofia amigdalina. Ellos visitan nuestro hospital para la extracción de las amígdalas porque sufren de inflamación crónica en las amígdalas o los ronquidos /apnea del sueño debido al agrandamiento de las amígdalas. Todos los pacientes fueron sometidos a un examen físico para confirmar el diagnóstico de la hipertrofia de las amígdalas o amigdalitis crónica. El tamaño medio de las amígdalas fue de grado 2,5 en el grupo de las amígdalas y la hipertrofia de grado 1,0 en el grupo de la amigdalitis crónica. (Tabla 1). Se obtuvieron los tejidos de las amígdalas de 54 niños antes de su tratamiento quirúrgico (41 niños y 13 niñas, con edades de 4-16 años, edad media de 8 años) y de 30 adultos (17 hombres y 13 mujeres, con edades 17 y más, entendemos edad 29 años). Los pacientes con trastornos sistémicos y otros problemas clínicos no se incluyeron en este estudio. Toda la amigdalectomía se realizó bajo anestesia general, utilizando el método de disección y se seleccionó parte inferior de la amígdala para tomar muestras de tejido. Ninguno tuvo ninguna complicación postoperatoria

preparación de proteínas y análisis de inmunotransferencia

extractos de tejido de las amígdalas se prepararon como sigue:. Amígdalas se eliminaron y se homogeneizaron en tampón de lisis compuesta de PBS (pH 7,4), 1 % de Triton X-100, EDTA 1 mM que contenía 10 leupeptina mu M y 200 M de fluoruro de fenilmetilsulfonilo. Los lisados ​​se sometieron a sonicación varias veces durante 3 a 5 minutos cada uno y se centrifugaron a 12.000 rpm durante 20 min a 4 ° C. Los sobrenadantes se recogieron y se determinó la concentración de proteínas de cada lisado usando un kit de ensayo de proteínas de ácido bicinconínico (BCA) (Pierce, Rockford IL, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. albúmina de suero bovina se utilizó como un estándar. Igual cantidad de proteínas (50 g) se cargaron en un gel de poliacrilamida al 10% de dodecilsulfato de sodio (SDS). Después de la electroforesis, las proteínas en el gel se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania). Las membranas se bloquearon con 5% de leche no grasa en solución salina tamponada con Tris que contenía 0,1% de Tween-20. Las transferencias se sondearon con anticuerpos primarios policlonales anti-pepsina A (sc-99081, Santa Cruz Biotechnology CA, EE.UU.) a 4 ° C durante la noche. Como control de carga, manchas de transferencia se volvieron a sondar con el anticuerpo anti-β-actina (Sigma, St. Louis MO, EE.UU.). El anticuerpo primario fue visualizado utilizando anticuerpos secundarios (rábano picante de IgG de cabra anti-conejo conjugado con peroxidasa, 1: 10.000; Pierce) con un kit ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway NJ, EE.UU.)

La inmunohistoquímica
.

la inmunotinción se realizó en 5 mm de espesor secciones coronales de secciones paraformaldehído fija y embebidos en parafina utilizando los kits de peroxidasa complejo avidina-biotina-rábano picante (ABC; vector Laboratories, Burlingame CA, EE.UU.). Después de la desparafinación en xileno, se rehidrataron las secciones con etanol. Después de lavar en PBS, las secciones se bloquearon con suero de cabra normal al 1% y después se trataron con un anticuerpo anti-pepsina A (sc-99081, Santa Cruz), iNOS, TGF-β1, y los anticuerpos CD68 adquirido de Santa Cruz Biotechnology a 4 ° C durante la noche en una cámara humidificada. Después de lavar en PBS, se incubaron durante 90 min a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario (Santa Cruz Biotechnology, conjugado con biotina anti-inmunoglobulina de conejo G, 1: 200). Finalmente, las secciones fueron incubadas con ABC durante 60 minutos a temperatura ambiente, se enjuagaron en PBS, y luego desarrollados con 0,027% tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobencidina (Sigma) con peróxido de hidrógeno 0,003%. Las secciones se counterstained con hematoxilina (Sigma).

inmunofluorescencia doble tinción

Para caracterizar las células pepsina A-positivas, doble inmunofluorescencia se realizó en los tejidos de las amígdalas. Se realizaron desparafinación y la recuperación de antígenos. La unión de anticuerpo no específica se bloqueó en PBS con 0,1% de suero normal de burro (Vector Laboratories) y 0,3% de Triton X-100 (Sigma) durante 45 min. Las secciones fueron incubadas con anti-pepsina Un anticuerpo (1: 100; sc-99081, Santa Cruz) diluido en PBS que contiene 0,1% de albúmina de suero bovino (Sigma) a 4 ° C durante la noche. Después de enjuagar, burro conjugado con Cy3 anti-IgG de conejo secundaria de anticuerpos (1: 100; EMD Millipore, Billerica MA, EE.UU.) se aplicó durante 1 hora a temperatura ambiente. Para el doble etiquetado, después de bloquear en PBS que contenía 10% de suero normal de cabra y 0.3% de Triton X-100, las secciones se incubaron con anti-CD68 (1: 100; Santa Cruz) a 4 ° C durante la noche. anticuerpo conjugado con Alexa488 anti-IgG de ratón secundario (1: 100; Invitrogen, Carlsbad CA, EE.UU.) se aplica entonces durante 1 hora a temperatura ambiente. Las secciones fueron montadas con una solución de anti-decoloración que contiene 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Vector Laboratories), y se observaron bajo un microscopio de fluorescencia (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Alemania). Para caracterizar las células CD68-positivo, se realizó inmunofluorescencia doble, como se describe anteriormente. Para el doble etiquetado, anti-TGF-β1 (1: 100; Santa Cruz) y anti-iNOS (1: 100; Santa Cruz) se aplicaron a continuación, burro conjugado con Cy3 anti-IgG de conejo secundaria de anticuerpos (1: 100; EMD Millipore ) en las secciones de CD68-manchado.

inversa de la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR)

ARN total fue extraído a partir de tejidos de amígdalas utilizando el método de TRIzol de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante ( Gibco, Grand Island, NY). Cantidades iguales (5 ug) de ARN total libre de ADN de cada muestra se convirtieron en cDNA utilizando 200 U de superíndice II RT (GIBCO, Grand Island, NY) en un volumen de reacción de 20 l. La transcripción inversa se realizó a 22 ° C durante 10 min, a 42 ° C durante 45 min, y a 95 ° C durante 5 min. Los productos de reacción (2,0 l) se sometieron a amplificación por PCR (Promega, Madison, WI, EE.UU.) en un volumen de reacción de 50 l. Cada secuencias de los cebadores fueron los siguientes: IL-1β (189 pb), 5'-TCATTGCTCAAGTGTCTGAAGC-3 '(sentido) y 5'-TGGTCGGAGATTCGTAGC-3' (antisentido); IL-6 (628 bp), 5'-ATGAACTCCTTCTCCACAAGCGC-3 '(sentido) y 5'-GAAGAGCCCTCAGGCTGGACTG-3' (antisentido); TNF-β (443 pb), 5'-AGTGACAAGCCTGTAGCCC-3 '(sentido) y 5'-GCAATGATCCCAAAGTAGACC-3' (antisentido). PCR se realizó utilizando el ciclador térmico de BioRad de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Volúmenes iguales de los productos de amplificación fueron analizados por electroforesis en 1.5% de gel de agarosa con 0,5 mg /ml de tinción con bromuro de etidio.

análisis citométrico de flujo y in vitro
cultivo

todas las muestras de sangre fueron procesadas dentro de 2 horas después de tomar la sangre. células mononucleares de sangre periférica (PBMNCs) se aislaron por centrifugación en gradiente de densidad sobre un gradiente de Ficoll (Sigma, St. Louis MO, EE.UU.) durante 25 min a 2300 rpm y se lavaron tres veces en PBS. PBMNCs en 1 × 10 ^{5 células fueron analizadas por citometría de flujo. Ya sea que la pepsina está involucrado en monocitos de diferenciación de los macrófagos, las células restantes se sembraron en placas de cultivo en presencia /o ausencia de pepsina activa (Thermo Scientific, Rockford IL, EE.UU.), que contiene las condiciones de cultivo de monocitos. Para identificar el nivel de población de macrófagos, después de 8 y 15 días, se recogieron las células y se analizaron por citometría de flujo usando el anticuerpo para CD11c y CD163. Todos los cultivos celulares se mantuvieron a 37 ° C con 5% de CO2 en una atmósfera húmeda.}

La viabilidad celular
células

RAW264.7, línea celular similar a macrófagos de ratón, se cultivaron _{para investigar el efecto de la pepsina sobre la proliferación de los macrófagos. Las células fueron tratadas en diversas concentraciones de pepsina (0,01-5 mg /ml) y la viabilidad celular fue examinado por CCK-8 kit (Cell Counting Kit-8, Dojindo Molecular Tech. Inc., Rockville, MD, EE.UU.). La viabilidad celular en cada concentración se representa como factor de cambio. Los cambios veces se calculan como la relación entre el valor final en el cada presencia de pepsina para el valor en ausencia de pepsina (establecen como "1"). Los valores se representan como la media ± SEM. * P Hotel < 0,05 frente a la correspondiente ausencia de pepsina (0 g /ml).}

in vitro
la migración de ensayo

Un modelo estándar de heridas monocapa cero se utilizó para caracterizar la capacidad de respuesta de macrófagos a la pepsina. células RAW264.7 se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos, cultivadas a confluencia, y las monocapas fueron heridos por el rascado lo largo de la superficie del plástico de cultivo de tejidos con una cuchilla de afeitar. La hoja se presiona hacia abajo en el centro del plato, cortando de esta manera la capa de células y de forma concomitante que marca el "límite de la herida" en el plástico subyacente. A continuación, la cuchilla se desliza suavemente unidireccionalmente para eliminar medio de la capa de células confluente. El "monocapa heridos" se lavó dos veces con solución salina tamponada con fosfato pH 7,4 (PBS), re-alimentaron con medio privadas de suero que contiene mitomicina-1 mM, y se incubó bajo condiciones de cultivo estándar durante 24 horas.

Estadística El análisis

Todos los datos se presentan como media ± SEM Las comparaciones entre grupos se analizaron por t
prueba de dos colas. Los valores de probabilidad ( P
) < 0,05 se consideraron significativos.

Resultados

La pepsina se expresó en la amígdala

Los datos de inmunotransferencia mostraron que la proteína de la pepsina se expresó como una sola banda a partir de extractos tanto de la amígdala de los pacientes con la hipertrofia de las amígdalas. La pepsina fue altamente expresado como múltiples bandas en el control positivo de extractos de tejido de estómago. Prácticamente no se observó tinción de pepsina en otros tejidos incluyendo tumor, los ganglios linfáticos (LN), tiroides (Thy), glándula parótida (parótida g.), Glándula salivar (SG) (Fig 1A). Todos los tejidos de la amígdala mostraron una señal positiva para la pepsina (Fig 1B). Sin embargo, los niveles de detección de pepsina en la amígdala fueron ligeramente diferentes en cada paciente (Fig 1B). La tinción inmunohistoquímica se realizó para identificar las células pepsina-positivas en el tejido de las amígdalas. células pepsina positiva se encuentran selectivamente en la superficie del epitelio debajo, principalmente localizado en la cripta (Fig 1C-a y b), que rodea los centros germinales más negativos (Fig 1C-C y D), y también rodea el folículo linfoide con excesiva el desarrollo de fibrosis (Fig 1C-e y f). secciones de estómago utilizadas como control positivo mostró un patrón típico de tinción de la pepsina, predominantemente en las células glandulares (Fig 2D-a), pero no en el ganglio linfático (Fig 1D-b) y tiroides (Fig 1D-c).

se detectaron las células pepsina positivo en la amígdala dañada epitelio escamoso

para confirmar la relación con las amígdalas daños epitelio escamoso y el reflujo, tratamos de encontrar células pepsina-positivas en el epitelio de las amígdalas o heridos intacta arquitectura. Dañado epitelio escamoso, irregular o roto, se encontró que los problemas de amígdalas con hipertrofia amigdalar (figura 2A y 2D, más adelante). Se detectaron células pepsina positiva en los sitios lesionados (derecha insertan en la figura 2A, 2D, 2E y 2F) en comparación con el epitelio normal (a la izquierda de inserción en la figura 2A y 2B). En particular, las señales se encontraron fuertemente alrededor de hendiduras y dañados amígdala epitelio escamoso (líneas de trazos en la figura 2C y 2E).
Se detectaron células

TGF-beta 1 y iNOS-positivas en la amígdala de los pacientes con hipertrofia de las amígdalas

tinción inmunohistoquímica para TGF-β1 y iNOS se realizó para investigar la relación entre la tinción de la pepsina y la inflamación. Ambas señales de TGF-beta 1 y iNOS-positivos también fueron detectados en regiones similares a las manchas pepsina, como en el epitelio de las criptas (Fig 3A y 3B), que rodea los centros germinales (figura 3C y 3D), y rodea el folículo linfoide con excesiva la fibrosis en desarrollo (figura 3E y 3F).

pepsina y TGF-β1 se detectaron en las células CD68-positivas en el tejido de las amígdalas hipertrofia

Tal como se describe en la introducción, la hipótesis de que la tinción de pepsina en el amígdala se origina en el estómago y puede estar relacionado con la inflamación amígdalas. Doble tinción de inmunofluorescencia para CD68 se realizó para caracterizar las células pepsina-positivo. CD68 es una glicoproteína transmembrana de 110 Kd y un marcador de representante de los monocitos humanos y macrófagos tisulares implicados en la inflamación. células CD68-positivas se observaron claramente en la amígdala con la hipertrofia de las amígdalas (figura 4). Es de destacar que las células CD68-positivas firmemente colocalized con pepsina y las células TGF-β1-positivos tanto en la cripta (figura 4A) y los centros germinales de los alrededores (figura 4B). En contraste con colocalización de pepsina y CD68, la pepsina no co-localizar con los linfocitos B (CD20 positiva) en los centros foliculares y linfocitos T (CD45) en las regiones interfollicular (Fig 4C). Estos datos, así como la que se muestra en la Figura 3 sugirieron que la tinción pepsina podría estar relacionado con las respuestas inflamatorias en la amígdala de los pacientes con hipertrofia de las amígdalas. Y también, para revelar el principal mecanismo de la lesión de las amígdalas por mediadores inflamatorios mediados por las células blancas incluyendo PBMNCs y macrófagos, para los niveles de amigdalina IL-6, IL-1β y TNF-α mRNA fueron examinados por RT-PCR (Fig 4D). Curiosamente, todos ellos se expresaron los problemas de amígdalas con hipertrofia amigdalar. Estos datos sugieren que el principal mecanismo de la hipertrofia amigdalina podría ser causada por mediadores inflamatorios.

pepsina condujo a los monocitos de los pacientes derivados para diferenciar a los macrófagos

Para confirmar la relación de tinción pepsina y macrófagos, cultivamos células mononucleares de sangre periférica (PBMNCs) de pacientes hipertróficas amígdalas en medio de cultivo de macrófagos (en presencia o ausencia de pepsina activado) durante 15 días. Se determinó, además, los niveles de población de monocitos, y se analizaron fenotipo de macrófagos por citometría de flujo. Los macrófagos humanos son producidos por la diferenciación de los monocitos en los tejidos. Desempeñan un papel fundamental en la defensa no específica (inmunidad innata), y también ayudan a iniciar mecanismos de defensa específicos (inmunidad adaptativa) por el reclutamiento de otras células inmunes tales como linfocitos. Pueden ser identificados mediante citometría de flujo por su expresión específica de las proteínas como marcadores CD incluyendo CD11c y CD163. La población de monocitos inferidos de un lado de flujo y dispersión hacia adelante (Fig 5A) fue significativamente mayor en presencia de pepsina activado (aPepsin), en comparación con ningún aumento en el día 8, y ningún aumento significativo en el día 15 (Fig 5B). Además, se determinó la monocitos de diferenciación de los macrófagos utilizando anticuerpos CD11c y CD163. Las células CD11c y CD163 positivas aumentaron significativamente con los aPepsin en el día 8 después del cultivo. No se encontró significación en otras condiciones (Fig 5C). Sin embargo, la población de monocitos no fue significativa y también los niveles de CD11c y CD163 en el grupo de adultos tanto en el día 8 y 15. Estos datos sugieren que la pepsina es potencialmente implicadas en la diferenciación de los macrófagos y los niños con el aumento de reflujo del estómago puede estar más expuesta a los efectos de una entorno de la pepsina que los adultos.

pepsina inducida por la viabilidad de los macrófagos y la migración

también se investigó si la pepsina participó en función de los macrófagos. las células RAW264.7 se cultivaron en presencia o ausencia de pepsina activado durante 24 horas. Hubo un aumento dependiente de la dosis significativa de la viabilidad celular RAW264.7 por la pepsina (Fig 6A). La migración de las células RAW264.7 también fue inducida por la pepsina, tanto en la herida cero y transwell ensayos de migración del sistema (figura 6B y 6C).

Discusión

Este estudio mostró por primera vez que la pepsina se detectó en el células de las amígdalas hipertróficas y pepsina-positiva se localizaron en el epitelio de las criptas que rodean el centro germinal, y en el folículo linfoide con excesiva aspecto fibrótico en desarrollo. En particular, la tinción de la pepsina se correlacionó con la expresión de los factores relacionados con la inflamación, y la pepsina y CD68 colocalized, y la pepsina activado dio lugar a la diferenciación de los monocitos a macrófagos. [16] Estos hallazgos apuntan a potencialmente nuevos mecanismos fisiopatológicos hipertrofia amigdalina subyacente.

la intensa inflamación es un factor de riesgo conocido para la hipertrofia de las amígdalas. [17] mediadores TGF-β1 e iNOS se conocen de la inflamación. [18-20] en amígdalas hipertróficas, el aumento en el recuento de células T y B mostraron una correlación positiva con bacteriana recuentos y tamaño de las amígdalas. [21, 22] En los estudios epidemiológicos, el tabaquismo, alergias e infecciones respiratorias recurrentes podrían asociar con transitoria o hipertrofia permanente de tejido linfoide. [22, 23] parámetros inmunológicos, la predisposición genética y la disfunción de linfocitos locales parecen jugar un papel en la etiología de la amigdalitis recurrente y la hipertrofia de las amígdalas. [22, 24] Algunos estudios demostraron que la hipertrofia amigdalina se asoció con un aumento de tamaño linfoide folículo, pero no el número de folículos [25], y también se relaciona con el aumento de peso de las amígdalas, el aumento de folículo diámetro, el área y el número. [26]

estímulos recurrentes por agentes patógenos, durante el proceso inflamatorio, conducen a la activación de monocitos y macrófagos. [27] las citocinas secretadas por los macrófagos estimulan a las células inmunes, y también causan proliferación de las células endoteliales y fibroblastos. [28] con el tiempo, un tejido inmunológicamente activo se sustituye por tejido fibrótico. [28] En este estudio, se supone que el antígeno se pepsina y nos planteó dos hipótesis para explicar la observación de la hipertrofia amigdalina con reflujo gástrico (Fig 7). Un mecanismo podría ser la estimulación directa de los linfocitos por pepsina de el reflujo que se reconocen como antigénico. Otro posible mecanismo implica lesión inducida por pepsina al epitelio en las criptas amigdalina, lo que resulta en criptitis de bacterias residentes con la estimulación antigénica continua del epitelio de las criptas especializada. Estos darían lugar a un aumento en el número de linfocitos y pueden desempeñar un papel en la hipertrofia amigdalina.

Inicialmente pepsina entra en contacto con el epitelio y es presentado a los linfocitos intraepiteliales, los linfocitos, los linfocitos subepiteliales interfollicular y intrafoliculares , en ese orden. Los linfocitos entonces proliferan en respuesta a la pepsina que actúa como un antígeno, haciendo que los folículos amigdalina para agrandar y los tejidos de la amígdala a someterse a la hipertrofia. Alternativamente, los macrófagos de tejido de amígdala-reconocen la pepsina reflujo mediada en su superficie celular como un cuerpo extraño y se activan. activación de los macrófagos provoca la secreción de citocinas pro-inflamatorias, y estas citoquinas inducen inflamación, así como la activación de linfocitos adicional, que dan como resultado la hipertrofia amigdalina. Esta última hipótesis parece tener más apoyo que el anterior ya que, como se muestra en la figura 4, se colocalized células pepsina y CD68-positivo por debajo de la superficie del epitelio situado en la cripta (Fig 4A) y también rodea el folículo linfoide con excesiva fibrosis subsiguiente (Fig 4B). Sin embargo, poca correlación con pepsina y CD20 y CD45, como marcadores de células B y T, respectivamente, se observó en el tejido de las amígdalas (Figura 4C).

También se evaluó la expresión de CD163 de la cultura PBMNCs con hipertrofia amigdalar . CD163 se expresa sólo por los macrófagos maduros, pero ausente en los monocitos. Hemos cultivado PBMNCs de 8 y 15 días en presencia de 10% de FCS y 10 ng /ml de M-CSF, siguiendo condiciones estándar para el cultivo de macrófagos humanos. Resultados de in vitro
PBMNCs en estudios de cultivo mostraron que en el grupo de niño, el número de células CD163 positivas fueron significativamente mayores en presencia de pepsina activado como células CD11c positivas también. En comparación, no hubo diferencia en la expresión de CD11c y CD163 de la cultura de PBMNCs de los adultos (S1 FIG). Estos datos sugirieron que una reacción CMSP a la pepsina activa en los niños podría ser más sensible que en los adultos. Aunque no podemos explicar por qué mecanismo pepsina inducida está implicado en la diferenciación de los macrófagos, no podemos descartar que la propia diferenciación de los macrófagos podría acelerar el daño de las amígdalas reflujo mediada.

De acuerdo con el estudio actual, el reflujo pepsina mediada no sólo causan daño directo al epitelio amigdalina, sino que también estimula los macrófagos de las amígdalas o células epiteliales de las amígdalas para secretar citoquinas /quimioquinas que atrajeron y activan las células inmunes mediadas que algunos de los daños a la mucosa de las amígdalas. inflamación microscópica, caracterizado por TGF-β1 y la expresión de iNOS en el tejido de las amígdalas (epitelio de las criptas, que rodea el centro germinal, y el folículo linfoide con el desarrollo excesivo aspecto fibrótico), se observa en los pacientes con síntomas graves (datos no mostrados). Esto implica que la pepsina (y ácido) la producción inducida de IL-8 y otros mediadores inflamatorios por del reflujo promover la migración y activación de leucocitos de sangre periférica. [14] Estos resultados corroboran la hipótesis de que un mecanismo mediada por citoquinas es responsable de la lesión de la amígdala en niños con hipertrofia amigdalar. La mucosa de pacientes con hipertrofia amigdalar produce significativamente grandes cantidades de diversas citoquinas. [29, 30] Estos mediadores inflamatorios activar el reclutamiento de células inmunes y la migración a los sitios de interacción y el reflujo puede estar implicada en la fisiopatología de la hipertrofia de las amígdalas.

con base en los hallazgos de la literatura y nuestros resultados en este estudio, proponemos que la activación local y sistémica de las vías inflamatorias promoverá la infiltración de linfocitos y la proliferación (incluyendo las células T), junto con la diferenciación y la proliferación de los macrófagos que produce hipertrofia amigdalar de la mayor el número de células linfocitarias y monocítica. Si los resultados actuales demuestran ser exactos, pueden proporcionar un objetivo viable para el desarrollo de enfoques de intervención para el tratamiento o la prevención de la hipertrofia de las amígdalas en los niños. A pesar de la considerable evidencia de mediadores inflamatorios y la proliferación de linfocitos en la patogénesis de la hipertrofia de las amígdalas, la interacción entre la hipersensibilidad a reflujo la pepsina y la inflamación de las amígdalas sigue siendo poco claro en este estudio. Se necesitan más estudios para comprender mejor las vías de señalización implicadas en la génesis de los síntomas de reflujo y la inflamación y para identificar, junto con el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos.

Conclusiones

establecieron que los linfocitos y monocitos están en un estado altamente proliferativo en las amígdalas con hipertrofia amigdalina y asociado con un aumento de la expresión de factores pro-inflamatorias como resultado de la exposición a la pepsina reflujo gástrico. Estos resultados apuntan a potencialmente nuevos mecanismos fisiopatológicos subyacentes hipertrofia amigdalar. Desde nuestros in vitro
datos, se establece que puede haber la posibilidad de caracterización objetiva de los mecanismos implicados con el fin de desarrollar tratamientos específicos para esta indicación de la enfermedad. Nuestros datos sugieren que los mecanismos subyacentes a la proliferación de tejido linfoide en la hipertrofia amigdalina son distintos y pueden permitir intervenciones terapéuticas no quirúrgicas futuras orientación pepsina que puede obviar la necesidad de una amigdalectomía, y que conduce a la involución de las amígdalas hipertróficas.

Apoyo a la Información
S1 Fig. Análisis citométrico de flujo población de monocitos y la diferenciación de monocitos de PBMNCs de adultos con amigdalitis crónica.
Linfocitos y monocitos se identificaron con el lado y dispersión hacia adelante. Los linfocitos y monocitos también se confirmaron mediante tinción con CD4 y CD8 y anticuerpos CD14. PBMNCs se cultivaron en condiciones de cultivo específico de macrófagos con o sin pepsina activado durante 15 días. Los monocitos población se identificó de un lado y los perfiles de dispersión frontal en citometría de flujo en cada condición. Cada nivel se compara con el valor de 8 celdas de día en ausencia de pepsina que se les dio un valor arbitrario de "1". Monocitos de diferenciación de los macrófagos se examinó mediante la tinción con anticuerpos CD11c y CD163
doi:. 10.1371 /journal.pone.0152336.s001 gratis (TIF)

• PLOS ONE: Mezcla geométrica, peristaltismo, y la fase geométrica del estómago
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